Assim, o objetivo do método em nosso manuscrito é fornecer análise comparativa de vias de sinalização em células mielóides usando sistemas humanos e de camundongos. Ele ajuda a definir qual caminho de sinalização está envolvido a jusante de receptores de reconhecimento de padrão selecionados. Portanto, este método é simples de implementar.
Conta com preparações celulares primárias e compostos de referência validados, o que é essencial para a elucidação de mecanismos de sinalização. Demonstrando o procedimento serão Ratiba Touil e Adeline Unterreiner, respectivamente cientista e pesquisador associado em nosso grupo. Em um capô de fluxo laminar, um par de tesouras estéreis, um béquer de um litro e um saco plástico.
Coloque o casaco de polimento previamente obtido no béquer e use a tesoura para abri-la cuidadosamente. Utilizando uma pipeta de 25 mm adicione 100 ml de PBS suplementado com 2 mililitros de EDTA. Misture lentamente pipetting para cima e para baixo.
E então transfira 25 ml do casaco de buffy diluído em seis tubos de centrífuga cônica de 50 ml que foram pré-preenchidos com 15 ml de gradiente de densidade à base de polissacarídeo. Centrifugar os tubos por 20 minutos a 800 g com aceleração moderada sem a ruptura para permitir a separação das células com base em suas densidades. Após a centrifugação três camadas serão visíveis, uma pelota contendo glóbulos vermelhos e granulócitos, uma camada superior feita de plasma, e um anel branco contendo adegas mononucleares de sangue periféricos.
Use uma pipeta de 10 ml para colher os anéis PBMC e transferi-los para um novo tubo de 50 ml. Cubra com PBS e EDTA. Realize três lavagens sucessivas com diminuição do tempo de centrifugação e velocidade, conforme descrito no protocolo de texto.
Após a lavagem final, resuspenque a pelota em 25 ml de tampão de lise gelada para lise os glóbulos vermelhos por pressão osmótica. Incubar a solução à temperatura ambiente até ficar clara. Em seguida, adicione 25 ml de tampão de separação para parar a reação.
Centrifugar a 150 g por oito minutos para lavar a solução. Despeje o supernatante e resuspense a pelota com tampão de separação. Depois de contar as células, dilui-as em meio de cultura até 12.500 células por poço.
Distribua 30 ml desta suspensão celular em cada poço de uma placa de 384 poços. Em seguida, adicione 15 microliters de quatro vezes soluções compostas concentradas a cada poço e pré-insinuque a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Se desejar, adicione LPS à concentração final de 1 ng por ml ou zymosan esgotado a uma concentração final de 100 mcg por ml.
Em seguida, incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, pegue 10 microliters do supernante para medir os níveis alfa TNF secretos. Para iniciar a diluição seriada, diluir a solução de estoque MLT-827 com média para atingir uma concentração de 8 micromolar de uma só vez.
Realize uma diluição serial de seis etapas 1:5 utilizando meio com DMSO de 0,08%. Para se preparar para testes de dose única, diluir o MLT-827, AFN700 e composto 11 soluções de estoque com média para atingir uma concentração de 4 micromolar de uma só vez. Primeiro, adicione 2 ml de água endotoxina estéril a 10 mg de Zymosan esgotado.
Vórtice esta solução de estoque para homogeneizá-lo. Aliquot a solução e, em seguida, armazene as alíquotas a 20 graus Celsius. Neste estudo, pbmcs humanos e células de baço de rato são estimulados com zymosan esgotado, um agonista Dectin-1, ou lipopolysaccarídeo, um agonista TL4.
A liberação alfa NTNF no supernante é medida após 20 horas. Tanto no ser humano quanto no mouse, o composto MLT-827 bloqueia seletivamente a produção alfa TNF impulsionada pela via Dectin-1, mas não pela via TLR4. Em monócitos estimulados com LPS, a produção de TNF alfa é quase completamente revogada pelo AFN700, mas não é sensível ao Cpd11, que é consistente com a dependência da via TLR4 na atividade NF-kappa B e sua independência na atividade sic.
Em contraste, a produção alfa TNF impulsionada por Dectin-1 e MODCs mostra sensibilidade a MLT-827, AFN700 e Cpd11. Isso fornece mais evidências para o envolvimento de uma cascata de sinalização SIC CBM na via Dectin-1. A produção de BETA IL-1, IL-6 e IL-23 também é sensível aos três inibidores, indicando mecanismos regulatórios semelhantes ao TNF alfa.
No entanto, o efeito limitado visto na produção do IL-8 sugere que esta citocina tem um mecanismo regulatório distinto. Elevar as concentrações de Trehalose-dibehenate acima de 50 mcg por ml leva à produção de TNF alfa, IL-6 e BETA-1, que dependiam da atividade paracaspase MALT1 de acordo com o efeito de bloqueio do MLT-827. Resultados semelhantes foram vistos ao desafiar os MODCs com concentrações crescentes de Zymosan esgotado para estimular o Dectin-1.
Este método possibilitou mostrar que o paracaspase MALT1 regula seletivamente a sinalização do receptor tipo C lectina. É essencial usar compostos de referência bem caracterizados. Preste atenção ao procedimento para a diluição das soluções de estoque.
Isso é fundamental para composto com solubilidade limitada.
