Name: synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
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Os autores gostaria de agradecer o Sr. Michael Connolly e Dr. Ronald Zuckermann (The Foundry Molecular, Lawrence Berkeley National Laboratory) técnica apoio na síntese de peptoid. Reconhecemos o apoio da Fundação Nacional de ciência (-1301505). Todos os experimentos de espectrometria de massa foram realizados na instalação de espectrometria de massa de química na Universidade do Pacífico.

1. síntese de Peptoid
Nota: A síntese começa com a ativação da resina inchaço da resina e removendo o grupo protegendo. Isto é seguido pelo crescimento da cadeia de peptoid para a resina através de ciclos de adição do monômero de repetição. O primeiro monómero acoplado à resina é o resíduo do C-terminal. O peptoid é alongada do C-terminal para o extremidade N-terminal. Uma vez que a sequência de peptoid desejada é alcançada, a resina é clivada fora e o produto peptoid é purificado.
<ol><li>Preparação dos reagentes Nota: Os reagentes líquidos são medidos através de uma micropipeta e os reagentes sólidos são medidos através de uma balança analítica.<ol>
<li>Misturar 6,2 mL de N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) e 43,8 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) para preparar um 0,8 M de solução DIC/DMF.</li>
		<li>Dissolva 5,56 g da BMA em 50,0 mL de DMF para preparar uma solução de 0,8 M. o BMA/DMF.</li>
		<li>Misture 2 mL de piperidina (Pip) e 8 mL de DMF para atingir 20% solução de Pip/DMF.</li>
		<li>Dissolver 1,9 mL de Npe em 13,1 mL de DMF para atingir 1,0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Dissolver a 1,3 mL de Nme em 13,7 mL DMF para atingir 1,0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Dissolver 0,32 mL de Nae em 2 mL de DMF para atingir 1,0 M Nae/DMF. Cuidado: A maioria dos produtos químicos usados na síntese é perigosa. Ácido trifluoroacético (TFA), DIC, Pip e BMA são perigosos para a pele, olhos e vias respiratórias. DMF e diclorometano (DCM) são suspeitos de serem agentes cancerígenos. Todas as reações devem ser executadas em uma coifa e equipamento de protecção adequado deve ser usado. Por favor, verifique a folha de dados de segurança do material (MSDS) de todos os produtos químicos usados na síntese.</li>
	</ol></li>
	<li>Ativação de resina
	<ol>
<li>Meça 84 mg de resina de amida de Rink (resina, 0.047 mmol, carregando 0,56 mmol/g) e adicioná-lo para um recipiente de reação de fase sólida polipropileno de 10 mL. Insira o êmbolo na embarcação.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de CPO para o recipiente de reação e tampar o recipiente com uma tampa de pressão. Coloque o recipiente em um shaker e agitar o recipiente à temperatura ambiente em um ângulo de movimento de aproximadamente 12 graus e 385 oscilações/min para 30 min. Escorra a solução para um contentor de resíduos removendo a tampa e empurrar o êmbolo da embarcação da reação.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de solução de Pip/DMF de 20% para o navio e capitão do navio. Agite-o agitador por 2 min e drenar a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de solução de Pip/DMF de 20% para o navio, capitão do navio e agite-o em temperatura ambiente por 12 min. remover a tampa e esvazie a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Lave a resina, adicionando 1 mL de DMF, tampando o recipiente e agitando o recipiente para 1 min. Retire a tampa e escorra a solução, empurrando o êmbolo. Lave a resina com DMF para 4 vezes adicionais.</li>
	</ol></li>
	<li>Adição do monômero e Acetilação N-terminal Nota: Cada ciclo de adição do monômero que envolve o deslocamento, bromoacetylation e reação de duas etapas.<ol>
<li>Realizar o primeiro ciclo de adição de monômero para formar o Nme-resina.</li>
		<li>Execute uma reação bromoacetylation. Misture 1 mL da solução de 0,8 M. o BMA/DMF e 1 mL de solução de 0,8 M DIC/DMF num copo. Transfira a mistura para um recipiente de reação contendo resina e capitão do navio. Coloque o recipiente no agitador e agite-o à temperatura ambiente por 20 min. remover a tampa e drenar a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DMF, tampando o recipiente, agitando-lo por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução. Lave a resina com DCM, mais uma vez e depois lave-o com DMF duas vezes.</li>
		<li>Realize uma reação de deslocamento. Adicione 1 mL de solução de 1,0 M Nme/DMF, capitão do navio, agitar o recipiente à temperatura de 60 min. remover a tampa e esvazie a solução empurrando o êmbolo.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1ml DMF, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina por desenho em 1 mL DCM, agitando durante 1 min e drenar a solução. Lave o DCM mais uma vez, seguido por lavagem com DMF duas vezes.</li>
		<li>Repetir ciclos de adição do monômero de passos 1.3.2 a 1.3.5 para formar Nae-(Npe-Nme)4-resina. Quando repetir a etapa de reação de deslocamento (1.3.4), use uma solução de amina específicas de acordo com a sequência de peptoid. Nota: A cadeia de peptoid é alongada do C-terminal para o extremidade N-terminal com o resíduo do C-terminal ligado à resina.</li>
		<li>Executar a Acetilação N-terminal para formar Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.</li>
		<li>Anidrido acético Mix 92 µ l dos, 43,5 µ l de N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) e 2 mL de DMF num copo para fazer cerca de 2 mL de acetilação cocktail.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de acetilação cocktail para o recipiente que contém resina, tampar o recipiente e agite-o à temperatura ambiente por 60 min. Retire a tampa e escorra a solução, empurrando o êmbolo.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DMF, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução. Repeti a lavagem da resina com DCM mais uma vez e, em seguida, lave-a com DMF mais duas vezes.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Repita a lavagem com DCM duas vezes. Retire a tampa e deixe a resina secar ao ar livre na embarcação da reação por 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Clivagem e purificação
	<ol>
<li>Misture 3,8 mL de TFA, 100 µ l de triisopropylsilane (dicas) e 100 µ l de HPLC-classe H2O em um copo para fazer 4 mL de clivagem cocktail.</li>
		<li>Adicionar 4 mL de acabadas clivagem cocktail para o recipiente que contém resina, tampar o recipiente e agite-o em temperatura ambiente por 2 h.</li>
		<li>Retire a tampa e recolher a filtrado solução para um tubo de centrifugação de polipropileno de 50 mL. Adicionar 1 mL de TFA para o navio, tampá-lo e agitar durante 1 min. recolher a filtrado solução no tubo de centrífuga mesmo.</li>
		<li>Evapore o TFA soprando em um fluxo de gás nitrogênio suavemente até que cerca de 1 mL solução viscosa.</li>
		<li>Adicionar 15 mL de éter dietílico para o restante da solução tampão tubo de centrífuga e incube-lo em um congelador-20 ° C durante 2 h durante a noite. O peptoid bruto precipita como sólido branco.</li>
		<li>Sedimento sólido utilizando uma centrífuga a 4.427 x g durante 10 min. remover a tampa do tubo e decantar éter etílico em um béquer cuidadosamente sem perder o sólido. Atenção: o éter etílico é um solvente orgânico inflamável. Por favor, use uma centrífuga seguro de éter dietílico.</li>
		<li>Lavar o sólido adicionando 10 mL de éter dietílico gelado em centrífuga tubo contendo o sólido, tampando o tubo e colocá-lo na centrífuga. Realize a centrifugação a 4.427 x g durante 10 min. Retire o centrifugador do tubo de centrífuga e decantar éter etílico em um béquer cuidadosamente sem perder o sólido.</li>
		<li>Seca o sólido soprando suavemente em um fluxo de gás nitrogênio.</li>
		<li>Adicione 10 mL de HPLC-classe H2O para dissolver o sólido seco. Passar a solução através de um filtro de seringa de nylon com tamanho de poros de 0,45 µm e recolher o filtrado para um tubo de centrifugação polipropileno de 50ml previamente ponderada.</li>
		<li>Escudo congelar a solução colocando e girando o tubo de centrífuga contendo a solução de peptoid em um 12 onças, double-Stack expandido poliestireno copo 1/3 cheio de nitrogênio líquido. Lyophilize a solução congelada durante a noite para render peptoid sólido.</li>
		<li>Repita mais uma vez de liofilização dissolvendo o sólido peptoid em 10 mL de HPLC-classe H2O, shell congelamento em nitrogênio líquido e liofilização durante a noite. A peptoid resultante é suficientemente puro para análise de sequências por espectrometria de massa.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS medições e análise de sequência
Nota: O experimento de MS/MS é realizado em um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo, acoplado a uma fonte de ionização (ESI) electrospray. Coleta de dados é controlada usando o software de aquisição de dados acompanhado com o instrumento. O procedimento geral inclui 1) executa a experiência de espectrometria de massa de varredura completa e gravando o espectro de massa, 2) realizando a CID MS/MS experimentar e gravação do espectro de MS/MS e 3) comparando os dados espectrais de MS/MS com teórica esquema de fragmentação previu baseia a característica estrutural da peptoid.
<ol><li>Preparação da solução de amostra
	<ol>
<li>Pese 1,0-2,0 mg peptoid sólido em um frasco de vidro de 3 a 5 mL. Adicione 1 mL de mistura solvente acetonitrila e água (ACN/H2O, 1:1, v/v) para dissolver o peptoid. Isto dá a solução estoque da amostra com uma concentração de cerca de 10-3 M.</li>
		<li>Transferência de 20 µ l de solução para um tubo de centrifugação de 1,5 mL e adicionar 1 mL de mistura solvente de ACN/H2O para produzir uma solução diluída de amostra de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Remover quaisquer possíveis partículas insolúveis na solução de amostra diluída, realizando a centrifugação a 4.427 x g por 3 min. transferir cerca de 700 µ l da parte superior da solução para outra centrífuga 1,5 mL tubo para fazer o peptoid MS solução de trabalho com concentração de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Ajuste a concentração da solução de trabalho de MS com base na intensidade do sinal observado durante as medições de espectrometria de massa.</li>
		<li>Uma maneira alternativa para remover quaisquer possíveis partículas insolúveis na solução de amostra diluída é passar a solução de amostra através de um filtro de seringa 0,20 µm e recolher o filtrado para um tubo de centrifugação de 1,5 mL para fazer o peptoid MS solução de trabalho de cerca de 10-5 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Gravação de espectros de massa
	<ol>
<li>Executar a mistura de solventes de ACN/H2O (1:1, v/v) com a fonte de ionização (ESI) electrospray e configurar o instrumento em um íon positivo padrão, o modo de varredura completa espectrometria de massa com uma gama de relação massa-de-carga (m/z) de 100-1500. Nota: Parâmetros de funcionamento típicos: Tensão de agulha ESI, 5 kV Tensão capilar, 40 V Secagem a temperatura do gás (gás nitrogênio), 200 ° C.</li>
		<li>Adicionar aproximadamente 300 µ l de solução de trabalho de peptoid MS (cerca de 10-5 M) em um 500 µ l ou uma seringa de 1 mL e conecte a seringa de entrada do ESI usar capilar poliéter éter cetona (PEEK) produto. Coloque a seringa para a bomba de seringa e definir a taxa de fluxo em 10 µ l/min para infundir a solução de amostra na entrada do ESI.</li>
		<li>Ligue a tensão de agulha ESI para ativar o processo ESI e em seguida, ligue o detector. Configurar a visualização no modo de perfil e na faixa de 100-1.500 m/z. Exibir um perfil de espectro de massa mostrado na janela de perfil. O pico m/z 1.265 (exibido como m/z de 1,264.6) corresponde a peptoid peptoid de íon ou protonados.</li>
		<li>Grave o espectro de MS por 2 min. Em "Método janela", usar 2 min como o "tempo de execução". Abra a janela de gravação e preencha um nome de arquivo apropriado e começar a gravar o espectro. Nota: O espectro de massa resultante é mostrado na Figura 3.</li>
		<li>Otimize a intensidade do pico m/z de 1.265. Definir o intervalo de m/z para 1.150-1.350 e ajustar a tensão capilar enquanto visualiza o pico de intensidade em mV mostrada na janela de perfil. Por exemplo, aumentar a tensão capilar para 50 V ou superior e visualizar a mudança do pico de intensidade. A intensidade de pico ideal é em torno de 150-200 mV. Nota: Ajuste a tensão capilar pode alterar significativamente a abundância de certos íons. Aumentando a tensão capilar pode aumentar a intensidade do íon peptoid. No entanto, uma alta tensão capilar também pode induzir a dissociação do íon peptoid na fonte de íons e diminuir a intensidade observada. Ajustar a temperatura do gás de secagem pode aumentar a intensidade do pico m/z 1.265, mas é menos eficaz que o ajuste da tensão capilar. Se o pico m/z 1.265 não atingir a intensidade ideal, ajuste a concentração de amostra (ou exemplo, dobro a concentração da solução de trabalho de MS).</li>
		<li>Alterne o aparelho para o modo de MS/MS. Definir o íon precursor em m/z 1.265 e as MS/MS massa gama em m/z de 100-1.400. Em "Método janela," usar m/z 1.265 como a "primeira missa Q1" e deixe a "última missa Q1" em branco. Use m/z 100 como o "Q3 primeira missa" e m/z 1.400 como o "Q3 última missa." Nota: No modo de MS/MS, o primeiro quadrupolo unidade (Q1) funciona como um filtro em massa para isolar o íon peptoid como o íon precursor, a segunda unidade de quadrupolo (Q2) é uma célula de colisão e as funções de unidade (Q3) quadrupolo terceiros como um analisador de massa.</li>
		<li>Conjunto de pressão a energia de colisão em 40 eV e o gás de colisão (árgon, neste caso) em 1,5 mTorr.</li>
		<li>Exibir um perfil de espectro de massa exibido na janela de perfil. O pico m/z de 1.265 corresponde ao íon peptoid, e os picos com valores mais baixos de m/z representam os fragmentos do íon peptoid.</li>
		<li>Ajuste a energia de colisão para otimizar a exibição do espectro de fragmentação. Por exemplo, aumentar a energia de colisão de 45 eV... e ver a mudança do perfil do espectro. Nota: em geral, aumentando a energia de colisão irá aumentar a abundância de íons de fragmento e reduzir a abundância do íon peptoid. Aumentando a pressão do gás de colisão também aumentará a abundância dos íons fragmento. ADVERTÊNCIA: Não aumente a pressão de gás de colisão além 2 mTorr.</li>
		<li>Registro do espectro de MS/MS, por 2 min. Em "Método janela," usar 2 min como o "tempo de execução". Abra a janela de gravação e preencha um nome de arquivo apropriado e começar a gravar o espectro.</li>
		<li>Repeti a gravação 1 - 2 vezes.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de sequência de Peptoid Nota: Sob a condição de CID, o íon peptoid iria fragmentar nas ligações Amida ao longo da espinha de peptoid para produzir uma série de fragmentos de N-terminal chamado B-íons e uma série de fragmentos C-terminal chamado Y-íons<ol>
<li>Retire a estrutura química da peptoid acetificado, colocando o N-terminal do lado esquerdo e o C-terminal do lado direito e desenhar uma linha tracejada em cada ligação Amida para gerar um esquema de fragmentação, como mostrado na Figura 2a. Desenhe um próton com um círculo tracejado para indicar a transportadora de carga. A partir do lado esquerdo da estrutura, Coloque etiquetas em linhas tracejadas para indicar os fragmentos do N-terminal como B1, B2, B8. A partir do lado direito, Coloque etiquetas em linhas tracejadas para indicar os fragmentos C-terminais como Y1, Y2, Y8. Nota: Um software de desenho químico pode ser utilizado para desenhar a estrutura de peptoid.</li>
		<li>Imagine a fragmentação no laço de Amida 4th do lado esquerdo e desenhar as estruturas do fragmento N-terminal e o fragmento do C-terminal com adequada acusações formais, como mostrado na Figura 2b. Colocar a etiqueta de B4 o fragmento N-terminal e colocar a etiqueta de Y5 o fragmento C-terminal. Calcular o valor de B4 m/z somando as massas nominais dos elementos na estrutura para produzir um valor de 580 e coloque o fragmento N-terminal m/z 580. Calcular o valor de Y5 m/z e coloque o fragmento C-terminal m/z 685.</li>
		<li>Calcular os valores de m/z para todos os oito íons de B e todos os oito íons de Y e reuni-los em uma tabela, conforme mostrado na tabela 1. Nota: Os valores de m/z dos fragmentos podem ser calculados usando uma software de desenho de química.</li>
		<li>Abra o espectro de MS/MS gravado da peptoid usando o software de análise de dados acompanhado com o instrumento. Defina as preferências de rotulagem para "Mostrar rótulos de Ion" e limiar de rótulo para 3%. Isso gera um espectro de MS/MS com m/z valores rotulados nos picos.</li>
		<li>Exporte a MS/MS espectrais dados como um arquivo de texto CSV a formatar e reconstruir o espectro usando software de processamento de dados. Coloque valores m/z nos picos. O espectro de MS/MS resultante é mostrado na Figura 4. Nota: Alguns espectrómetros de massa estão equipados com software de processamento de dados capaz para gerar o espectro de MS/MS. Neste caso, exportando os dados espectrais de MS/MS não é necessário.</li>
		<li>Atribua os valores de m/z mostrados o espectro de MS/MS àqueles mostrados na tabela 1 para identificar os correspondentes B - e Y-íons. Por exemplo, o pico m/z 580 é identificado como o B-4-íon e m/z 685 é identificado como o Y5-íon. Rotule os picos com símbolos correspondentes de B e Y no espectro, como mostrado na Figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Multistep+Synthesis+of+a+Bioactive+Peptidomimetic+Oligomer+for+the+Undergraduate+Laboratory.">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li><li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets.">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).</li><li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, tem sido sintetizado usando o protocolo apresentado. O aparelho de síntese envolve uma embarcação da reação de fase sólida polipropileno como seringa e um agitador mecânico. Os vasos de reação são comercialmente disponíveis e de baixo custo. Um agitador mecânico é um aparelho comum em laboratórios de química. Com o uso de uma embarcação da reação como seringa, soluções podem ser sugadas e empurradas para fora do navio, manualmente, move...

Peptoids são uma classe de polímeros sequência controlada com estruturas de espinha dorsal, imitando a estrutura de peptídeos. Peptoids pode ser sintetizado a partir diversas aminas, que permite peptoids a expor propriedades altamente sintonizável1,2. Peptoids têm sido utilizados como modelos moleculares para pesquisas biofísicas, considerados como agentes terapêuticos e concebido como ligantes para proteínas3,4,5,6. Peptoids foram desenvolvidos em uma variedade de compostos biologicamente ativos, tais como materiais anti-incrustantes e anticorpo-mimética, agentes antimicrobianos e inibidores de enzima7,8,9. Com uma natureza altamente ordenada e ajustável, peptoids têm também sido pensado como um tipo de armazenamento de informação molecular10. A descoberta dessas chamadas de diversas aplicações para o desenvolvimento de métodos analíticos eficientes para caracterizar a sequência e estrutura de peptoids. Técnicas de espectrometria de massa em tandem-baseado mostraram a promessa como o método de escolha para analisar as propriedades de sequência de polímeros sequência controlada, incluindo peptoids11,12,13, 14,15. No entanto, estudos sistemáticos, correlacionando os padrões de fragmentação do íon peptoid resultantes de estudos de espectrometria de massa e as informações estruturais de peptoids são muito limitados.
Peptoids podem ser facilmente sintetizados usando um método de fase sólida. O método desenvolvido envolve uma iteração de um monômero do Two-Step adição ciclo16,17. Em cada ciclo de adição, uma amina ligados a resina é acetilada por um haloacetic ácido (normalmente bromoacético BMA), e este é seguido por uma reação de deslocamento com uma amina primária. Embora a síntese automatizado protocolos foram rotineiramente aplicados para a síntese de peptoid, peptoids podem ser sintetizados manualmente com excelente rendimento em um padrão química laboratório16,18,19, 20.
Nosso laboratório tem adotado o método da síntese de peptoid manual e simplificado o aparelho utilizado nos métodos existentes. Estudamos, anteriormente, os padrões de fragmentação de uma série de peptoids, usando técnicas de MS/MS21,22,23. Nossos resultados mostram que peptoids produzir fragmentações características quando eles estão sujeitos a dissociação induzida por colisão (CID)21,23 ou captura eletrônica-experiências de dissociação (ECD)22 . Neste artigo, demonstramos como oligo-peptoids pode ser sintetizado em um laboratório de química padrão, como a realizar os experimentos de CID usando um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo e como analisar os dados espectrais. O peptoid a ser sintetizado e caracterizado é um nonamer com Acetilação N-terminal e C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. A estrutura da peptoid é mostrada na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>The software is a part of the Varian 320L package</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pressure caps for reaction vessels</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.45 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Styrofoam cup, 12 Oz</td><td>Common Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rink amide resin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>N, N&amp;rsquo;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Bromoacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>2-Phenylethylamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyoxyethylamine</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-ethylenediamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimethylformamide</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>N, N-diisopropylethylamine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>For generating HPLC grade water</td></tr><tr><td>HPLC-grade Water</td><td></td><td></td><td>Produced from Millipore MILLI-Q&amp;reg; Academic Water Purification System</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr></tbody></table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

Peptoids são oligômeros peptídeo-imitando sequência controlada constituído por unidades de N-alquilados de glicina. Entre muitas aplicações potenciais, peptoids ter sido pensado como um tipo de armazenamento de informação molecular. Análise de espectrometria de massa tem sido considerada o método de escolha para peptoids de sequenciamento. Peptoids podem ser sintetizados via química de fase sólida usando um repetição ciclo de reação em duas fases. Aqui nós apresentamos um método para sintetizar manualmente oligo-peptoids e analisar a sequência do peptoids usando técnicas de espectrometria de massa (MS/MS) em tandem. A amostra peptoid é um nonamer consistindo de alternadas de N-(2-methyloxyethyl) glicina (Nme) e N-(2-feniletílico) glicina (Npe), bem como uma N-(2-aminoetil) glicina (Nae) no N-terminal. A fórmula de sequência do peptoid é Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, onde Ac é o grupo acetila. A síntese ocorre em uma embarcação da reação de fase sólida comercialmente disponível. A resina de Amida rinque é usada como o sólido apoio para produzir o peptoid com um grupo de amido no C-terminal. O produto resultante do peptoid é submetido a análise de sequência usando um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo, acoplado a uma fonte de ionização electrospray. A medição de MS/MS produz um espectro de íons fragmento resultante da dissociação do peptoid carregado. Os íons de fragmento são classificados com base nos valores de sua relação massa-de-carga (m/z). Os valores de m/z dos íons fragmento são comparados com as massas nominais de íons do fragmento teoricamente previsto, de acordo com o esquema de peptoid de fragmentação. A análise gera um padrão de fragmentação do peptoid carregado. O padrão de fragmentação é correlacionado com a sequência de monômero do peptoid neutro. A este respeito, MS análise lê as informações de sequência do peptoids.

A estrutura de um peptoid 9-mer com Acetilação N-terminal, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, é mostrada na Figura 1. O peptoid foi sintetizado manualmente em uma embarcação da reação de polipropileno fritado através de abordagem de fase sólida. Resina de amida de pista (0,047 mmol, 84 mg com carregamento 0,56 mmol/g) é usada como o sólido apoio para produzir o peptoid com um amidated C-terminal. A cadeia de peptoid é construída por vá...

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

Um protocolo é descrito para a síntese manual de oligo-peptoids seguido por análise de sequência por espectrometria de massa.

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K visualizações.  University of the Pacific. Um protocolo é descrito para a síntese manual de oligo-peptoids seguido por análise de sequência por espectrometria de massa.

Vídeo: Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Mass Spectrometric Abordagens para estudar a estrutura das proteínas e interacções em liofilizados Pós

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Química

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Bioquímica

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Síntese de Peptoides portadores de informações e sua Auto-montagem Dinâmica Covalent e dirigida por sequência

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Biologia

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.