Agradecemos ao Prof Kazuki Saito em RIKEN PSC e Bjoern Dr. Usadel em MPIMP para discussões úteis. TT é apoiado por uma bolsa da Fundação Alexander von Humboldt.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Materiais de plantas são colhidas e imediatamente congelados. </li><li> Materiais vegetais congelados são pulverizados por moinho misturador (ou argamassa) e armazenados em Falcon tubo ou tubo Eppendorf a -80 ° C. </li></ol> 2. Extração de perfil metabólico <ol><li> Aliquota congelada material de planta em um tubo Eppendorf 2 ml. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de extracção por miligrama de peso fresco de material vegetal congelado. </li><li> Adicionar um metal (ou gilconia) bola e homogeneizar de pó congelado com o moinho oscilante durante 2 min a 25 ls @ 1. </li><li> Centrifugar 10 min a 12.000 rpm. </li><li> Transferir o sobrenadante para NANOSEP filtro centrífugo. </li><li> Centrifugar 2 min a 4.000 rpm. </li><li> Transferir o sobrenadante para novo tubo Eppendorf, e armazenar a -20 ° C até à utilização. </li></ol> 3. Perfil metabólico por LC-MS <ol><li> Configure HPLC e verificar a temperatura do forno da coluna e bandeja de amostra. </li><li> Configure condição MS e verificar o estado de vácuo e aquecimento capilar. </li><li> Realizar m / z calibração do detector de MS. </li><li> Transferência de 50 uL de extractos de frasco de vidro para LC-MS. </li><li> Injectar 5 uL de extractos de LC-MS. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Configurar Xcalibur ou Metalign 4 e seleccionar a análise dos dados a serem processados. </li><li> Prepare uma tabela de picos detectados de seu interesse, de acordo com classe de compostos na Tabela I. </li><li> Identificar os picos por co-eluição de compostos padrão. </li><li> Anotar detectados picos usando MS análise 2, pesquisa bibliográfica, pesquisa de banco de dados metabolito (Figura 2, 12,13). </li></ol> 5. Previsão da via metabólica <ol><li> Construir um caminho possível com compostos detectados. Predição da via usando anotações pico deve basear-se na estrutura química do composto detectados, prevendo ligando funções enzimáticas da via metabólica 13. Etapas biossintéticas estruturantes devem ser conduzidas com anotação de pico precisa. Mas a determinação da estrutura química detalhada, por exemplo porção de açúcar, não é indispensável, neste passo, porque a predição de porção de açúcar e posição aduzido é muito difícil identificar por análise de MS. Determinação do tipo de açúcar, tais como hexoside e pentoside será identificada pelo ensaio enzimático de dador de açúcar no último passo de projecto. Principalmente construção de predição da via deve ser realizado como molécula pequena é intermediário de molécula maior, excepto nos casos alguns tais como reacção de desidratação. Lista de peso molecular atómica, por exemplo 16 m / z para diferença entre-H e-OH porção (oxidação), 14 m / z (átomo de carbono) para a diferença entre-OH e-OMe (metilação) e 162 m / z ( MW-H2O) para hexose (glicosilação), é útil para a predição. Determinação dotipo de modificação com a análise de correlação de especificidades tecidos ajuda a previsão da via metabólica. Banco de dados da via metabólica geral, tais como KEGG banco de dados ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) e PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), é muito eficaz para a previsão de via metabólica de seu interesse. </li></ol> 6. Preparação da lista com Gene ID Gene Arabidopsis ortólogos <ol><li> Baixe lista de identificação de genes de banco de dados genômicos. </li><li> Adicionar ID gene Arabidopsis do gene ortólogos, em caso de sua planta não é alvo de Arabidopsis. </li><li> Prepare uma lista de genes em seu caminho de interesse. Anotação de dados via Arabidopsis e dados da família de genes estão disponíveis no site TAIR ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Se você preparou uma lista de genes ortólogos de Arabidopsis, você pode, posteriormente, combine-los. </li></ol> 7. Co-expressa Análise Gene <ol><li> Teste usando a lista de identificação de gene preparado para procurar o melhor banco de dados para o seu caminho, verificando a correlação usando pares de genes bem conhecidos em seu caminho de interesse (Quadro II). Se for co-expressão banco de dados ou a expressão do gene não estão disponíveis na planta de seu interesse, base de dados de co-expressão de Arabidopsis deve ser usado com uma lista de Arabidopsis genes ortólogos. No caso de cevada, arroz, choupo, trigo, Medicago e soja, a co-expressão de análise de espécies de plantas pode ser utilizado (Tabela II). </li><li> Construa o quadro para o seu destino de rede co-expressão com base nas conexões dos genes bem conhecidos em seu caminho de interesse. </li><li> Adicionar genes candidatos correlação (r &lt;0,4 ~ 0,90, no valor aproximado de valor do coeficiente entre as conexões dos genes bem conhecidos em seu caminho de interesse) e verificar a sua anotação de genes em seu prfamílias edicted para as conexões desta rede para encontrar genes candidatos melhores (Figura 3). Limite de valor do coeficiente deve ser coordenada de acordo com a estrutura de rede e densidade de genes correlatos. </li><li> Faça lista de genes que você é capaz de diminuir como sendo especializado para o seu caminho de destino. </li><li> Verifique a expressão gênica das especificidades de órgãos e as respostas de estresse de seus genes candidatos. </li></ol> 8. Integração de todas as informações para prever Novos Caminhos <ol><li> Adicionar genes bem caracterizados que têm sido utilizados para consulta de co-expressão de análise para predito via metabólica. </li><li> Verifique se as peças descaracterizados por essa via, por exemplo descaracterizados etapas enzimáticas, proteínas de transporte e fatores de transcrição. </li><li> Prever anotação gene mais adequado para estes passos em falta não caracterizadas. </li><li> Combinar os resultados de perfil metabólico e genes candidatos de in silico gene expressão com base no percurso previsto. </li><li> Dispor genes candidatos seus na via predito de acordo com a função do gene, por exemplo, acetiltransferase para acetilado metabolito, glicosiltransferase para glicósido, P450 para o composto oxidado. A análise filogenética árvore de sequências de aminoácidos é útil para alguns família de genes de largura, tais como citocromo P450 e glicosiltransferase. </li><li> Verifique a consistência das especificidades do tecido ou respostas de estresse entre acúmulo de metabólitos e níveis de expressão gênica de genes candidatos. </li><li> Verifique as conexões para o metabolismo outro para fornecer substrato e estresse genes responsivos. </li></ol> 9. Experimentos para identificação de genes usando Bio-recursos <ol><li> Verifique a disponibilidade de recursos biológicos para a facilitação de experimento para identificação de genes candidatos. </li><li> Realizar um experimento para identificação da função do gene usando recursos biológicos, tais como KO biblioteca mutante e full-length biblioteca de cDNA. Tele experimentos para identificação funcional de genes com a preparação de plantas superexpressão e mutantes knockout, ensaio e ensaio enzimático promotor de ligação, tem que ser feita para os melhores genes candidatos na sua previsão. Ensaio de proteína recombinante para a caracterização das propriedades da proteína e preparação de plantas superexpressão melhor ser realizada após a confirmação do perfil dos metabolitos usando KO mutante uma vez que leva muito mais tempo para preparar a proteína recombinante e clonagem de genes para a transformação. </li></ol> 10. Os resultados representativos O procedimento de análise integrada descrito neste protocolo tem muitas possibilidades, dependendo finalidade experimental especificado e escolha de combinações biológicas e analíticas. Escolha dos procedimentos e desenho experimental deve ser efectuada adequadamente na base da sua via de alvo, os compostos e as espécies de plantas. A estratégia de integração descritos neste protocolo é foc<html> usado em anotação da função do gene vegetal ea descoberta de funções de genes novos com um uso eficiente de vários bio-e os dados de recursos. Resultado esperado é prometido para fornecer com o único caso de previsão conclusivo. Este facto indica que se evidências suficientes não pode ser dada por perfis de combinação, experiência não deve ser iniciado. Por esta razão, em qualquer dos casos, experiências preliminares adicionais tais como o perfil alvo expressão do gene por RT-PCR, pode suportar a sua previsão da função do gene. Precisão e exatidão da previsão correlaciona maior dependendo diferença qualitativa e número de variação de combinação. Além disso, bons candidatos e os resultados válidos só pode vir de previsão acurada das vias. Anotação de pico deve ser conduzida pela combinação de várias abordagens, por exemplo, levantamento da literatura, extrato vegetal de referência, a análise MS n, a especificidade do órgão e análise mutante 13. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Descrição geral do fluxo experimental de anotação gene através da abordagem combinada. Em alguns casos, os projectos começar com a descoberta de um novo pico o qual é detectado em condições especiais ou tecidos, eo desejo de compreender o seu papel no seu metabolismo. Em outros casos, o objetivo do projeto é a identificação de genes ou descoberta dos principais fatores de regulação, tais como fatores de transcrição. Concepção de experiência deve ser aplainada com um conjunto de dados que mostra diferenças claras de níveis de metabolitos no seu caminho alvo, utilizando uma grande variedade de amostras de tecido a partir de diferentes órgãos, e para as plantas cultivadas diferencialmente ou plantas expostas a condições de stress, e sujeitando o material para perfil metabólico. As plantas mutantes e transgénicos, bem como material de reprodução QTL guarida também representam o material genético apropriado para estes estudos. Previsão da nova via deve ser realizada com cuidado e com precisãoanotação de pico e aproximação da combinação com diferentes tipos de metabolotype como títulos de órgãos e as respostas de estresse de acordo com dados de expressão gênica do seu percurso de interesse. Na última etapa, o perfil metabolito e transcrição deve ser realizada que eventualmente, quando combinado com análise in silico de web-recursos e caracterização in vitro da expressão de genes através de expressão heteróloga, conduzir à confirmação do gene candidato e elucidação da sua função ea posição dentro de uma via metabólica. Abreviaturas: QTL, locos de características quantitativas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Figura 2. Fluxo de trabalho do abordagem combinatória para a anotação de pico. Um procedimento para a identificação de pico e anotação pelo composto padrão, a comparação de tipo selvagem e mutantes knock out, multi-dimensional de espectrometria de massa do pico alvo referindo-se a espectros de massa de COM puroquilos a partir dos 12 bancos de dados. Abreviaturas: DB, banco de dados; KO, knock-out; 1-D, unidimensional; 2-D, bidimensional, RMN, ressonância magnética nuclear; IR, infra-vermelho, MS n, a massa de massa spectrometries. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplo de análise de rede de co-regulação da via antocianina. Análises foram realizadas utilizando a co-expressão do PRIME ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) com base nos dados constantes da versão 3 ATTEDII 8,2 com a Pajek programa ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Correlações positivas (r &lt;0,5) são usados ​​para fazer conexões de rede. Red nó: doze genes antocianinas enzimáticos (At5g13930, caps, TT4 chalcona sintase; At3g55120, CHI, TT5, chalcona isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanona 3-hidroxilase; At5g07990, F3&#39;H, TT7, flavonóides 3&#39;-hidroxilase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonóide 3 - O-glicosiltransferase; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, diidroflavonol redutase; At4g22880, ANS / LDOX, TT18, Synthese anthocyanidin; At4g14090, A5GT, antocianinas 5 - O-glicosiltransferase; At5g54060, A3G2 &quot;XT, antocianina putativo 3 - O glicosídeo-2&quot; - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, antocianinas 5 - O glicosídeo-6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antocianina 3 - O glicosídeo-6 &quot;- O - p-coumaroyltransferase) e dois fatores de transcrição para a produção de antocianina (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) foi usado para procurar genes candidatos genes candidatos foram encontrados por uma &quot;interseção de conjuntos de&quot; pesquisa com um valor limiar, com um coeficiente de r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 consultado por interseção de conjuntos de todos os genes consultadas (Quatorze genes de biossíntese de antocianina). Uma rede de co-expressão, incluindo genes candidatos correlatas (68 genes) e genes consultados (14 genes), foi re-construída por uma &quot;interligação de conjuntos de&quot; pesquisa com r&gt; 0,50 utilizando o banco de dados PRIME. Os arquivos de saída que foram formatados com um arquivo &#39;net&#39;. Do banco de dados PRIME e redes foram desenhadas usando um software Pajek. Nó azul indica genes candidatos que se relacionaram com genes de antocianinas. <table border="1"><tbody><tr><td> espécies </td><td> Maior metabólito secundário </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolatos, flavonóis, antocianinas, derivado sinapoyl </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonóides, antocianinas, derivado salicilato </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonóides, antocianinas, tanino, estilbeno </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonóides, antocianinas, glicoalcalóide, chrologenate relacionado, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonóides, antocianinas, nicotianamide, chrologenate relacionado, acilaçúcar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, antocianina, derivados de esterol </td></tr><tr><td> Zea maio </td><td> Glycoflavone, antocianina, benzoxazinona, derivados de esterol </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavonas, antocianinas, saponinas, </td></tr><tr><td> Lotus japonica </td><td> Isoflavonas, flavonóides, antocianinas, saponinas, </td></tr></tbody></table> Tabela I. Os principais metabolitos secundários em espécies de plantas do modelo. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-expressão banco de dados </td><td> Endereço </td></tr><tr><td> Planta de cruz especificaçãos </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> As espécies de plantas </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Banco de Dados da Matriz de arroz </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabela II. Banco de dados de expressão disponível gene para análise in silico co-expressão.

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dado que Transcritômica e tecnologias metabolómica têm sido utilizados desde há vários anos, o processo de integração de dados para metabolômica assistidas anotação gene geralmente começa com a identificação de um novo pico representando um metabolito desconhecido. Este facto leva a que a fase seguinte é o de avaliar a variância quantitativa em picos metabolito ou os genes candidatos a novos pensados ​​para ser responsável pela sua biossíntese. A estratégia descrita neste protocolo, no entanto, tem três grandes problemas i) dificuldade de anotação de pico, ii) a complexidade da previsão caminho, III), resolução de informação genética e qualidade de dados de expressão gênica. Para contrariar o primeiro problema, anotação pico deve ser realizado com a co-eluição de compostos-padrão ou de informação abordagem combinatória utilizando a partir do MS N da análise, o extracto de referência, a análise de mutante, a pesquisa do banco de dados metabolito e pesquisa da literatura (Figura 2, 12). Para a second problema, a previsão de caminho só pode ser obtido pela anotação correta de pico. No entanto, o perfil de especificidade de tecido metabolito também pode ser anotação pico suporte, porque a acumulação metabolito devem ser correlacionados com as expressões de genes de genes relacionados. Portanto perfis de combinação de diferentes tecidos e condições de crescimento podem ser úteis para este segundo problema. O terceiro problema diz respeito à resolução de informação gene depende do progresso de dados de sequência. No caso da planta modelo sem conclusão da sequência do genoma, a co-expressão de análise usando genes ortólogos em plantas outro modelo é útil. Comparação alinhamento e análise detalhadas árvore filogenética da seqüência de aminoácidos pode suportar para se conectar organismos modelo para outras espécies. Este protocolo é adequada para todos os metabolismos. É mais eficiente na análise de metabolismos intermediários e secundário, que estão bem caracterizados para ser sujeito a transcrição c forteONTROLO 1,5,11,16. Em alguns exemplos, a co-expressão de análise conseguiu ser realizada na assimilação de enxofre, os genes para β-oxidação, de cadeia ramificada degradação do ácido amino, repartição de clorofila, eo catabolismo da lisina 3, o metabolismo da parede celular 10,7 e luz cascata de sinalização 14. Anotação da função dos genes através de genômica combinados, metabolômica e informática não é apenas para o gene biossintético e regulador direto de fator de transcrição, mas também para compreender o processo fisiológico e resposta (ver Figura exemplo 3. 14). Para desenvolver essa abordagem a partir de plantas modelo para as espécies cultivadas, a comparação metabólico de diferentes espécies vegetais é poderosa abordagem em alguns metabolismos gerais. Por exemplo, se mesmo composto é detectada em diferentes espécies de plantas, e alguns genes ortólogos são encontrados nestas espécies de plantas, entre espécies análise de co-expressão usando ortólogos genes pode fornecer strong suporte para sua previsão. Esta abordagem pode ser realizada em Arabidopsis, choupo, Medicago, além culturas importantes, tais como a cevada, arroz, trigo e soja, por co-expressão de análise de espécies de plantas (6, PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,; 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> ; ver um exemplo, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Água destilada ULC / MS grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitrila (ACN) ULC / MS grau </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Metanol (MeOH) ULC / MS grau </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Ácido fórmico (HCOOH) grau ULC / MS para cromatografia líquida </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Compostos padrão </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Ion trap linear (TI) ESI-MS sistema Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC Surveyor sistema </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analytical Luna coluna C18 (2), 2,0 mm de diâmetro, 150 mm de comprimento, 100 poro Åtamanho e partículas esféricas de 3 milímetros </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur software </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

Dado o crescente número de espécies de plantas modelo para os quais seqüências genômicas completas estão disponíveis ea abundância de recursos biológicos, tais como mutantes knockout, adesões e as populações selvagens de criação avançados, há um crescente fardo para anotação gene funcional. Neste protocolo, a anotação da função planta gene através da análise combinada gene co-expressão, metabolômica e informática é fornecida (Figura 1). Esta abordagem é baseada na teoria da utilização de genes alvo de função conhecida para permitir a identificação de genes não-anotadas susceptível de ser envolvido num certo processo metabólico, com a identificação de compostos alvo através de metabolômica. Estratégias são propostas para aplicar essa informação sobre as populações geradas por ambas as abordagens direta e inversa genética, apesar de nenhum deles é fácil. Por corolário esta abordagem pode também ser usado como uma abordagem para caracterizar picos desconhecidos que representam si novo ou específicametabólitos condary nos tecidos limitados, espécies vegetais ou de tratamento de estresse, que é actualmente o julgamento importante para a compreensão do metabolismo da planta.

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Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Combinação de genômica, co-expressão de genes de análise e identificação de compostos-alvo através do metabolismo dar anotação gene funcional.

Anotação da função do gene da planta através de Genômica combinados, metabolômica e Informática

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K visualizações.  Max-Planck-Institut. Combinação de genômica, co-expressão de genes de análise e identificação de compostos-alvo através do metabolismo dar anotação gene funcional.

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) em Nicotiana benthamiana Tomate e

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

A β-glucuronidase (GUS) Ensaio Baseado Morte celular

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Assay silenciamento gênico Em Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of gene expression, miRNAs play key roles in various cellular pathways, including both development and response to a/biotic stress, such as drought and diseases. Having high-quality reference genome sequences enabled identification and annotation of miRNAs in several plant species, where miRNA sequences are highly conserved. As computational miRNA identification and annotation processes are mostly error-prone processes, homology-based predictions increase prediction accuracy. We developed and have improved the miRNA annotation pipeline, SUmir, in the last decade, which has been used for several plant genomes since then. 
This study presents a fully automated, new miRNA pipeline, mirMachine (miRNA Machine), by (i) adding an additional filtering step on the secondary structure predictions, (ii) making it fully automated, and (iii) introducing new options to predict either known miRNA based on homology or novel miRNAs based on small RNA sequencing reads using the previous pipeline. The new miRNA pipeline, mirMachine, was tested using The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, release of the Arabidopsis genome and the International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) wheat reference genome v2.

Herein, we present a new and fully automated miRNA pipeline, mirMachine that 1) can identify known and novel miRNAs more accurately and 2) is fully automated and freely available. Users can now execute a short submission script to run the fully automated mirMachine pipeline.

mirMachine: Um balcão único para anotação de miRNA de planta

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

Determinação da interação tripartite entre dois monômeros de um fator de transcrição da caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio por Ensaio BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.