Este protocolo permite a montagem dirigida à informação de sequências oligomericas por interações covalentes dinâmicas, imitando verdadeiramente a hibridização seqüencial-seletiva dos ácidos nucleicos, mas com maior força de ligação entrestra e ligações. Conjuntos covalentes dinâmicos são tipicamente restritos a arquiteturas simples devido à sua capacidade limitada de rearranjo de títulos e correção de erros. Em contraste, ao elevar-se ao longo da concentração de um ácido de Lewis para afetar a dissociação de vínculos e, posteriormente, catalisar o rearranjo de ligação, esta técnica mitiga as limitações cinéticas prevalentes dos sistemas de auto-montagem.
Este método poderia ser empregado em uma variedade de campos que utilizam reações de rearranjo de títulos covalentes, desde estruturas orgânicas covalentes com taxas de defeito excepcionalmente baixas até interfaces de tecido biomaterial capazes de adaptar e acomodar a remodelação contínua do substrato tecidual. Ao executar esta técnica pela primeira vez, os indivíduos podem encontrar conjuntos cineticamente presos mesmo após tempos prolongados de ressarquido. Aconselhamos os usuários iniciantes a tentar hibridizações entre oligômeros portadores exclusivamente de aldeído e exclusivamente resíduos de amina, simplificando as informações codificadas e, portanto, a hibridização.
Para iniciar este procedimento, pese 0,125 gramas de resina de suporte sólido fotolabtil FMOC e adicione-a a um vaso de reação de sintetizador automatizado fritado. Insira o vaso na porção de micro-ondas do sintetizador. Encha a garrafa principal de solvente com DMF e a garrafa de desproteção com uma solução de 20%4-metilpiperidina em DMF e esvazie o resíduo.
Em seguida, prepare uma solução molar de ácido bromoacético e DIC em DMF com volumes totais de 1,5 mililitros para cada resíduo em sequência e 0,47 mililitros de anidrido acético a 4,53 mililitros de DMF para fazer uma solução de capping de cinco mililitros. Prepare 0,5 soluções molares de cada amina primária a ser usada em NMP. O volume total de cada solução deve ser de 2,5 mililitros para cada resíduo da amina primária apropriada mais 2,5 mililitros adicionais.
Adicione todas as soluções ao coletor de sintetizadores automatizados. Usando um sintetizador de peptídeo automatizado, inchar a resina, cortar o grupo FMOC e executar a reação de deslocamento conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, salinize as paredes de um vaso de reação de vidro fritado equipado com uma torneira de três vias, enchendo-o até o topo com uma solução de 5%dichlorodimilane em DCE.
Deixe descansar por 30 minutos e depois escorra o vaso e lave-o com DCE e metanol. Depois que o navio estiver seco, transfira a resina para ele. Lave a resina três vezes com DCM usando cinco mililitros para cada lavagem enquanto borbulha com gás nitrogênio através de um braço e puxando o vácuo com outro.
Seque e armazene a resina e o oligopeptóide anexado até desproteção e decote. Quando estiver pronto para continuar, reinchar a resina se tiver sido armazenada por mais de um dia borbulhando-a com cinco mililitros de DMF por 10 minutos. Escorra o vaso e adicione uma pequena barra de agitação magnética e três mililitros de DCM seco ao vaso de peptídeo de vidro.
Pesar 0,1 equivalentes do catalisador de paládio e 25 equivalentes de fenilsilano por grupo alloc. Use um grampo para posicionar o vaso de reação em um ângulo acima da placa de agitação de modo que a resina sofre uma agitação suave enquanto permanece suspensa no solvente e tampar o vaso para evitar que o DCM evapore. Após uma hora, filtre a solução e lave a resina três vezes com DCM usando cinco mililitros por lavagem.
Em seguida, repita a desproteção alloc mais uma vez. Em seguida, enxágue a resina sequencialmente com metanol e DCM duas vezes e transfira a barra de resina e agitação magnética para um frasco de 20 mililitros. Submergir a resina em DMF, agitar e cortar conforme descrito no protocolo de texto.
Em seguida, use um filtro de seringa para separar oligopeptóide liberado da resina e remover o solvente sob vácuo. Reconstitua os peptoides em uma mistura 50-50 de água e acetonitrilo e purifique com HPLC preparatório de fase invertida. Combine as frações purificadas, depois congele-as e liofilize-as para produzir um pó off-white.
Analise o pó com espectrometria de massa ESI e MALDI. Para avaliar a pureza, realize o HPLC analítico dos oligopeptóides purificados. Primeiro, prepare 10 soluções de estoque milimolalar de cada sequência oligopeptóide usada para auto-montagem e uma solução de estoque de 10 milimólares de trifilato de escândio em acetonitrilo anidra.
Adicione 20 microliters de cada solução de estoque peptoide a um frasco de três mililitros equipado com uma barra de agitação magnética. Adicione 1,5 equivalentes da solução de trifilação de escândio por potencial ligação de amina da solução de estoque e adicione água e acetonitrilo suficientes para formar 200 microliters de uma solução de 2% de água e acetonitrila. Mexa suavemente a 70 graus Celsius por duas horas para a desproteção do acetil do aldeído e dissociação de todos os fios.
Depois disso, carregue o frasco com 200 microliters de clorofórmio e dois mililitros de água. Agite o frasco suavemente. Deixe a mistura em pé por pelo menos 15 minutos.
Após a separação completa da fase, extraia a camada orgânica com uma seringa microlitera. Transfira a camada orgânica para um novo frasco e mexa a 70 graus Celsius para oliomeraling que normalmente leva seis horas. Para demonstrar a capacidade dos peptoides codificados por informações de submeterem-se à seqüencial-seletiva auto-montagem dinâmica em escadas moleculares, uma vertente representativa é sintetizada e hibridizada com sua sequência peptoide complementar.
Os monômeros NPAM e NPAL são empregados como pares reativos covalentes dinâmicos com NEEE auxiliando a solubilidade de produtos auto-montados finais. Após a conclusão da síntese de submonômero de fase sólida, o grupo alloc é removido. Antes e depois da desproteção, porções da resina foram cortadas sob luz de 405 nanômetros e caracterizadas pela espectrometria de massa de eletrospray ionização.
A sequência é purificada pelo HPLC preparatório, depois liofilizada para obter um pó off-white e a pureza é confirmada com HPLC analítico. O oligopeptóide é posteriormente hibridizado com sua sequência complementar para pagar uma escada no registro confirmada pelo MALDI-MS. Ao realizar este procedimento, lembre-se de permitir tempo suficiente para que as camadas se separem completamente até que a fração aquosa se torne transparente, pelo menos 15 minutos para garantir a extração suficiente do catalisador.
Após a conclusão deste procedimento de montagem, deve-se realizar espectrometria de massa para determinar a extensão da hibridização. Além disso, a espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada ou NMR flúor pode ser usado para avaliar a concentração de escândio pós-extração. Embora essa técnica tenha sido recentemente desenvolvida, prevemos que a abordagem biomimética descrita em nosso trabalho será fundamental na direção do futuro projeto e montagem direcionada à informação de nanoestruturas complexas.
Vários dos reagentes usados aqui são perigosos. Por favor, tenha cuidado ao manusear estes ou quaisquer outros produtos químicos. Use todos os equipamentos de proteção individual e realize todos os experimentos dentro de um capô de fumaça.
