Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde de subvenção (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) a MM. Nosso artigo é parcialmente suportado pelo Carl Zeiss microfilmagem LLC.

Espécies reativas de oxigênio pode ser medido em células vivas usando corantes de oxidação sensíveis (1 e 2) ou usando sensores de plasmídeo (3 e 4) por microscopia confocal. 1. Visualização de citosólica ROS em células J774 <ol><li> Crescer J774.1 rato macrófagos derivados de monócitos (10 6 células / ml) em fundo de vidro de 35 mm pratos (Harvard Apparatus) durante 48 h. </li><li> Células desafio com agonistas TLR (2 mg / ml, Lipo-Teicóicos acid-agonista TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C) TLR3-agonista, 1 mg / ml LPS-agonista TLR4) por 6 horas a 37 ° C. Nota: Os macrófagos tratados em condições semelhantes foram utilizados para co-cultura modelo de Ca 2 + mobilização. </li><li> Adicione o corante de oxidação-sensível H 2 DCF-DA (Invitrogen) para obter uma concentração final de 10 mM em ECM (meio extracelular: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10glucose mM e 2,0% de dextran, pH 7,4; todos obtidos da Sigma) contendo BSA 2% para os pratos e as células incubar por 20 min antes visualização sob microscopia confocal. </li><li> Depois de carregar dye, visualize as células colocadas em um palco temperatura controlada de um sistema de imagem apropriado. Usamos Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal juntamente com fonte de laser de argônio em um íon de excitação de 488 nm para DCF fluorescência usando objetivo de petróleo 40x 13 (Fig. 1A e D). </li><li> Analisar imagens usando software ImageJ (1,44), software disponível gratuitamente a partir do National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, EUA National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. Visualização das operações principais de refinanciamento em células J774 <ol><li> Crescer J774.1 rato macrófagos derivados de monócitos (10 6 células / ml) em fundo de vidro de 35 mm pratos (Harvard Apparatus) durante 48 h. </li><li>Desafio as células com ligantes TLR para induzir OPR de produção (2 mg / ml, Lipo-Teicóicos ácido TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 h, a 37 ° C. </li><li> Adicionar superóxido mitocondrial indicador MitoSOX Red (Invitrogen) para dar uma concentração final de 5 mM em ECM contendo BSA 2% para os pratos e as células incubar por 30 min a 37 ° C para permitir carregamento de MitoSOX Vermelho. </li><li> Depois de carregar dye, visualize as células em um estágio de temperatura controlada de uma lente Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal casal sistema de imagem com Argon fonte de laser de íons em uma excitação de 561 nm para MitoSOX Red fluorescência usando objetiva 40x de óleo (Fig. 1B e E). </li><li> Para os experimentos de controle, depois de carregar adicionar corante PBS ou DMSO (controle negativo) ou Antimicina 2μM A. (Como superóxido mitocondrial de controle do gerador-positivo) para as células antes de a imagem da amostra, conforme descrito em 2.4 (Fig 1C) </li><li> Analisar as imagens usando o software ImageJ (1,44). </li></ol> 3. Visualizatiem citosólica de ROS na estáveis ​​Hyper-cito MPMVECs <ol><li> Usamos pHyPer-cito (Evrogen) uma codificação de vetor de expressão de mamífero uma hiper sensor fluorescente que localiza no citoplasma e especificamente a concentração sentidos submicromolar de H 2 O 2 14. </li><li> Transfectar murino pulmonar células endoteliais microvasculares (MPMVECs) com pHyPer-cito vector usando eletroporação ou reagentes de transfecção. Nós usamos 10 x 10 6 células e transfecção com 10μg de pHyPer-cito via eletroporação usando BioRad Gene pulser sistema electroporator (250V, 500 mF). MPMVECs cultivo em meio DMEM suplementado com 10% FBS, aminoácidos não essenciais, suplemento de crescimento endotelial e antibióticos. Nota: Após transfecção, as células da placa em baixa densidade para facilitar o crescimento da colônia. </li><li> Substituir médio com meio de cultura completo suplementado com 500 mg / ml G418, 48 horas após transfecção. Tela para clones que têm maior percentual de H<html> yper células positivas ea passagem Hiper clones positivos para aumentar o número de hiper células positivas (Fig. 2). Nota: Nós usamos diluição seriada de células para a seleção clonal de células individuais e tela para as células altamente estáveis ​​expressando Hyper. </li><li> Crescer estável Hyper-cito MPMVECs em 0,2% de gelatina lamínulas revestido (80 confluência%). Células dia seguinte desafio com ligantes TLR (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. Células não tratadas servir como controle. </li><li> Após o tratamento, montar as lamelas em Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 1 ml de pré aquecido Hanks solução salina balanceada (HBSS) para a câmara e colocar a câmara em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal sistema de imagem. Visualizar e mudar a imagem de fluorescência de uma excitação de 488 nm usando objetiva 40x de óleo (Fig. 3A e D). </li><li> Analisar imagens usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6). </li></ol>ESIGNAÇÃO &quot;&gt; Visualization 4. mitocondrial de ROS na estáveis ​​Hyper-dMito MPMVECs <ol><li> Usamos pHyPer-dMito (Evrogen) uma expressão de mamíferos vetor de codificação mitocôndrias Hiper-alvo que localiza na concentração sentidos mitocôndria e, especificamente, submicromolar de H 2 O 2. </li><li> MPMVECs transfecção com pHyPer-dMito e gerar estável Hyper-dMito MPMVECs seguintes passos descritos na secção de 3,2-3,3. </li><li> Crescer estável Hyper-dMito MPMVECs em 0,2% de gelatina lamínulas revestido (80 confluência%). </li><li> Células dia seguinte desafio com ligantes TLR (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. Células não tratadas servem como controle negativo. Adicionar Antimicina 2μM A amostra (superóxido mitocondrial controle indutor positivo) antes da visualização. </li><li> Após o tratamento, montar as lamelas em Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 1 ml de solução pré-aquecida de sal equilibrada Hanks (HBSS) para a câmarae colocar a câmara em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal. Visualizar e mudar a imagem de fluorescência de uma excitação de 488 nm usando objetiva 40x de óleo (Fig. 3B, C e E). </li><li> Analisar imagens usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6). </li></ol> 5. Co-cultura modelo para a visualização de parácrinos derivados ROS desencadeada Ca 2 + de sinalização em células endoteliais Para a visualização e medição de [Ca 2 +] i mudanças que usar um Ca 2 + sensíveis corante fluorescente fluo-04:00 (Invitrogen). <ol><li> MPMVECs crescer em 0,2% de gelatina revestidos lamínulas de vidro 25mm (80 confluência%). </li><li> Incubar as células cultivadas em lamínulas em temperatura ambiente por 30 min em ECM contendo BSA 2% e ácido PLURONIC 0,003% com 5 mM fluo-04:00 concentração (Invitrogen) final para permitir carregamento de fluo-04:00. Depois de carregar, lavar as células com uma solução de imaging experimental (ECM contendo 0.25% BSA) contendo sulfinpirazona para minimizar a perda de corante. </li><li> Depois de carregar fluo-4, monte lamínulas para Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 800μl de pré aquecido solução de imagem experimental para a câmara e colocá-lo em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal. </li><li> Em uma etiqueta do tubo separar os macrófagos ativados ou não ativadas isolado de qualquer tipo selvagem ou gp91 phox-/ - ratos (tratados com LPS por 6 hr) com rastreador celular vermelho CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) em ECM contendo BSA 2% e ácido PLURONIC 0,003%. Lavar e ressuspender as células com 200μl de solução de imaging experimental. </li><li> Adicionar macrófagos marcados para fluo-04:00 carregado MPMVECs na montagem de câmara. </li><li> Registre a fluorescência verde e vermelho a cada 3s por 10-20 min usando Carl Zeiss LSM510 Meta sistema de imagem confocal com uma fonte de laser de argônio ion com excitação a 488 e 561 nm para fluo-04:00 e rastreador celular fluorescência vermelha respectively (Fig.4 AC). Nota: Como alternativa, J774.1 linhagem de células poderiam ser usadas para provocar MPMVECs Ca 2 + mobilização. </li><li> Analisar fluo-4 mudanças de intensidade de fluorescência usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6). </li></ol> 6. Análise de dados usando software ImageJ Transferir as imagens obtidas a partir do sistema confocal como um arquivo de formato. Lsm para análise de dados. ZEN ZEN 2009 e 2010, desde software com microscópio LSM 510 Meta ou confocal LSM 710 microscópio confocal multifotônica respectivamente salva os arquivos em formato. Lsm. Recomendamos o uso desse nativo. Lsm arquivos para análise de imagens como a qualidade original é mantida. Este formato de arquivo pode ser diretamente aberto em análise de imagem programa Image J. Os passos seguintes são um exemplo de análise quantitativa de imagem única. Sem plugins adicionais são necessários para a análise desses dados. <ol><li> Lsm. Abertas ou arquivo. TIFF no programa Image J usando FILE&gt; OPEN </li><li> Clique na guia IMAGE&gt; COCANAIS LOR&gt; SPLIT e dividir os canais verde e DIC. Use a imagem do canal verde para análise posterior. </li><li> Dê um duplo clique e selecione o &quot;Elliptical escova seleção tab&quot; e defina o valor de pixels a 20. </li><li> Para o Hyper-cito imagens, clique em uma única célula para definir a área circular de medição. Em seguida, pressione &quot;M&quot; para medir a intensidade da área selecionada. Os valores são mantidos em uma janela de novos resultados. </li><li> Em seguida, segurando &quot;Shift&quot;, clique em uma célula-chave diferentes para selecionar uma outra área, seguido da opção &quot;M&quot;. A intensidade é registrado na janela de resultado. Repita os passos 4-5 na 50 células diferentes. </li><li> Para o Hyper-d mito imagens, defina o valor de pixels a 10 na seleção escova elípticas. Região de interesse (ROI) tem de ser rastreada manualmente incluindo as mitocôndrias das células particular. </li><li> Usando freehand, trace a região de cerca de mitocôndrias e pressione &quot;M&quot;. Repita os passos 6-7 em 50 células diferentes. </li><li> Copie o me<html> valores de uma janela de resultados e cole em uma folha de Excel ou qualquer outro software para plotar os resultados. Usamos tanto SigmaPlot ou GraphPad Prism para plotar os dados como gráfico. </li></ol> 7. Resultados representante A Figura 1 mostra citosólica e mitocondrial de produção ROS após desafio com ligantes TLR. Representante imagens confocal mostram aumento de DCF (citosólicos) e Red MitoSOX (mitocôndrias) fluorescência após 6 horas de estimulação. Mudanças de fluorescência foram normalizados e expressa como alteração fold. A Figura 2 mostra a geração de estável Hyper-cito e Hyper-dMito células endoteliais. Células endoteliais do mouse foram transfectadas com pHyPer-cito ou pHyPer-dMito constrói plasmídeo via eletroporação. Células plasmídeos expressando estavelmente foram selecionados com G418 por duas semanas. Após a seleção, as células diluídas foram semeadas em placas de 96 também. Colônias individuais foram isolados e fotografada para a expressão homogênea. e_content &quot;&gt; Figura 3 mostra a medição da endoteliais citosólica e mitocondrial H 2 O 2 níveis. Representante imagens confocal mostram o aumento do Hyper-cito (citosólicos) e hiper-dMito (mitocôndrias) fluorescência após 6 horas de estimulação. alterações de intensidade de fluorescência foram normalizados e expressa como alteração fold. A Figura 4 mostra a avaliação dos macrófagos derivados de ROS induzida endotelial citosólica Ca 2 + mobilização. LPS-estimulado macrófagos pulmonares foram adicionados em células endoteliais microvasculares (PMVEC) que tinha sido previamente carregado com o Ca 2 + intracelular ([Ca 2 +] i) corante indicador de Fluo-4. Aplicação de tipo selvagem LPS-macrófagos ativados evocou uma [Ca 2 +] i aumento PMVECs que foi atenuada por nocaute de oxidase NADPH funcional (gp91 phox-/ -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Visualizatiem celulares de macrófagos gerada ROS e superóxido mitocondrial. J774.1 células foram desafiados com ligantes TLR2, 3 e 4 (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4). Por 6 h em 37 ° C. Após tratamento as células foram carregadas com (A) celular ROS indicador (H 2 DCF-DA; fluorescência verde) ou (B) O indicador de superóxido mitocondrial (MitoSOX Vermelho; fluorescência vermelha). (C) A Antimicina foi usado como um controle positivo para a produção de ROS mitocondrial. Alterações intensidade de fluorescência foram avaliadas através de microscopia confocal. (D) e (E) A determinação quantitativa da mudança de fluorescência média. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Representação esquemática de geração de expressão estável de citosólica das células endoteliais e indicadores mitocondrial ROS. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. V. isualization da endoteliais citosólica e mitocondrial H 2 O 2 níveis MPMVECs expressar de forma estável (A) Hyper-cito ou (B) Hyper-dMito foram desafiados com TLR2, 3 e 4 ligantes (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg / ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. (C) A Antimicina foi usado como um controle positivo para a produção de ROS mitocondrial. Após o tratamento, alterações de intensidade de fluorescência foram avaliadas através de microscopia confocal. (D) e (E) A determinação quantitativa da mudança de fluorescência média. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Macrófagos derivados de ROS provocar deficiência de células endoteliais Ca 2 + mobilização. (A) Representação esquemática de células endoteliais / estudo do modelo de macrófagos co-cultura. (B), recentemente isolado macrófagos murinos de ambos os WT e camundongos gp91phox nulo (O Laboratório Jackson) foram ativadas por 1 mg / ml LPS por 6 h. Macrophages foram marcados com células-tracker Red (vermelho) e depois acrescentada a Fluo-4 PMVECs carregado (verde) para avaliar parácrina O 2 • -. sinalização (C) LPS-activated macrófagos isolados de camundongos WT desencadeou grandes e rápidas Ca 2 + mobilização PMVECs em comparação com macrófagos de camundongos nulos gp91phox. Validação de ativação de macrófagos tem sido demonstrada anteriormente.

<ol>
	<li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis.">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li><li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes.">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .</li><li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis.">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li><li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release.">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li><li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidants+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing.">Oxidants oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li><li>Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmful+molecular+mechanisms+in+sepsis.">Harmful molecular mechanisms in sepsis.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).</li><li>Sanlioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+Rac1-dependent+reactive+oxygen+species+formation+and+coordinates+tumor+necrosis+factor-alpha+secretion+through+IKK+regulation+of+NF-kappa.">Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa.</a> 276, 30188-30198 (2001).</li><li>Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flux+in+endothelial+cells+via+the+chloride+channel-3+mediates+intracellular+signaling.">Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).</li><li>Vliet, A. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+in+lung+biology+and+pathology:+host+defense+enzymes+and+more.">NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more.</a> Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).</li><li>Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+defense+mechanisms.+The+production+by+leukocytes+of+superoxide,+a+potential+bactericidal+agent.">Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent.</a> J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).</li><li>Lambeth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX+enzymes+and+the+biology+of+reactive+oxygen.">NOX enzymes and the biology of reactive oxygen.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).</li><li>Mukhopadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui permite a medição rápida e quantitativa de espécies reativas de oxigênio em células vivas ou usando corantes de oxidação ou sensores sensíveis plasmídeo. Agonistas de TLRs (Toll-like receptors) são compostos que estimulam as células através dos TLRs presentes na superfície das células e acionar as vias de sinalização a jusante 15. Em nosso protocolo, usamos três diferentes TLR viz agonistas, Lipo-Teicóicos acid-agonista TLR2; Poly (I: C). TLR3-agonista; LPS-TLR4 agon...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Attofluor câmara de celular </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> A Antimicina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM baixa glicose </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> Suplemento de fator de crescimento endotelial (ECGS) </td><td> Norte do estado </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Red </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM eu Redução Médio de soro </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer-cito </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poli (I: C) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Prism software 5,0 </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11,0 </td><td> Systat software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 Frascos </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T-75 Frascos </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96-T bemC micro placa bem </td><td> BD Falcon </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Zen software 2009 </td><td> Carl Zeiss 510 microscopia confocal Meta </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

O estresse oxidativo tem sido implicado em uma série de condições patológicas, incluindo isquemia / reperfusão e sepse danos. O conceito de estresse oxidativo refere-se a formação aberrante de ROS (espécies reativas de oxigênio), que incluem O 2 • -, H 2 O 2, e radicais hidroxila. Espécies reativas de oxigênio influencia uma grande variedade de processos celulares, incluindo transdução de sinal, a proliferação celular e morte celular 1-6. ROS têm o potencial de dano vascular e células de órgãos diretamente, e pode iniciar reações químicas secundárias e alterações genéticas que acabará por resultar em uma ampliação do dano tecidual inicial ROS-mediada. Um componente-chave da cascata de amplificação que agrava prejuízos irreversíveis é o recrutamento e ativação de células inflamatórias circulantes. Durante a inflamação, as células inflamatórias produzem citocinas como fator de necrose tumoral α (TNF) e IL-1, queativam as células endoteliais (CE) e células epiteliais e aumentar ainda mais os 7 resposta inflamatória. Disfunção endotelial vascular é uma característica estabelecida de inflamação aguda. Macrófagos contribuir para a disfunção endotelial durante a inflamação por mecanismos que permanecem obscuros. Ativação de macrófagos resulta na liberação extracelular de O 2 • - e várias citocinas pró-inflamatórias, o que desencadeia a sinalização patológicos nas células adjacentes 8. Oxidases NADPH são a principal fonte primária de ROS e na maioria dos tipos de células. Recentemente, ele é mostrado por nós e outros 9,10 que ROS produzidos por oxidases NADPH induzir a produção de ROS mitocondrial durante muitas condições fisiopatológicas. Daí a medição da produção de ROS mitocondrial é igualmente importante, além de medir citosólica ROS. Macrófagos produzem ROS pela oxidase NADPH flavoproteína enzima que desempenha um papel fundamental na inflamação. Uma vez ativado,NADPH oxidase fagocítica produz grandes quantidades de O 2 • - que são importantes no mecanismo de defesa hospedeiro 11,12. Embora parácrinos derivados de O 2 • - desempenha um papel importante na patogênese de doenças vasculares, visualização de parácrina ROS induzida pela sinalização intracelular, incluindo Ca 2 + mobilização ainda é hipótese. Nós desenvolvemos um modelo em que macrófagos ativados são usados ​​como uma fonte de O 2 • - para transdução do sinal para as células endoteliais adjacentes. Usando esse modelo, demonstramos que macrófagos derivados de O 2 • - levar ao cálcio sinalização em células endoteliais adjacentes.

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Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Um método eficiente para obter insights sobre visualizando o parácrinos derivados de indução de ROS endotelial sinalização de Ca2 + é descrito. Esse método leva vantagem de medir parácrina ROS derivados provocou mobilização de Ca2 + em células endoteliais vasculares em um modelo de co-cultura.

Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

visualization-vascular-ca2-signaling-triggered-paracrine-derived

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Biology

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

15.4K visualizações.  Temple University. Um método eficiente para obter insights sobre visualizando o parácrinos derivados de indução de ROS endotelial sinalização de Ca2 + é descrito. Esse método leva vantagem de medir parácrina ROS derivados provocou mobilização de Ca2 + em células endoteliais vasculares em um modelo de co-cultura.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Biologia

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

A perfusão DiI como método de visualização vascular em<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells downstream of pattern recognition receptors. Best studied are the Dectin-1 and Dectin-2 members of the C-type lectin-like receptor family that induce a SYK- and CARD9-dependent signaling cascade leading to NF-&#954;B activation, in a MALT1-dependent manner. By contrast, Toll-like receptors (TLR), such as TLR-4, propagate NF-&#954;B activation but signal via an MYD88/IRAK-dependent cascade. Nonetheless, whether MALT1 might contribute to TLR-4 signaling has remained unclear. Recent evidence with MLT-827, a potent and selective inhibitor of MALT1 paracaspase activity, indicates that TNF- production downstream of TLR-4 in human myeloid cells is independent of MALT1, as opposed to TNF- production downstream of Dectin-1, which is MALT1 dependent. Here, we addressed the selective involvement of MALT1 in pattern recognition sensing further, using a variety of human and mouse cellular preparations, and stimulation of Dectin-1, MINCLE or TLR-4 pathways. We also provided additional insights by exploring cytokines beyond TNF-, and by comparing MLT-827 to a SYK inhibitor (Cpd11) and to an IKK inhibitor (AFN700). Collectively, the data provided further evidence for the MALT1-dependency of C-type lectin-like receptor &#8212;signaling by contrast to TLR-signaling.

MALT1 regulates innate immunity but how this occurs remains ill-defined. We used the selective MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 to unravel the contribution of MALT1 to innate signaling downstream of Toll-like or C-type lectin-like receptors, demonstrating that MALT1 regulates the production of myeloid cytokines, and downstream of C-type lectin-like receptors, selectively.

Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...