Os autores gostariam de agradecer Byoung-Chul Lee, Philip Choi e Samuel Ho para a assistência valiosa. Este trabalho foi realizado na Fundição Molecular do Lawrence Berkeley National Laboratory, que é apoiado pelo Escritório de Escritório Science, de ciências básicas da energia, do Departamento de Energia dos EUA no âmbito do contrato n º DE-AC02-05CH11231 e Redução de Ameaça de Defesa Agência nos termos do Contrato n º: IACRO-B0845281.

1. Solid-Phase Synthesis Submonomer de Polypeptoids Síntese em fase sólida (SPS) é uma técnica comum usada para sintetizar sequências específicas de biopolímeros passo a passo, diretamente sobre um suporte sólido inerte, tal como uma resina polimérica talão. Altos rendimentos de acoplamento e facilidade de remoção dos reagentes em excesso são grandes vantagens da SPS. Depois de uma reação de acoplamento à resina, reagentes em excesso são simplesmente drenado e as contas são lavadas para estar pronto para a fase seguinte da reacção. Após a reação de síntese final, os oligômeros de longa-metragem são clivadas a partir da resina eo material solução de fase pode ser mais bem estudadas. Aqui, adaptar o procedimento SPS para gerar polímeros seqüência específica peptoid. <ol><li> Setup: Todas as etapas da síntese peptoid manual pode ser realizada em um de polipropileno, descartáveis ​​(PP) cartucho poroso ou um vaso de reação fritted de vidro equipado com uma torneira de 3 vias. Realizar todas as operações em uma capela. Para as incubações na gnavio lass ou cartucho plástico, conectar um braço a uma fonte de nitrogênio para gentilmente bolha a solução para a mistura correta. Alternativamente, para incubações reação no cartucho descartável, selo ambas as extremidades do cartucho com tampas e coloque em um agitador rotativo. Para drenar misturas de reacção ou lavagens, ligue para a casa de vácuo através de um sifão. O navio deve ser poroso com uma frita grosseira. Siliconize o reactor de vidro para evitar contas de degola para as paredes do recipiente de vidro. Prepare uma solução de 5% em dichlorodimethylsilane dicloroetano (v / v). Encher um recipiente de reação limpa e seca para a parte superior com solução siliconização, deixe descansar por 30 minutos, depois escorra. Lavar o vaso uma vez com DCE e depois uma vez com metanol. A solução siliconização pode ser reutilizado, por isso deve ser salvo. Ou ar seco ou sacudir qualquer excesso de solução e asse o vidro até secar após a remoção da torneira. Vaso de reação esfriar antes de adicionar resina. </li><li> Adicionar 100 mg (0,06 mmol) de re amida Rinkpecado a um recipiente de reação fritted. Swell a resina, adicionando 2 mL de dimetilformamida (DMF). Agitar, por agitação ou borbulhamento por 10 minutos. Escorra a solução de vácuo para isolar a resina incharam. </li><li> Adicionar 1 mL de 20% 4-methylpiperidine em DMF (v / v) para desproteger o grupo Fmoc. Agitar por 2 minutos e escorra. Repita com uma incubação de 12 minutos. </li><li> Enxágüe da resina adicionando 2 mL de DMF, agitando por 15 segundos, e drenagem. 3x. </li><li> Bromoacetylation: Adicionar 1 mL de 0,6 M bromoacetic ácido (0,6 mmol) em DMF e 86 mL de N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (0,93 equivalente, 0,56 mmol). Incube com borbulhar suave durante 30 minutos, depois escorra e lave com 2 mL de DMF (repita 4x). </li><li> Deslocamento: Adicionar 1 mL de 1-2 M de amina na N-methylpyrrolidinone. Incube com borbulhando para 30-120 minutos, depois escorra e lave com DMF (2 mL 4x). </li><li> Continuar a crescer a cadeia peptoid, repetindo o ciclo submonomer, passos 1.5 (bromoacetylation) e 1.6 (displacement). </li></ol><ol start="8"><li> Após o deslocamento final é feito, lavar com 2 mL de DMF (repeat 4x), em seguida, 2 mL de diclorometano (3x). Cap e armazenar o reactor até clivagem. </li><li> Pausa na síntese (opcional): Para fazer uma pausa durante uma síntese peptoid, terminar a reação de deslocamento e avance para o passo 1.8. Para continuar crescendo a cadeia peptoid, reinicie a síntese de re-inchaço da resina seca (passo 1.2) e repetindo o ciclo submonomer (passo 1.5 e 1.6). A resina pode ser secos e armazenados após qualquer deslocamento, exceto o deslocamento segundo porque o conjugado de resina peptoid-pode formar um produto cíclico diketopiperazine lado. </li><li> Para várias sínteses simultâneas, uma em fase sólida colector de vácuo extração é recomendada para maximizar a eficiência. Síntese Peptoid também pode ser automatizada por métodos de programação propriamente nos sintetizadores peptídeo disponíveis comercialmente, como a Apex Aapptec 396, sintetizador de microondas CEM Liberdade e Techno Proteinlogias sintetizador Prelude Inc.. </li></ol> 2. Clivagem e Side-Chain desproteção <ol><li> Transferir todas as resinas secas em um frasco de vidro de cintilação 20 mL. </li><li> Trabalhando dentro de um capuz e com equipamentos de protecção individual adequado, adicionar 4 mL de ácido trifluoroacético (TFA) cocktail de clivagem 1 (por exemplo, 95% aq. TFA, ver discussão) para o frasco de vidro de cintilação e tampa. Agitar durante 10 minutos a 2 horas à temperatura ambiente (ver discussão). </li><li> Coletar a solução de clivagem TFA, filtrando a resina através de um descartáveis, cartucho PP fritted em um novo, 20 mL frasco de vidro pré-pesados ​​de cintilação. A descartáveis, PP pipeta é conveniente para transferir as soluções cocktail de clivagem. </li><li> Adicionar 1 mL de coquetel de clivagem doce para lavar a resina e recolher qualquer peptoid residual. 2x. </li><li> Evaporar TFA soprando um fluxo suave de nitrogênio ou usando um Biotage V10 evaporador. </li><li> Redissolver o petróleo bruto em 6 mLde acetonitrila / água 1:1 (v / v) para HPLC. Congelar e lyophilize. Repetir. </li><li> Registre o peso do produto cru. Store como um pó seco a -20 ° C </li><li> Clivagem de teste (opcional): A clivagem de teste em 0,5% da resina pode ser realizada para determinar rapidamente a pureza ea massa do peptoid sintetizado e se as condições corretas de clivagem foram escolhidos. Clivagens teste são especialmente úteis para monitorar o progresso da síntese. </li></ol> 3. Caracterização e Purificação da Polypeptoid <ol><li> Através de uma combinação de análise HPLC, electrospray LC-MS, e / ou MALDI-TOF, determinar a pureza do produto bruto e se o peso molecular desejado está presente. </li><li> Prepare uma solução ~ mg / mL 50-10 do pó seco peptoid em água com acetonitrila mínimo, conforme necessário para a solubilidade. Solução clara filtro do produto peptoid bruto com 0,45 mM filtro de seringa para remover a poeira e partículas. </li><li> Analítica HPLC e electrospray LC-MS: Prepare a ~ 20 mg / mL solução peptoid bruto. Filtro com um 200 mL 0,45 mM filtro e injectar 20 mL. </li><li> MALDI: Misture 1 mL de ~ 20 peptoid mg / mL com 1 mL da matriz. Spot 1 mL na placa MALDI e deixar secar ao ar. Matriz e modo de aquisição está dependente da amostra (Fig. 5). </li><li> Purificar a mistura de crude peptoid com fase reversa HPLC prep. Escolha o gradiente e coluna (C4 ou C18) com base na hidrofobicidade de polypeptoid. Combine frações purificadas, congelar e lyophilize, resultando em um pó branco macio. Registre o peso do produto final. </li><li> Formação de HCl sal (opcional): Recolher o pó liofilizado em 100 mM HCl (aq.), com acetonitrila mínimo. Transferência para pré-pesados ​​frasco de vidro. Congelar e re-lyophilize. 2x. Nova pesagem para determinar a massa de pó peptoid. </li></ol> 4. Formação Nanosheet Peptoid Esta seção describes o protocolo para formar folhas de uma única cadeia, seqüência específica, anfifílicos 36-mer peptoid (Fig. 1). Após a vertente peptoid é sintetizado, purificado e liofilizado, como descrito acima, o pó resultante branco é dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque 2 mM. <ol><li> Prepare 500 mL de solução 20 mM peptoid (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,0 em água) num frasco de vidro um dram. Tampão na formação da folha Primeiro, adicione 445 mL de água Milli-Q, 50 mL de tampão 10x folha de formação, e vortex para misturar. Em seguida, adicionar 5 mL de solução estoque 2 mM peptoid e gentilmente solução redemoinho. Tampe o frasco de vidro. </li><li> Folhas são formadas pela agitação suave da solução aquosa diluída peptoid. Lentamente inclinar o frasco de vidro da posição horizontal para a posição vertical resultados em folhas. Suave agitação também produz folhas, no entanto, as folhas tendem a ser menores e com menos arestas retas. Uma análise mais aprofundada do mecanismo de formação da folha é reported separadamente. 2 </li><li> Para muitos de alta qualidade folhas, gire os frascos de vidro sobre o eixo horizontal lentamente (&lt;RPM 1) para um a três dias. Uma meios técnicos RKVSD Rotamix rotador tubo ou um roqueiro personalizado pode executar esta continuamente. </li><li> Diálise de nanofolhas (opcional): Em certas aplicações, pode ser necessário para remover qualquer cadeias livre peptoid ou buffers / sais. Molhe um Float-a-Lyzer 100 kD membrana no buffer desejado por 15 minutos. Carga 500 mL de solução folha peptoid na câmara de amostra. Mergulhe em 500 mL de tampão desejado, mexendo com uma barra de agitação magnética a 60 rpm. Permitir a diálise de folhas para prosseguir por 4 horas. Cada hora de troca, com um estoque fresco de uma solução tampão. </li></ol> 5. Microscopia de fluorescência de nanofolhas <ol><li> Imagens de fluorescência das nanofolhas foram fotografadas com Nile Red, um corante ambientalmente sensíveis, cuja intensidade de fluorescência aumenta quando ela está localizada em hydrophobic ambientes (Fig. 2). </li><li> Adicionar 1 mL de 100 M Nile Red para 100 mL da solução nanosheet para obter uma concentração final de 1 mM de Nilo Vermelho. </li><li> Faça uma solução de agarose 1% em água quente e despeje em uma placa de Petri de plástico. Garantir que a solução de agarose é de aproximadamente 1 / 8 de polegada de espessura e deixe a solução esfriar em repouso sobre uma superfície plana. Após os conjuntos de agarose, use uma espátula para cortar e transferir 1 cm x 1 cm e praças uma lâmina de vidro. </li><li> Para coletar as folhas no mesmo plano, spot 1 mL de solução de folha no pedaço de agarose. Permitir que a agarose para absorver o tampão por 2 minutos, deixando as folhas na superfície. Imagem dentro de 15 minutos, caso contrário o agarose começará a deformar-se devido à desidratação. </li><li> Às folhas de imagem em solução, 15 mL de carga dentro de uma junta de 20 milímetros 0,12 mm de diâmetro sobre uma lâmina de vidro. Cobrir com uma lamela. Se as folhas são simplesmente imprensado entre uma lâmina de vidro e lamínula sem uma junta, muitas folhas will cisalhamento ea evaporação aparentemente menor fará com que as folhas que constantemente se mover. </li><li> Folhas de imagem sob iluminação de epifluorescência (Olympus IX81 por exemplo, um microscópio invertido equipado com um iXonEM Andor + espectros EMCCD com um vermelho Texas filtro). </li></ol> 6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de nanofolhas <ol><li> Plasma etch de substrato de silicone (opcional): O chips de silício são gravadas plasma para auxiliar na adsorção de folhas. Colocar os chips de silício na câmara de vácuo de um aspirador de plasma (por exemplo Harrick Plasma Cleaner / Esterilizador PDC-32G). Bomba de até 200 mTorr e definir a bobina de RF para 18W (alta definição para PDC-32G). Etch por 2 minutos. </li><li> Queda de 20 mL de solução de folha de peptoid sobre um substrato de silício plasma tratado. Deixe descansar por 3 minutos. Retire o excesso de solução com a ponta do Kim-wipe. Pipeta mL 20 de água sobre a superfície e remover o excesso de solução novamente para remover tampão e sais. Repita 4x. </li><li> Alternativamente, disqueyze as soluções folha peptoid contra água para retirar tampão eo sal. Queda de 20 mL de solução de folha de dialisado de plasma em substratos tratados com silício. O ar seco da amostra. </li><li> Folhas de imagem com SEM (por exemplo Zeiss Gémeos Ultra-55 Microscópio Eletrônico de Varredura Analítica) com um detector na lente e no feixe de energias entre 1 kV e 5 kV (Fig. 3). </li></ol> 7. Notas de Segurança: <ol><li> Dimetilformamida e diclorometano são razoavelmente suspeitos carcinógenos. </li><li> N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimide, 4-methylpiperdine e ácido bromoacetic são perigosos para a pele, olhos e trato respiratório. Eles devem ser usados ​​na capa com cuidado. Pode ser tóxico se inalado ou absorvido através da pele, ea exposição pode resultar em sensibilização. Recipientes vazios retêm resíduos do produto (líquido / vapor) e devem ser cuidadosamente lavados antes de removê-los do capô. </li><li> TFA é um ácido forte, e é extremamente destrutivo para o trato respiratório superior, olhos epele. TFA também é volátil-keep soluções concentradas de TFA na capa em todos os momentos, para evitar danos respiratórios. Utilizar EPI adequado e cuidado ao manusear soluções de TFA. Luvas de mudar rapidamente se eles entram em contato com TFA, e imediatamente limpar todos os derramamentos. </li></ol> 8. Resultados representativos: Esta seção descreve a síntese, caracterização e purificação de uma seqüência específica de cadeia peptoid 36-mer que se dobra em um nanosheet altamente ordenada 3 (Fig. 1). O bloco de carga peptoid H-[Nae-NPE] 9 - [NPE-nce] 9-NH 2 foi sintetizado em 100 mg de resina amida Rink. A 2 M de solução de amina foi usado para todas as reações de deslocamento, que foram realizadas por 60 minutos para o resíduo de 18/01 e 120 minutos para o resíduo 19-36. t-butil beta-alanina HCl foi convertido para a base livre (ver discussão), enquanto feniletilamina e boc-etilenodiamina foram ambos usados ​​directly. A resina foi clivado com TFA 95%, triispropylsilane 2,5%, 2,5% de água por 2 horas. TFA foi evaporado eo óleo viscoso resultante (~ 180 mg) foi re-dissolvido em 6 mL de acetonitrila: água 1:1 (v / v). Pureza do produto (Fig. 4) e presença da massa do produto foi confirmada por análise de RP-HPLC (30-80% em acetonitrila gradiente de água, ambos contendo 0,1% (v / v) TFA, em 1 mL / min, durante 30 minutos a 60 ° C com um C18, 5 mm, 50 X coluna mm 2) e MALDI (Fig. 5). Purificação com fase reversa HPLC em uma coluna C18 Vydac (10 mM, 22 mm x 250 mm) procedeu, utilizando um gradiente de 30-60% de acetonitrila em água com TFA 0,1% mais de 60 minutos a 10 mL / min. A coluna foi carregada com 60 mg de produto bruto para cada corrida cromatográfica. As frações purificadas foram combinadas com base na pureza da RP-HPLC analítico (Fig. 4) e liofilizados para produzir ~ 80 mg de um pó branco macio. Purificada peptoid bloco carga molecularde peso foi confirmado por MALDI. 1 mL de 100 M purificada peptoid em acetonitrila: água 1:1 (v / v) foi misturada com 1 mL da matriz (5 mg / mL de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmicos em acetonitrila: água 1:1 v / v e 0,1% TFA) e 1 mL foi visto na placa de MALDI. Após a amostra seca ao ar, foi colocado no 4800 MALDI Applied Biosystem / MDS SCIEX Analyzer TOF / TOF. Os modos de aquisição e processamento foram de baixa massa linear. O peso calculado foi inserido na massa direcionados para ajustar automaticamente para o tempo de atraso. A intensidade do laser foi definido para 3400. A massa observada, 4981,2, corresponde intimamente à massa calculada de 4981,74. O pó liofilizado purificado foi dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque 2 mM, o que pode ser armazenado a 4 ° C. Folhas foram preparados pelo protocolo referido e fotografada com microscopia óptica de fluorescência e SEM (Fig. 2 e 3). Uma variedade de formas com tamanhos recurso que variam até 300 mm, são observados, e notably, bordas retas são proeminentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" /> Figura 1 Seqüência do bloco de carga peptoid H-[Nae-NPE] 9 -. [NPE-nce] 9-NH 2. A única cadeia, taxa de bloco, polypeptoid anfifílicos 36-mer auto-montagem em altamente ordenado, bidimensional nanofolhas 3. O peso molecular é calculada 4.981,74. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens de microscopia de fluorescência nanofolhas peptoid. Folhas foram formadas a partir de uma solução de 20 mM peptoid em 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. As folhas foram fotografadas em agarose com 1 Hm Nilo Vermelho. Barras de escala são 100 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" /> Figura 3. Digitalizando imagens de microscopia eletrônicade nanofolhas peptoid. Folhas foram formadas a partir de uma solução de 20 mM peptoid em 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Barras de escala são 5 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" /> Figura 4 inverter fase analítica HPLC traço de H-[Nae-NPE] 9 -. [Nce-NPE] 9-NH 2. O petróleo bruto e purificado analítica HPLC trace (30-80% no gradiente 1 mL / min, durante 30 minutos a 60 ° C com um C18, 5 mm, 50 x coluna mm 2) do bloco bruto e purificado carga peptoid H-[ Nae-NPE] 9 - [NPE-nce] 9-NH 2 é mostrado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" /> Figura 5 MALDI-TOF espectroscopia de massa traço de H-[Nae-NPE] 9 -. [Nce-NPE] 9-NH 2. A massa observada, 4981,2, está em estreita concordância com a massa calculada, 4981,74.

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	<li>King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cleavage+method+which+minimizes+side+reactions+following+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis.">A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).</li><li>Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaken,+not+stirred:+Collapsing+a+peptoid+monolayer+to+produce+free-floating,+stable+nanosheets.">Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets.</a> J. Am. Chem. Soc. , (2011).</li><li>Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+a+single-chain,+information-rich+polypeptoid+sequence+into+a+highly-ordered+nanosheet.">Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet.</a> Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+multistep+synthesis+of+a+bioactive+peptidomimetic+oligomer+for+the+undergraduate+laboratory.">Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory.</a> J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).</li><li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+peptoids:+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function.">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).</li><li>Zuckermann, R. N., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+as+potential+therapeutics.">Peptoids as potential therapeutics.</a> Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).</li><li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+that+mimic+the+structure,+function+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides.">Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> , 105-2794 (2008).</li><li>Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+method+for+detection+of+amyloidogenic+misfolded+proteins.">A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins.</a> Biochem. 50, 4322-4329 (2011).</li><li>Huang, C. -. Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipitoids+-+novel+cationic+lipids+for+cellular+delivery+of+plasmid+DNA+in+vitro.">Lipitoids - novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro.</a> Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).</li><li>Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Br&#228;se, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoidic+amino-+and+guanidinium-carrier+systems:+Targeted+drug+delivery+into+the+cell+cytosol+or+the+nucleus.">Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li><li>Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+a+biomimetic+diblock+copolypeptoid+into+homochiral+super+helices.">Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).</li><li>Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+ultra-thin+two-dimensional+crystals+from+sequence-specific+peptoid+polymers.">Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers.</a> Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+synthesis+of+artificial+proteins:+The+Discovery+of+an+amphiphilic+helical+peptoid+assembly.">Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly.</a> Chemistry &#38; Biology. 9, 647-654 (2002).</li><li>Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combinatorial+approach+to+the+discovery+of+efficient+cationic+peptoid+reagents+for+gene+delivery.">A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).</li><li>Mora, P. u. i. g., Masip, I. s. a. b. e. l., Cort&#233;s, N. u. r. i. a., Marquina, R. e. g. i. n. a., Merino, R. a. m. &. #. 2. 4. 3. ;. n., Merino, J. e. s. &. #. 2. 5. 0. ;. s., Carbonell, T. e. r. e. s. a., Mingarro, I. s. m. a. e. l., Messeguer, A. n. g. e. l., P&#233;rez-Pay&#225;, E. n. r. i. q. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+from+a+positional+scanning+peptoid+library+of+in+vivo+active+compounds+that+neutralize+bacterial+endotoxins.">Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins.</a> J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).</li><li>Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+nanomolar+ligands+for+7-transmembrane+G-protein+coupled+receptors+from+a+diverse+(N-substituted)glycine+peptoid+Library.">Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library.</a> J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).</li><li>Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coactivator-binding+peptoids+from+a+combinatorial+library.">Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library.</a> Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-(substituted)glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+(&amp;alpha;+peptoids)+and+derivatives.">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&amp;alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis.">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Aplicações e Significado Este protocolo descreve um método simples e eficiente de síntese peptoid eo aquosa auto-montagem do Peptóides em nanofolhas. A maioria dos laboratórios são facilmente capazes de sintetizar Peptóides porque os materiais de baixo custo, conhecimentos básicos e técnicas simples são utilizados 4. Da mesma forma, a auto-montagem de ultra-fina e altamente ordenada nanofolhas se limita a exigir repetidas frasco uma inclinação de uma solução aquosa diluída peptoid 2. Peptóides são promissores materiais para a pesquisa biomédica e nanociência, porque eles são robustos e flexíveis ainda sinteticamente seqüência específica e altamente sintonizável 5. Peptóides demonstraram atividade biológica (6,7 terapêutica, diagnóstico 8, a entrega intracelular 9-10) e dobra em nanoestruturas hierárquico 3, 11-14. Por causa de sua síntese modular, combinatória peptoid librAries 15-19 pode ser facilmente sintetizados e testados para uma ampla série de atividades ou propriedades. Em particular, o nanofolhas servir como uma plataforma potencial para andaimes bidimensional de exibição, miméticos de membrana, sensores biológicos, miméticos de proteínas e fabricação de dispositivos. Com as seqüências praticamente inesgotável diferentes possíveis, o campo da pesquisa peptoid está expandindo rapidamente. Variáveis ​​em fase sólida síntese submonomer de polypeptoids Por causa da possibilidade de escolher entre um alfabeto incrivelmente grande e diversificada de monômeros de 20, o método submonomer precisa de modificações pontuais para casos em que o aumento da eficiência de acoplamento de cada etapa irá melhorar o rendimento global do produto. Incorporação de cadeias laterais desprotegidas heterocíclicos requer o uso de ácido cloroacético em vez de ácido bromoacetic 21. Maior tempo de deslocamento e maiorconcentrações de amina são geralmente empregadas após cerca de 20 engates para longas sequências peptoid ou aminas menos nucleofílico. Aquecimento do recipiente de reação a 35 ° C, usando um recipiente de reação de jaqueta de água, ajuda a conduzir a reação. Para altamente voláteis como aminas isopropilamina, cuidados devem ser tomados para evitar a evaporação. Aminas na forma de um sal de HCl, como HCl beta-alanina t-butil, precisa ser livre baseado antes de ser introduzido na reação de deslocamento. Isto pode ser conseguido através da dissolução ou suspensão do amina em DCM (~ 5g amine/25 mL DCM), e neutralizar com uma solução equimolar de hidróxido de sódio aquoso em um funil de separação. A camada DCM é coletado ea camada aquosa é lavado com DCM adicionais. As camadas DCM combinados são secas sobre sulfato de sódio e filtrada para um balão de fundo pré-pesados ​​rodada. Remover solvente por evaporação rotativa para produzir um óleo, e registrar o peso do produto. During passo a clivagem, TFA cocktail de clivagem e tempo de clivagem é dependente do número e variedade de grupos protetores utilizados. Diretrizes para cocktails de clivagem são semelhantes aos tradicionais clivagens peptídeo desproteção 1. Geralmente, 10 minutos incubações são necessários para seqüências sem proteger grupos ou seqüências com poucos altamente ácido lábil grupos de proteção (por exemplo, BOC, por tritila). Duas horas incubações são recomendados para seqüências com mais difícil proteger os grupos (por exemplo, t-butil éster, Mtr, PBF) ou sequências com muitos grupos de proteção para garantir a desproteção total de cada cadeia. Crude produtos peptoid geralmente se dissolvem em acetonitrila: água 1:1 (v / v), mas maiores proporções de acetonitrila são comuns com cadeias laterais com uma alta hidrofobicidade global.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Dimetilformamida </td><td> EMD </td><td> EM-DX1726P-1 </td><td> 99% + </td></tr><tr><td> N-methylpyrrolidinone </td><td> BDH </td><td> BDH1141-4LP </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Ácido Bromoacetic </td><td> Acros Organics </td><td> 200000-106 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> 4 Methylpiperidine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M73206 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide </td><td> Chem-Impex </td><td> 001100 </td><td> 99,5% </td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> EMD </td><td> EMD-DX0835 </td><td> ACS grau </td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> EMD </td><td> EM-AX0145P-1 </td><td> 99,8% </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T6508 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Triisopropylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 233781 -10G </td><td> Para a clivagem TFA </td></tr><tr><td> 1,2-Dicloroetano </td><td> JT Baker </td><td> JTH076-33 </td><td> Para siliconização de vasos de reacção de vidro </td></tr><tr><td> Fenetilamina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 407267-100ML </td><td> &gt; 99,5% Hydrophobic amina da cadeia lateral </td></tr><tr><td> Boc-etilenodiamina </td><td> CNH Technologies </td><td> C-1112 </td><td> Amina da cadeia lateral catiônicos </td></tr><tr><td> t-butil beta-alanina HCl </td><td> Chem-Impex Internacional </td><td> 04407 </td><td> Amina da cadeia lateral aniônicos </td></tr><tr><td> α-ciano-4-ácido hidroxicinâmicos </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C8982-10X10MG </td><td> Para MALDI matriz </td></tr><tr><td> Nile Red </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 19123-10mg </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> Dichlorodimethylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 80.430-F-500G </td><td> Para siliconização de vasos de reacção de vidro </td></tr><tr><td> Carrinho PP descartáveis ​​frittedcume </td><td> Separações Aplicada </td><td> 2416 </td><td> 6 mL de polipropileno cartucho com 20 milímetros PE fritas </td></tr><tr><td> Descartáveis ​​de 3 vias luer adaptador </td><td> Cole Parmer </td><td> 31200-80 </td><td> Torneira para descartáveis ​​vaso de reação manual de síntese </td></tr><tr><td> Luer Lock Ring </td><td> Cole Parmer </td><td> 45503-19 </td><td> ¼ fitting &quot;para o recipiente de reação manual de síntese descartáveis </td></tr><tr><td> Acessórios Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45500-20 </td><td> ¼ fitting &quot;para o recipiente de reação manual de síntese descartáveis </td></tr><tr><td> Descartáveis ​​PP pipetas </td><td> VWR </td><td> 16001-194 </td><td> Para transferências de TFA </td></tr><tr><td> Luer seringa de plástico bloqueio </td><td> Científica Nacional </td><td> S7515-5 </td><td> 6 seringas mL </td></tr><tr><td> Um frasco de vidro dram </td><td> VWR </td><td> 66011-041 </td><td> Com resinas fenólicas moldado com tampa de rosca de polivinil-faced forro de celulose </td></tr><tr><td> 20 mL Scinfrasco tillation </td><td> VWR </td><td> 66022-060 </td><td> Com tampa de PP em anexo e liner folha de celulose </td></tr><tr><td> Seguro-Seal espaçador adesiva </td><td> Invitrogen </td><td> S-24736 </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 63411 </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> Tampa de deslizamento </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> 4 pastilha de silício &quot; </td><td> Ted Pella </td><td> 16007 </td><td> Pré-dice em fichas milímetros 5x7 </td></tr><tr><td> 0,45 filtro </td><td> VWR, Acrodisc </td><td> 28143-924 </td><td> Para HPLC. Membrana de PTFE </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> BD </td><td> 212272 </td><td> Para fluorescência de imagem </td></tr><tr><td> SPE Manifold a vácuo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 57044 </td><td> Exemplo de múltiplas vácuo SPE </td></tr><tr><td> Vaso poroso de vidro </td><td> Ace vidro </td><td> 6402-12 </td><td> Porosidade Cfrita </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner / Esterilizador </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Exemplo de produto de limpeza de plasma para preparar chips de silício para SEM </td></tr></tbody></table>

solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets

Peptóides são uma nova classe de biomimético, não-natural, seqüência específica heteropolímeros que resistem à proteólise, apresentam atividade biológica potente, e dobre em nanoestruturas de ordem superior. Estruturalmente similares aos peptídeos, Peptóides são poli N-substituído glycines, onde as cadeias laterais estão ligados ao nitrogênio, em vez de o alfa-carbono. Sua facilidade de síntese e diversidade estrutural permite que testes de princípios básicos de design para dirigir de novo desenho e engenharia de novos materiais biologicamente ativos e nanoestruturados. Aqui, um simples manual de protocolo de síntese peptoid é apresentado que permite a síntese de polypeptoids de cadeia longa (até 50mers) em excelentes rendimentos. Apenas equipamentos básicos, técnicas simples (por exemplo, transferência de líquidos, filtração), e reagentes disponíveis no mercado são necessários, fazendo Peptóides uma adição acessível a toolkits muitos pesquisadores. A espinha dorsal peptoid é cultivado um monômero em um tempo via o método submonomer que consiste em um ciclo de duas etapas além de monômero: acilação e deslocamento. Ácido, primeiro bromoacetic ativadas in situ com N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide acylates uma resina-bound amina secundária. Deslocamento, segundo nucleofílica do brometo de uma amina primária segue para introduzir a cadeia lateral. O ciclo de duas etapas é iterado até que o comprimento da cadeia desejado seja alcançado. A eficiência de acoplamento deste ciclo de dois passos rotineiramente excede 98% e permite a síntese de Peptóides enquanto 50 resíduos. Altamente sintonizável, precisa e quimicamente seqüências diversas são realizáveis ​​com o método submonomer como centenas de aminas primárias prontamente disponíveis pode ser diretamente incorporadas. Peptóides estão emergindo como um material versátil biomimético para pesquisa nanobioscience por causa de sua sintética flexibilidade, robustez, e ordenando a nível atômico. O dobramento de uma única cadeia, anfifílicos, informação rica em polypeptoid em um nanosheet altamente ordenado foi recentemente demonstrada. Este é um peptoid 36-mer, que consiste em apenas três diferentes monômeros comercialmente disponíveis: hidrofóbica, catiônicas e aniônicas. O cadeias laterais hidrofóbicas feniletil estão enterrados no núcleo nanosheet enquanto a amina iônicos e cadeias laterais carboxila alinhar nos rostos hidrofílico. O nanofolhas peptoid servir como uma plataforma potencial para miméticos de membrana, miméticos de proteínas, fabricação de dispositivos e sensores. Métodos para a síntese peptoid, formação da folha, e as imagens de microscopia são descritos e fornecer um método simples para que projetos futuros nanosheet peptoid.

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Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Um simples e gerais método de síntese manual de peptoid envolvendo equipamentos básicos e reagentes disponíveis comercialmente é delineado, permitindo Peptóides para ser facilmente sintetizado na maioria dos laboratórios. A síntese, purificação e caracterização de um 36mer peptoid anfifílicos é descrito, bem como a sua auto-montagem em altamente ordenado nanofolhas.

Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

solid-phase-submonomer-synthesis-peptoid-polymers-their-self-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K visualizações.  Lawrence Berkeley National Laboratory. Um simples e gerais método de síntese manual de peptoid envolvendo equipamentos básicos e reagentes disponíveis comercialmente é delineado, permitindo Peptóides para ser facilmente sintetizado na maioria dos laboratórios. A síntese, purificação e caracterização de um 36mer peptoid anfifílicos é descrito, bem como a sua auto-montagem em altamente ordenado nanofolhas.

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Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Forma Polímeros Memória da Cultura célula ativa

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Bioengenharia

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Fabricação de um dipolo-assistida Fase Sólida Extração Microchip para análise de metais traço em amostras de água

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), their ultimate clinical use has been hampered by the lack of biologically-relevant degradation observed for most smart materials. This is particularly true for temperature-responsive hydrogels, which are almost uniformly based on polymers that are functionally non-degradable (e.g., poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) or poly(oligoethylene glycol methacrylate) (POEGMA)). As such, to effectively translate the potential of thermoresponsive hydrogels to the challenges of remote-controlled or metabolism-regulated drug delivery, cell scaffolds with tunable cell-material interactions, theranostic materials with the potential for both imaging and drug delivery, and other such applications, a method is required to render the hydrogels (if not fully degradable) at least capable of renal clearance following the required lifetime of the material. To that end, this protocol describes the preparation of hydrolytically-degradable hydrazone-crosslinked hydrogels on multiple length scales based on the reaction between hydrazide and aldehyde-functionalized PNIPAM or POEGMA oligomers with molecular weights below the renal filtration limit. Specifically, methods to fabricate degradable thermoresponsive bulk hydrogels (using a double barrel syringe technique), hydrogel particles (on both the microscale through the use of a microfluidics platform facilitating simultaneous mixing and emulsification of the precursor polymers and the nanoscale through the use of a thermally-driven self-assembly and cross-linking method), and hydrogel nanofibers (using a reactive electrospinning strategy) are described. In each case, hydrogels with temperature-responsive properties similar to those achieved via conventional free radical cross-linking processes can be achieved, but the hydrazone cross-linked network can be degraded over time to re-form the oligomeric precursor polymers and enable clearance. As such, we anticipate these methods (which may be generically applied to any synthetic water-soluble polymer, not just smart materials) will enable easier translation of synthetic smart materials to clinical applications.

Protocols are described for the fabrication of degradable thermoresponsive hydrogels based on hydrazone cross-linking of polymeric oligomers on the bulk scale, microscale, and nanoscale, the latter for preparation of both gel nanoparticles and nanofibers.

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In conventional lab-on-a-chip-platforms, solvents and samples are passed through defined microfluidic channels with complex flow control installations. The droplet actuation platform presented here is a promising alternative. With it, it is possible to move a liquid drop (microreactor) on a planar surface of a reaction platform (lab-in-a-drop). The actuation of microreactors on the hydrophobic surface of the platform is based on the use of magnetic forces acting on the outer shell of the liquid drops which is made of a thin layer of superhydrophobic magnetite particles. The hydrophobic surface of the platform is needed to avoid any contact between the liquid core and the surface to allow a smooth movement of the microreactor. On the platform, one or more microreactors with volumes of 10 &#181;L can be positioned and moved simultaneously. The platform itself consists of a 3 x 3 matrix of electrical double coils which accommodate either neodymium or iron cores. The magnetic field gradients are automatically controlled. By variation of the magnetic field gradients, the microreactors' magnetic hydrophobic shell can be manipulated automatically to move the microreactor or open the shell reversibly. Reactions of substrates and corresponding enzymes can be initiated by merging the microreactors or bringing them into contact with surface immobilized catalysts.

Lab-in-a-drop reaction systems allow the versatile implementation of complex reactions in a microfluidic scale. An automated actuation platform consisting of a 3 x 3 matrix of electromagnetic coils was developed and successfully used to merge two 10 &#181;L microreactors and thereby initiate an enzymatic reaction in the resulting liquid marbles.

Aquosas gotículas usadas como Microreactors enzimática e sua atuação eletromagnética

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Síntese de cationizada Magnetoferritin para a magnetização ultra-rápida de Células

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...