Agradecemos ao Prof Kazuki Saito em RIKEN PSC e Bjoern Dr. Usadel em MPIMP para discussões úteis. TT é apoiado por uma bolsa da Fundação Alexander von Humboldt.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Materiais de plantas são colhidas e imediatamente congelados. </li><li> Materiais vegetais congelados são pulverizados por moinho misturador (ou argamassa) e armazenados em Falcon tubo ou tubo Eppendorf a -80 ° C. </li></ol> 2. Extração de perfil metabólico <ol><li> Aliquota congelada material de planta em um tubo Eppendorf 2 ml. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de extracção por miligrama de peso fresco de material vegetal congelado. </li><li> Adicionar um metal (ou gilconia) bola e homogeneizar de pó congelado com o moinho oscilante durante 2 min a 25 ls @ 1. </li><li> Centrifugar 10 min a 12.000 rpm. </li><li> Transferir o sobrenadante para NANOSEP filtro centrífugo. </li><li> Centrifugar 2 min a 4.000 rpm. </li><li> Transferir o sobrenadante para novo tubo Eppendorf, e armazenar a -20 ° C até à utilização. </li></ol> 3. Perfil metabólico por LC-MS <ol><li> Configure HPLC e verificar a temperatura do forno da coluna e bandeja de amostra. </li><li> Configure condição MS e verificar o estado de vácuo e aquecimento capilar. </li><li> Realizar m / z calibração do detector de MS. </li><li> Transferência de 50 uL de extractos de frasco de vidro para LC-MS. </li><li> Injectar 5 uL de extractos de LC-MS. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Configurar Xcalibur ou Metalign 4 e seleccionar a análise dos dados a serem processados. </li><li> Prepare uma tabela de picos detectados de seu interesse, de acordo com classe de compostos na Tabela I. </li><li> Identificar os picos por co-eluição de compostos padrão. </li><li> Anotar detectados picos usando MS análise 2, pesquisa bibliográfica, pesquisa de banco de dados metabolito (Figura 2, 12,13). </li></ol> 5. Previsão da via metabólica <ol><li> Construir um caminho possível com compostos detectados. Predição da via usando anotações pico deve basear-se na estrutura química do composto detectados, prevendo ligando funções enzimáticas da via metabólica 13. Etapas biossintéticas estruturantes devem ser conduzidas com anotação de pico precisa. Mas a determinação da estrutura química detalhada, por exemplo porção de açúcar, não é indispensável, neste passo, porque a predição de porção de açúcar e posição aduzido é muito difícil identificar por análise de MS. Determinação do tipo de açúcar, tais como hexoside e pentoside será identificada pelo ensaio enzimático de dador de açúcar no último passo de projecto. Principalmente construção de predição da via deve ser realizado como molécula pequena é intermediário de molécula maior, excepto nos casos alguns tais como reacção de desidratação. Lista de peso molecular atómica, por exemplo 16 m / z para diferença entre-H e-OH porção (oxidação), 14 m / z (átomo de carbono) para a diferença entre-OH e-OMe (metilação) e 162 m / z ( MW-H2O) para hexose (glicosilação), é útil para a predição. Determinação dotipo de modificação com a análise de correlação de especificidades tecidos ajuda a previsão da via metabólica. Banco de dados da via metabólica geral, tais como KEGG banco de dados ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) e PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), é muito eficaz para a previsão de via metabólica de seu interesse. </li></ol> 6. Preparação da lista com Gene ID Gene Arabidopsis ortólogos <ol><li> Baixe lista de identificação de genes de banco de dados genômicos. </li><li> Adicionar ID gene Arabidopsis do gene ortólogos, em caso de sua planta não é alvo de Arabidopsis. </li><li> Prepare uma lista de genes em seu caminho de interesse. Anotação de dados via Arabidopsis e dados da família de genes estão disponíveis no site TAIR ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Se você preparou uma lista de genes ortólogos de Arabidopsis, você pode, posteriormente, combine-los. </li></ol> 7. Co-expressa Análise Gene <ol><li> Teste usando a lista de identificação de gene preparado para procurar o melhor banco de dados para o seu caminho, verificando a correlação usando pares de genes bem conhecidos em seu caminho de interesse (Quadro II). Se for co-expressão banco de dados ou a expressão do gene não estão disponíveis na planta de seu interesse, base de dados de co-expressão de Arabidopsis deve ser usado com uma lista de Arabidopsis genes ortólogos. No caso de cevada, arroz, choupo, trigo, Medicago e soja, a co-expressão de análise de espécies de plantas pode ser utilizado (Tabela II). </li><li> Construa o quadro para o seu destino de rede co-expressão com base nas conexões dos genes bem conhecidos em seu caminho de interesse. </li><li> Adicionar genes candidatos correlação (r &lt;0,4 ~ 0,90, no valor aproximado de valor do coeficiente entre as conexões dos genes bem conhecidos em seu caminho de interesse) e verificar a sua anotação de genes em seu prfamílias edicted para as conexões desta rede para encontrar genes candidatos melhores (Figura 3). Limite de valor do coeficiente deve ser coordenada de acordo com a estrutura de rede e densidade de genes correlatos. </li><li> Faça lista de genes que você é capaz de diminuir como sendo especializado para o seu caminho de destino. </li><li> Verifique a expressão gênica das especificidades de órgãos e as respostas de estresse de seus genes candidatos. </li></ol> 8. Integração de todas as informações para prever Novos Caminhos <ol><li> Adicionar genes bem caracterizados que têm sido utilizados para consulta de co-expressão de análise para predito via metabólica. </li><li> Verifique se as peças descaracterizados por essa via, por exemplo descaracterizados etapas enzimáticas, proteínas de transporte e fatores de transcrição. </li><li> Prever anotação gene mais adequado para estes passos em falta não caracterizadas. </li><li> Combinar os resultados de perfil metabólico e genes candidatos de in silico gene expressão com base no percurso previsto. </li><li> Dispor genes candidatos seus na via predito de acordo com a função do gene, por exemplo, acetiltransferase para acetilado metabolito, glicosiltransferase para glicósido, P450 para o composto oxidado. A análise filogenética árvore de sequências de aminoácidos é útil para alguns família de genes de largura, tais como citocromo P450 e glicosiltransferase. </li><li> Verifique a consistência das especificidades do tecido ou respostas de estresse entre acúmulo de metabólitos e níveis de expressão gênica de genes candidatos. </li><li> Verifique as conexões para o metabolismo outro para fornecer substrato e estresse genes responsivos. </li></ol> 9. Experimentos para identificação de genes usando Bio-recursos <ol><li> Verifique a disponibilidade de recursos biológicos para a facilitação de experimento para identificação de genes candidatos. </li><li> Realizar um experimento para identificação da função do gene usando recursos biológicos, tais como KO biblioteca mutante e full-length biblioteca de cDNA. Tele experimentos para identificação funcional de genes com a preparação de plantas superexpressão e mutantes knockout, ensaio e ensaio enzimático promotor de ligação, tem que ser feita para os melhores genes candidatos na sua previsão. Ensaio de proteína recombinante para a caracterização das propriedades da proteína e preparação de plantas superexpressão melhor ser realizada após a confirmação do perfil dos metabolitos usando KO mutante uma vez que leva muito mais tempo para preparar a proteína recombinante e clonagem de genes para a transformação. </li></ol> 10. Os resultados representativos O procedimento de análise integrada descrito neste protocolo tem muitas possibilidades, dependendo finalidade experimental especificado e escolha de combinações biológicas e analíticas. Escolha dos procedimentos e desenho experimental deve ser efectuada adequadamente na base da sua via de alvo, os compostos e as espécies de plantas. A estratégia de integração descritos neste protocolo é foc<html> usado em anotação da função do gene vegetal ea descoberta de funções de genes novos com um uso eficiente de vários bio-e os dados de recursos. Resultado esperado é prometido para fornecer com o único caso de previsão conclusivo. Este facto indica que se evidências suficientes não pode ser dada por perfis de combinação, experiência não deve ser iniciado. Por esta razão, em qualquer dos casos, experiências preliminares adicionais tais como o perfil alvo expressão do gene por RT-PCR, pode suportar a sua previsão da função do gene. Precisão e exatidão da previsão correlaciona maior dependendo diferença qualitativa e número de variação de combinação. Além disso, bons candidatos e os resultados válidos só pode vir de previsão acurada das vias. Anotação de pico deve ser conduzida pela combinação de várias abordagens, por exemplo, levantamento da literatura, extrato vegetal de referência, a análise MS n, a especificidade do órgão e análise mutante 13. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Descrição geral do fluxo experimental de anotação gene através da abordagem combinada. Em alguns casos, os projectos começar com a descoberta de um novo pico o qual é detectado em condições especiais ou tecidos, eo desejo de compreender o seu papel no seu metabolismo. Em outros casos, o objetivo do projeto é a identificação de genes ou descoberta dos principais fatores de regulação, tais como fatores de transcrição. Concepção de experiência deve ser aplainada com um conjunto de dados que mostra diferenças claras de níveis de metabolitos no seu caminho alvo, utilizando uma grande variedade de amostras de tecido a partir de diferentes órgãos, e para as plantas cultivadas diferencialmente ou plantas expostas a condições de stress, e sujeitando o material para perfil metabólico. As plantas mutantes e transgénicos, bem como material de reprodução QTL guarida também representam o material genético apropriado para estes estudos. Previsão da nova via deve ser realizada com cuidado e com precisãoanotação de pico e aproximação da combinação com diferentes tipos de metabolotype como títulos de órgãos e as respostas de estresse de acordo com dados de expressão gênica do seu percurso de interesse. Na última etapa, o perfil metabolito e transcrição deve ser realizada que eventualmente, quando combinado com análise in silico de web-recursos e caracterização in vitro da expressão de genes através de expressão heteróloga, conduzir à confirmação do gene candidato e elucidação da sua função ea posição dentro de uma via metabólica. Abreviaturas: QTL, locos de características quantitativas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Figura 2. Fluxo de trabalho do abordagem combinatória para a anotação de pico. Um procedimento para a identificação de pico e anotação pelo composto padrão, a comparação de tipo selvagem e mutantes knock out, multi-dimensional de espectrometria de massa do pico alvo referindo-se a espectros de massa de COM puroquilos a partir dos 12 bancos de dados. Abreviaturas: DB, banco de dados; KO, knock-out; 1-D, unidimensional; 2-D, bidimensional, RMN, ressonância magnética nuclear; IR, infra-vermelho, MS n, a massa de massa spectrometries. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplo de análise de rede de co-regulação da via antocianina. Análises foram realizadas utilizando a co-expressão do PRIME ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) com base nos dados constantes da versão 3 ATTEDII 8,2 com a Pajek programa ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Correlações positivas (r &lt;0,5) são usados ​​para fazer conexões de rede. Red nó: doze genes antocianinas enzimáticos (At5g13930, caps, TT4 chalcona sintase; At3g55120, CHI, TT5, chalcona isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanona 3-hidroxilase; At5g07990, F3&#39;H, TT7, flavonóides 3&#39;-hidroxilase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonóide 3 - O-glicosiltransferase; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, diidroflavonol redutase; At4g22880, ANS / LDOX, TT18, Synthese anthocyanidin; At4g14090, A5GT, antocianinas 5 - O-glicosiltransferase; At5g54060, A3G2 &quot;XT, antocianina putativo 3 - O glicosídeo-2&quot; - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, antocianinas 5 - O glicosídeo-6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antocianina 3 - O glicosídeo-6 &quot;- O - p-coumaroyltransferase) e dois fatores de transcrição para a produção de antocianina (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) foi usado para procurar genes candidatos genes candidatos foram encontrados por uma &quot;interseção de conjuntos de&quot; pesquisa com um valor limiar, com um coeficiente de r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 consultado por interseção de conjuntos de todos os genes consultadas (Quatorze genes de biossíntese de antocianina). Uma rede de co-expressão, incluindo genes candidatos correlatas (68 genes) e genes consultados (14 genes), foi re-construída por uma &quot;interligação de conjuntos de&quot; pesquisa com r&gt; 0,50 utilizando o banco de dados PRIME. Os arquivos de saída que foram formatados com um arquivo &#39;net&#39;. Do banco de dados PRIME e redes foram desenhadas usando um software Pajek. Nó azul indica genes candidatos que se relacionaram com genes de antocianinas. <table border="1"><tbody><tr><td> espécies </td><td> Maior metabólito secundário </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolatos, flavonóis, antocianinas, derivado sinapoyl </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonóides, antocianinas, derivado salicilato </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonóides, antocianinas, tanino, estilbeno </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonóides, antocianinas, glicoalcalóide, chrologenate relacionado, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonóides, antocianinas, nicotianamide, chrologenate relacionado, acilaçúcar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, antocianina, derivados de esterol </td></tr><tr><td> Zea maio </td><td> Glycoflavone, antocianina, benzoxazinona, derivados de esterol </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavonas, antocianinas, saponinas, </td></tr><tr><td> Lotus japonica </td><td> Isoflavonas, flavonóides, antocianinas, saponinas, </td></tr></tbody></table> Tabela I. Os principais metabolitos secundários em espécies de plantas do modelo. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-expressão banco de dados </td><td> Endereço </td></tr><tr><td> Planta de cruz especificaçãos </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> As espécies de plantas </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Banco de Dados da Matriz de arroz </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabela II. Banco de dados de expressão disponível gene para análise in silico co-expressão.

<ol>
	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+2-Hydroxyglutarate+and+Isovaleryl-CoA+Dehydrogenases+as+Alternative+Electron+Donors+Linking+Lysine+Catabolism+to+the+Electron+Transport+Chain+of+Arabidopsis+Mitochondria.">Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria.</a> Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).</li><li>De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 2, (2007).</li><li>Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omics-based+identification+of+Arabidopsis+Myb+transcription+factors+regulating+aliphatic+glucosinolate+biosynthesis.">Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).</li><li>Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlaNet:+Combined+Sequence+and+Expression+Comparisons+across+Plant+Networks+Derived+from+Seven+Species.">PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species.</a> Plant Cell. 23, 895-910 (2011).</li><li>Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Wiring+of+Cell+Wall-Related+Genes+in+Arabidopsis.">Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis.</a> Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).</li><li>Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATTED-II:+a+database+of+co-expressed+genes+and+cis+elements+for+identifying+co-regulated+gene+groups+in+Arabidopsis.">ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).</li><li>Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoP:+a+database+for+characterizing+co-expressed+gene+modules+with+biological+information+in+plants.">CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants.</a> Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).</li><li>Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+required+for+cellulose+synthesis+by+regression+analysis+of+public+microarray+data+sets.">Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).</li><li>Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemical+genomics+in+Arabidopsis+thaliana:+A+case+study+for+functional+identification+of+flavonoid+biosynthesis+genes.">Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes.</a> Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics:+A+user's+guide.">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genetic+diversity,+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function.">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).</li><li>Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+metabolic+programs+following+exposure+of+plants+to+UV-B+irradiation.">Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation.</a> Plant Signal Behav. 6, (2011).</li><li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dado que Transcritômica e tecnologias metabolómica têm sido utilizados desde há vários anos, o processo de integração de dados para metabolômica assistidas anotação gene geralmente começa com a identificação de um novo pico representando um metabolito desconhecido. Este facto leva a que a fase seguinte é o de avaliar a variância quantitativa em picos metabolito ou os genes candidatos a novos pensados ​​para ser responsável pela sua biossíntese. A estratégia descrita neste protocolo, no entanto, tem três grandes problemas i) dificuldade de anotação de pico, ii) a complexidade da previsão caminho, III), resolução de informação genética e qualidade de dados de expressão gênica. Para contrariar o primeiro problema, anotação pico deve ser realizado com a co-eluição de compostos-padrão ou de informação abordagem combinatória utilizando a partir do MS N da análise, o extracto de referência, a análise de mutante, a pesquisa do banco de dados metabolito e pesquisa da literatura (Figura 2, 12). Para a second problema, a previsão de caminho só pode ser obtido pela anotação correta de pico. No entanto, o perfil de especificidade de tecido metabolito também pode ser anotação pico suporte, porque a acumulação metabolito devem ser correlacionados com as expressões de genes de genes relacionados. Portanto perfis de combinação de diferentes tecidos e condições de crescimento podem ser úteis para este segundo problema. O terceiro problema diz respeito à resolução de informação gene depende do progresso de dados de sequência. No caso da planta modelo sem conclusão da sequência do genoma, a co-expressão de análise usando genes ortólogos em plantas outro modelo é útil. Comparação alinhamento e análise detalhadas árvore filogenética da seqüência de aminoácidos pode suportar para se conectar organismos modelo para outras espécies. Este protocolo é adequada para todos os metabolismos. É mais eficiente na análise de metabolismos intermediários e secundário, que estão bem caracterizados para ser sujeito a transcrição c forteONTROLO 1,5,11,16. Em alguns exemplos, a co-expressão de análise conseguiu ser realizada na assimilação de enxofre, os genes para β-oxidação, de cadeia ramificada degradação do ácido amino, repartição de clorofila, eo catabolismo da lisina 3, o metabolismo da parede celular 10,7 e luz cascata de sinalização 14. Anotação da função dos genes através de genômica combinados, metabolômica e informática não é apenas para o gene biossintético e regulador direto de fator de transcrição, mas também para compreender o processo fisiológico e resposta (ver Figura exemplo 3. 14). Para desenvolver essa abordagem a partir de plantas modelo para as espécies cultivadas, a comparação metabólico de diferentes espécies vegetais é poderosa abordagem em alguns metabolismos gerais. Por exemplo, se mesmo composto é detectada em diferentes espécies de plantas, e alguns genes ortólogos são encontrados nestas espécies de plantas, entre espécies análise de co-expressão usando ortólogos genes pode fornecer strong suporte para sua previsão. Esta abordagem pode ser realizada em Arabidopsis, choupo, Medicago, além culturas importantes, tais como a cevada, arroz, trigo e soja, por co-expressão de análise de espécies de plantas (6, PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,; 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> ; ver um exemplo, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Água destilada ULC / MS grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitrila (ACN) ULC / MS grau </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Metanol (MeOH) ULC / MS grau </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Ácido fórmico (HCOOH) grau ULC / MS para cromatografia líquida </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Compostos padrão </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Ion trap linear (TI) ESI-MS sistema Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC Surveyor sistema </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analytical Luna coluna C18 (2), 2,0 mm de diâmetro, 150 mm de comprimento, 100 poro Åtamanho e partículas esféricas de 3 milímetros </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur software </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

Dado o crescente número de espécies de plantas modelo para os quais seqüências genômicas completas estão disponíveis ea abundância de recursos biológicos, tais como mutantes knockout, adesões e as populações selvagens de criação avançados, há um crescente fardo para anotação gene funcional. Neste protocolo, a anotação da função planta gene através da análise combinada gene co-expressão, metabolômica e informática é fornecida (Figura 1). Esta abordagem é baseada na teoria da utilização de genes alvo de função conhecida para permitir a identificação de genes não-anotadas susceptível de ser envolvido num certo processo metabólico, com a identificação de compostos alvo através de metabolômica. Estratégias são propostas para aplicar essa informação sobre as populações geradas por ambas as abordagens direta e inversa genética, apesar de nenhum deles é fácil. Por corolário esta abordagem pode também ser usado como uma abordagem para caracterizar picos desconhecidos que representam si novo ou específicametabólitos condary nos tecidos limitados, espécies vegetais ou de tratamento de estresse, que é actualmente o julgamento importante para a compreensão do metabolismo da planta.

Watch this Scientific Journal Video about Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics at JoVE.com

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Combinação de genômica, co-expressão de genes de análise e identificação de compostos-alvo através do metabolismo dar anotação gene funcional.

Anotação da função do gene da planta através de Genômica combinados, metabolômica e Informática

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

19.6K visualizações.  Max-Planck-Institut. Combinação de genômica, co-expressão de genes de análise e identificação de compostos-alvo através do metabolismo dar anotação gene funcional.

Vídeo: Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to particular habitats and management practices. This article shows how certain terroir signatures can be detected in the berry metabolome and transcriptome of the grapevine cultivar Corvina using multivariate statistical analysis. The method first requires an appropriate sampling plan. In this case study, a specific clone of the Corvina cultivar was selected to minimize genetic differences, and samples were collected from seven vineyards representing three different macro-zones during three different growing seasons. An untargeted LC-MS metabolomics approach is recommended due to its high sensitivity, accompanied by efficient data processing using MZmine software and a metabolite identification strategy based on fragmentation tree analysis. Comprehensive transcriptome analysis can be achieved using microarrays containing probes covering ~99% of all predicted grapevine genes, allowing the simultaneous analysis of all differentially expressed genes in the context of different terroirs. Finally, multivariate data analysis based on projection methods can be used to overcome the strong vintage-specific effect, allowing the metabolomics and transcriptomics data to be integrated and analyzed in detail to identify informative correlations.

This article describes the application of untargeted metabolomics, transcriptomics and multivariate statistical analysis to grape berry transcripts and metabolites in order to gain insight into the terroir concept, i.e., the impact of the environment on berry quality traits.

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Genética

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Bioquímica

A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

Recently, a new implementation of a previously described method for interpreting genome-wide association study (GWAS) data using metabolic pathway analysis has been developed and released. The Pathway Association Study Tool (PAST) was developed to address concerns with user-friendliness and slow-running analyses. This new user-friendly tool has been released on Bioconductor and Github. In testing, PAST ran analyses in less than one hour that previously required twenty-four or more hours. In this article, we present the protocol for using either the Shiny application or the R console to run PAST.

By running the Pathway Association Study Tool (PAST), either through the Shiny application or through the R console, researchers can gain a deeper understanding of the biological meaning of their genome-wide association study (GWAS) results by investigating the metabolic pathways involved.

Uma ferramenta de estudo da Associação de Caminhos para análises gwas de informações de via metabólica

Recently, a new implementation of a previously described method for interpreting genome-wide association study (GWAS) data using metabolic pathway ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

Um método de extração multi-Omics para a análise aprofundada de culturas sincronizadas da alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

Biologia do Desenvolvimento

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation of their functions in nature and potential human benefits (e.g., for drug discovery applications) are desired. This protocol describes the combination of genome mining (GM) and molecular networking (MN), two contemporary approaches that match gene cluster-encoded annotations in whole genome sequencing with chemical structure signatures from crude metabolic extracts. This is the first step towards the discovery of new natural entities. These concepts, when applied together, are defined here as MS-guided genome mining. In this method, the main components are previously designated (using MN), and structurally related new candidates are associated with genome sequence annotations (using GM). Combining GM and MN is a profitable strategy to target new molecule backbones or harvest metabolic profiles in order to identify analogues from already known compounds.

A mass spectrometry-guided genome mining protocol is established and described here. It is based on genome sequence information and LC-MS/MS analysis and aims to facilitate identification of molecules from complex microbial and plant extracts.

Mineração de genoma guiada por espectrometria em massa como ferramenta para descobrir novos produtos naturais

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Química

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect and quantify hundreds of thousands of metabolite features. However, the application of these techniques to a large number of samples is subject to more complex interactions, particularly for genome-wide association studies (GWAS). This protocol describes an optimized metabolic workflow, which combines an efficient and fast sample preparation with the analysis of a large number of samples for legume crop species. This slightly modified extraction method was initially developed for the analysis of plant and animal tissues and is based on extraction in methyl tert-butyl ether: methanol solvent to allow the capture of polar and lipid metabolites. In addition, we provide a step-by-step guide for reducing analytical variations, which are essential for the high-throughput evaluation of metabolic variance in GWAS.

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

In this protocol, we present an optimized workflow, which combines an efficient and fast sample preparation of many samples. In addition, we provide a step-by-step guide to reduce analytical variations for high-throughput evaluation of metabolic GWAS studies.

Estudos de associação multi-omics em larga escala (Mo-GWAS): Diretrizes para preparação e normalização de amostras

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Identificação de órgãos primários em plantas medicinais usando marcação de 13C6-glicose

13C6&#45;Glucose Labeling Associated with LC&#45;MS&#58; Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary metabolite in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Paris saponin (PS) has a variety of pharmacological activities and PPY is in increasing demand. This study established leaf, rhizome, and stem-vascular-bundle 13C6-Glucose feeding and non-feeding four treatments to precisely certify the primary organs involved in Paris saponins VII (PS VII) synthesis. By combining liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), the 13C/12C ratios of leaf, rhizome, stem, and root in different treatments were quickly and accurately calculated, and four types of PS isotopic ion peak(M&#8722;) ratios were found: (M+1) &#8722;/M&#8722;, (M+2) &#8722;/M&#8722;, (M+3) &#8722;/M&#8722; and (M+4) &#8722;/M&#8722;. The results showed that the ratio of 13C/12C in the rhizomes of the stem-vascular-bundle and rhizome feeding treatments was significantly higher than that in the non-feeding treatment. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves increased significantly under leaf and stem-vascular-bundle feeding treatments. Simultaneously, compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves under rhizome treatment showed no significant difference. Furthermore, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the stem, root, and rhizome showed no differences among the four treatments. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of the Paris saponin II (PS II) molecule (M+2) &#8722;/M&#8722; in leaves under leaf feeding treatment showed no significant difference, and the (M+3) &#8722;/M&#8722; ratio of PS II molecules in leaves under leaf feeding treatment were lower. The data confirmed that the primary organ for the synthesizing of PS VII is the leaves. It lays the foundation for future identification of the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants.

Autor em destaque: Perfil de órgãos primários de plantas usando marcação de 13C6-glicose e LC-MS

The developed method of 13C6-Glucose labeling combined with liquid chromatography high-resolution mass spectrometry is versatile and lays the foundation for future studies on the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants, as well as the comprehensive utilization of these secondary metabolites.

13C6-Marcação de glicose associada a LC-MS: Identificação de órgãos primários de plantas na síntese de metabólitos secundários

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Anotação da função do gene da planta através de Genômica combinados, metabolômica e Informática

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Uma ferramenta de estudo da Associação de Caminhos para análises gwas de informações de via metabólica

Um método de extração multi-Omics para a análise aprofundada de culturas sincronizadas da alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Mineração de genoma guiada por espectrometria em massa como ferramenta para descobrir novos produtos naturais

Estudos de associação multi-omics em larga escala (Mo-GWAS): Diretrizes para preparação e normalização de amostras

¹³C_6-Marcação de glicose associada a LC-MS: Identificação de órgãos primários de plantas na síntese de metabólitos secundários

¹³C_6-Marcação de glicose associada a LC-MS: Identificação de órgãos primários de plantas na síntese de metabólitos secundários

¹³C_6-Marcação de glicose associada a LC-MS: Identificação de órgãos primários de plantas na síntese de metabólitos secundários

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas