Este trabalho foi financiado pelo Office of Naval Research via EUA Naval Research Laboratory fundos básicos.

1. Sondas LNA &amp; design experimental <ol><li> Sondas de design LNA que são o complemento reverso de seu sRNA transcrito / mRNA ou tê-los personalizados em <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Se estiver usando a opção de design personalizado, você vai saber a seqüência, mas não o padrão spiking LNA. A adição de cada resíduo LNA em um DNA ou RNA resultados oligonucleotídeo em um aumento na T m de entre dois e 10 ° C por um duplex de hibridização LNA-RNA 14. Idealmente, as sondas LNA projetado deve ser entre 20-25 nucleotídeos de comprimento (mais sondas são mais difíceis de sintetizar) e ter um T m de entre 85-90 ° C para a RNA hibridização. </li><li> Depois de projetar a seqüência, use BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ou comparar a seqüência de sonda para o seu banco de dados local para garantir a sonda é específico apenas para o seu sRNA / mRNA do interesse. </li><li>Ao encomendar a sonda LNA, adicione uma modificação biotina-TEG para terminar a 5 &#39;do oligonucleotídeo LNA. O Biotinilação é necessário para o pós-coloração hibridização com um conjugado de estreptavidina-dye. É possível adicionar esta modificação para a extremidade 3 &#39;, se necessário, mas a adição à extremidade 5&#39; é menos caro e deve resultar em rendimentos mais elevados. </li><li> Três controles negativos devem ser incluídos no método: (i) um controle &quot;não LNA&quot;, no qual uma sonda LNA não é adicionado durante a etapa de hibridização, (ii) um controle &quot;não dye&quot;, na qual a sonda LNA é hibridizada com o alvo sRNA mas o evento de hibridização não é detectado, devido à ausência da mancha fluorescente, e controle (iii) &#39;mRNA sRNA não-expresso /&#39; a que utiliza uma sonda LNA que tem como alvo um sRNA inexistente ou não-expresso, a fim para monitorar a hibridação não específica. </li><li> A sonda LNA específico aqui é complementar à CsrB sRNA e tem a seqüência 5&#39;-biotina-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(monômeros LNA emletras maiúsculas). </li><li> Após a recepção do LNA liofilizado, ressuspender com nuclease-free de água a 50 mcg / mL e armazenar em 10-20 mL alíquotas a -20 ° C. </li></ol> Soluções <ul><li> 8% paraformaldehye (PFA), 10% de ácido acético em PBS: Misture 1 mL pfa 32%, 400 mL de ácido acético, 400 mL PBS 10X, pH = 7,4 e 2,2 mL de água nuclease-free. Para alíquotas congeladas, congelar em alíquotas de uso único a -20 ° C sem ácido acético. </li><li> 60% solução de sulfato de dextran: adicionar 6,0 g de sulfato de dextran a um tubo cônico de 50 mL e adicionar água a um volume final de 10 mL. Aqueça esta mistura a 65 ° C em banho-maria até que o sulfato de dextran é dissolvido (pode demorar 1-2 horas). Água adicional pode precisam ser adicionados durante o processo de solubilização para manter um volume de 10 mL. Alíquota da solução de sulfato de dextran 60% e armazenar a -20 ° C até o uso. </li></ul> 2. Fixação <ol><li> Colheita 1x10 8 células de bioluminescent <em&gt; Vibrio campbellii ou suas bactérias de interesse e transferi-los para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Esta quantidade de células fornece bastante material de partida para quatro fluxo-FISH amostras (uma amostra de sonda específica LNA e três controles negativos). Adicional de 1,5 mL alíquotas tubo de microcentrífuga devem ser colhidas se outras sRNA / mRNA espécies precisam ser testados. </li><li> Agregar as células bacterianas por centrifugação a 2300 xg por cinco minutos. Descartar o sobrenadante por pipetagem e ressuspender as células em 400 mL de 1X PBS. </li><li> A esta mistura, adicione 400 mL de uma paraformaldehye 8% (PFA) e 10% de ácido acético em solução salina tamponada com fosfato de 1X (1X PBS) solução, misture bem e incubar por 10 minutos a 25 ° C a mistura uma vez depois de cinco minutos. Todas as incubações, salvo indicação em contrário, são executadas em um suporte para tubo aquecido. A solução pfa devem estar preparados frescos ou utilizados a partir de alíquotas congeladas após a adição de ácido acético. Paraformaldeído é um fixador de reticulação que hELPS para preservar a morfologia das células e reter RNA intracelular. </li><li> Agregar as células a partir desta mistura por centrifugação a 4500 xg por dois minutos e remover o sobrenadante por pipetagem. Todos os passos futuros que requerem centrifugação deve usar as mesmas configurações (7K, 2 min). É importante notar que após a centrifugação sobrenadantes deve ser removido por pipetagem e não de decantação. </li><li> Lave as células duas vezes com 400 mL PBS 1X e ressuspender o pellet celular final, em 400 mL PBS 1X. As células são fixos e podem ser armazenados a 4 ° C em 400 mL 1X PBS por até sete dias. </li></ol> 3. Dietil tratamento pyrocarbonate <ol><li> Prepare 400 mL de uma solução 0,1% de dietil pyrocarbonate (DEPC) em 1X PBS (400 mL desta solução é necessário para cada amostra a ser testada assim que a escala em conformidade). A solução DEPC deve ser preparado a partir de um estoque DEPC. Tratamento DEPC inativa RNases por carbethoxylation e diminui asinal de fundo. </li><li> Adicionar 400 mL da solução 0,1% DEPC para cada amostra de células bacterianas fixa e misture bem por pipetagem. Incubar esta mistura a 25 ° C por 12 minutos. Lave as células duas vezes com 400 mL de 1X PBS, agregar as células (7K, 2 min) e remover o sobrenadante. </li></ol> 4. Permeabilização <ol><li> Adicionar 1,0 mg de lisozima a 1 mL tampão Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) para uma solução de 1,0 mg / mL. Esta solução deve ser preparada. Adicionar 800 mL da solução de lisozima 1 mg / mL para as células, misture bem por pipetagem e incubar a 25 ° C por 30 minutos com a mistura ocasional. Agregar as células (7K, 2 min) e remover o sobrenadante. Lisozima atua como um reagente permeabilização hidrolisando o presente peptidoglicano na parede celular bacteriana. </li><li> Prepare uma solução de 3,0 mg / mL de proteinase K em tampão TE. Esta solução deve ser preparada a partir de um mg / mL proteinase K 20 ações que está armazenada a -20 ° C.Proteinase K é uma serina protease que digere uma variedade de proteínas e ajuda a acessibilidade das sondas e reagentes para o RNA. </li><li> Adicionar 800 mL de 3,0 mcg / mL proteinase K solução para o pellet celular e misture bem por pipetagem. Incubar a 25 ° C por 15 minutos com vortex no meio da incubação. </li><li> Agregar as células (7K, 2 min), remover o sobrenadante e lavar as células uma vez com 400 mL PBS 1X. Depois de remover o sobrenadante lavagem, ressuspender as células em 400 mL PBS 1X e adicionar 100 mL da ressuspensão em quatro novos tubos de 1,5 mL de microcentrífuga. Agregar as células (7K, 2 min) e remover o sobrenadante. </li></ol> 5. Hibridização <ol><li> Preparar 100 mL de tampão de hibridação (HB) para cada amostra. O HB é composta de formamida 50% em volume, 10% sulfato de dextran em massa (acrescente 16,7 mL da solução 60% de sulfato de dextran para cada mL 100), a solução de 1X Denhardt, 50 mM fosfato de sódio pH 7,0,Citrato de sódio 2X (SSC), 20 mg de DNA cortado salmão esperma (SADE) e 20 g de fermento tRNA. </li><li> Cada um dos componentes do HB tem uma finalidade diferente. Formamida reduz a temperatura de fusão do ácido nucléico duplexes contribuindo com a desnaturação do RNA e minimizando os danos celulares. Sulfato de dextrano é usado como um volume de exclusão de polímero de concentrar a sonda e aumentar a taxa de hibridação. Solução Denhardts, levedura e tRNA SSSD servir de agentes bloqueadores para reduzir a ligação não específica. </li><li> Em cada uma das células-ressuspensão contendo 1,5 mL tubos de microcentrífuga, adicionar 95 mL HB e 5,0 mL da sRNA / mRNA específicos LNA [20 pmol de concentração LNA específicos final] ou água (para o controle LNA não negativo). Por exemplo: <ol class="lalpha"><li> Tubo 1-95 HB mL + 5,0 mL sRNA / sonda mRNA específicos </li><li> Tubo de 2-95 mL HB + 5,0 mL sRNA / sonda mRNA específicas (controle negativo &quot;não dye &#39;) </li><li> Tubo de 3-95 mL HB + 5,0 mL sRNA/ MRNA sonda (&quot;não-expresso sRNA / mRNA &#39;controle negativo) </li><li> Tubo de 4-95 mL HB + 5,0 mL de água (controle &quot;não LNA&quot; negativo) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Incubar todas as quatro amostras a 60 ° C por 60 minutos. A temperatura de hibridização depende da sonda LNA (s) T m e deve ser fixado em aproximadamente 30 ° C abaixo do previsto T m de RNA de recozimento. Tanto a temperatura de hibridização elevado e formamida na HB garante a desnaturação da estrutura secundária do mRNA sRNA ou de interesse. </li></ol> 6. Pós-hibridação lava <ol><li> Após a hibridização, adicionar 1,0 mL 0,1 x SSC com 0,1% tween-20 (SSCT) para a mistura de hibridização. Isto é necessário para permitir que as células a serem removidas da solução de hibridização viscoso. Agregar as células (7K, 2 min) e remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar 200 mL de formamida 50%, 2X SSC, 0,1% tween-20 para as pelotas de células, misturar bem e incubcomeu durante 30 minutos a 65 ° C em um bloco de aquecimento. </li><li> Adicione 1 mL 0,1 x SSCT à mistura, agregar as células (7K, 2 min) e remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 mL SSCT 0,1 x para ressuspender as células e incubar por 40 minutos a 65 ° C em um bloco de calor. Agregar as células (7K, 2 min) e remover o sobrenadante. </li></ol> 7. Bloqueio e coloração <ol><li> Preparar o tampão de bloqueio (BB) e da solução de coloração estreptavidina-dye. Prepare uma solução de 1X BB a partir de um estoque de 5X (comercialmente disponíveis, consulte Reagentes). Para cada conjunto de quatro tubos, prepare 1,2 mL 1X BB. </li><li> Adicionar 200 mL BB 1X para as pelotas de células, ressuspender e incubar por 30 minutos a 25 ° C. </li><li> Um corante estreptavidina conjugada é usado para detectar as sondas biotiniladas LNA. Enquanto bloqueia, prepare uma solução de 2 mg / mL DyLight 488 estreptavidina ou o seu desejado conjugado estreptavidina-dye em 1X BB por 30 min (para três amostras, fazer 300 mL). </li><li> Depois incubation com 1X BB, agregar as células (7K, 2 min) e remover o sobrenadante. Adicionar 50 mL da solução de estreptavidina-dye para o pellets de células, misturar bem e incubar por 12 minutos a 25 ° C, com mistura constante em um vórtice ou em um Thermomixer. Para o controle &quot;não dye &#39;, adicionar 50 mL tampão 1X bloqueio apenas. Para o resto do protocolo, proteger os tubos de luz usando uma folha de alumínio. </li><li> Lave as células uma vez com 500 mL de buffer SSCT 0,1 x e uma vez com 400 mL 1X PBS com 0,1% tween-20 (PBST). Agregar as células (7K, 2 min) e remover o sobrenadante. </li><li> Após a coloração estreptavidina-conjugado inicial, o sinal é amplificado através da introdução de um anticorpo anti-estreptavidina biotina para o conjugado estreptavidina-dye e coloração pela segunda vez com a estreptavidina-dye, aumentando assim a saída do sinal por hybridized LNA sonda (Figura 2) . </li><li> Adicionar 100 mL de 1 mg / mL biotinilado anti-estreptavidina anticorpos em 1X PBS, resuspend as células, e incubar a 25 ° C por 30 minutos com a mistura ocasional. Agregar as células (7K, 2 min), remover o sobrenadante e lavar duas vezes com 400 mL PBST 1X. </li><li> Adicionar 50 mL da 2 mg / ml de solução de estreptavidina-dye para as células, misturar bem e incubar por 12 minutos a 25 ° C, com mistura constante em um vórtice ou em um Thermomixer. Para o controle &quot;não dye &#39;, adicionar 50 mL tampão 1X bloqueio apenas. </li><li> Lave as células uma vez com 500 mL de buffer SSCT 0,1 x e uma vez com 400 mL PBST 1X. </li><li> Ressuspender as células em 200 mL 1X PBST e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para análise de citometria de fluxo. Para menores células bacterianas definir a taxa de fluxo para retardar para diminuir o tamanho do núcleo. Além disso, para citómetros de fluxo com cortes limite para a frente de dispersão, o corte deve ser definido o mais baixo possível para garantir a pequenas células bacterianas são detectados. </li><li> Para detecção DyLight 488, o citômetro de fluxo deve ser equipado com um laser de 488 nm e emissão padrãofiltros para FITC. Pelo menos 2x10 4 eventos deverão ser recolhidos. Para compatibilidade com citómetros de fluxo equipado com lasers diferentes, outras estreptavidina conjugada fluoróforos pode ser usado para este protocolo. </li></ol> 8. Resultados representativos Um exemplo de células que são fixadas e permeabilizadas efetivamente é mostrada no gráfico de pontos de citometria de fluxo na Figura 3A. Ao usar as condições descritas acima para permeabilização, a população de células é pequena e homogênea, indicando alguns agregados celulares. Quando maior (5 mg / mL) as concentrações de lisozima são usados, as células são mais propensos a agregar e mostrar os valores de dispersão aumentou para a frente, indicativos de partículas maiores (Figura 3B). Um exemplo de dados de citometria de fluxo a partir de uma bem sucedida experiência de fluxo LNA-FISH é mostrado na Figura 4. O histograma demonstra a detecção específica de um sRNA alvo, juntamente com três controles negativos.O controle &quot;não dye&quot; negativo produz o mínimo de fluorescência, seguido pelo &quot;não LNA &#39;e&#39; não-expresso sRNA&quot; controles negativos. Finalmente, a amostra com o sRNA específicos LNA sonda produz a maior fluorescência. Depois que o método e sondas LNA são validados desta forma, experimentos adicionais podem ser projetados para monitorar as alterações no sinal sRNA ao longo do tempo, em resposta às mutações ou condições de cultura variada, etc <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Figura 1. Representação do esquema geral de uma experiência de fluxo LNA-FISH para a detecção de sRNA bacteriana. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Figura 2. Coloração e amplificação do sinal de fluxo LNA-FISH. a) Hibridação da sonda LNA biotinilado. b) A coloração fluorescente com o DyLight conjugado de estreptavidina 488. c) Vinculação da biotinilado anti-streptavidin de anticorpos para a estreptavidina 488 DyLight. O anticorpo pode se ligar estreptavidina através de seu site de ligação de antígenos ou pode ser ligado por estreptavidina através de seus resíduos biotina. d) A amplificação do sinal através da coloração ainda mais com as fluorescentes DyLight conjugado de estreptavidina 488. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Figura 3. Parcelas Citometria de fluxo dot mostrando um lado versus resultados de dispersão para a) 1 mg / mL de lisozima, 3 mg / mL proteinase K permeabilização e b) 5 mg / mL de lisozima, 3 mg / ml proteinase K permeabilização. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Figura 4. Histograma análise do fluxo de FISH-LNA resultados. O sinal fluorescente gerada a partir de cada amostra é mostrado pelos quatro traços: preto - sRNA específicos LNA sonda; vermelho - controle negativo &quot;não expressa sRNA &#39;; azul - controle negativo&#39; no LNA; roxo -Controle &quot;não dye &#39;negativo.

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Os autores não têm nada a revelar.

O método do fluxo de LNA-FISH apresentada aqui foi usado para detectar a expressão de um sRNA do Gram-negativos marinhos bactéria Vibrio campbellii cuja expressão já havia sido confirmado através de microarray baseado em perfis de expressão e transcrição reversa reação em cadeia da polimerase 16. Até o momento, têm utilizado este método para monitorar a expressão de uma variedade de RNAs (por exemplo, trans-codificado sRNA, sRNA que modulam a atividade de proteína, riboswitches e mRNA). Como tal, estamos confiantes de que o método é adaptável e pode ser usado para detectar qualquer alvo sRNA ou mRNA e podem ser modificados para utilização em qualquer espécie bacteriana ou tipo de célula. Se a modificação deste protocolo é necessário para outros tipos de células, a variável mais importante a considerar é o passo manipular permeabilização. Por exemplo, ao modificar as condições de permeabilização aqui descritos, as mudanças nas concentrações de lisozima e proteinase K deve ser testado. Descobrimos que duplicar outriplicando a quantidade de lisozima e proteinase K resultou em mudanças importantes no fluxo de FISH-LNA resultados. Além disso, quando testar as condições de permeabilização adicionais, as células devem ser analisados ​​para a aglomeração, a perda de células, e obter o melhor sinal à relação de fundo de fluorescência. A extensão da aglomeração de células podem ser testadas por microscopia e / ou citometria de fluxo. Por citometria de fluxo, aglomerados de células estão presentes como caudas em uma frente contra trama lado dot dispersão eo método de permeabilização correta minimizar esse efeito de rejeitos. Este método também é passível de detecção multiplex sRNA sem grandes modificações com o protocolo descrito como sondas adicionais LNA rotulados com haptenos, tais como digoxigenina poderia ser adicionado durante a etapa de hibridização e, então, detectado com um anticorpo anti-digoxigenina conjugado anticorpo e fluoróforo-secundário. Atualmente, a única limitação que encontramos com este método é a sua incapacidade para gerar sinal suficiente fracamente exespécies sRNA pressionado e esforços estão sendo feitos para determinar o limiar de detecção (em número absoluto de cópia por célula). No geral, o método do fluxo de FISH LNA oferece a oportunidade de medir sRNA bacteriana ou expressão de mRNA no único nível de célula de uma forma de alto rendimento para fornecer insights sobre a presença e abundância relativa de uma espécie sRNA eo grau em que sua expressão varia em uma população.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Fosfato 10X solução salina tamponada (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease água livre de </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (Não tratada DEPC) </td></tr><tr><td> Paraformaldeído 32% </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> RT 15714 </td><td> Etanol livre </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Dietil pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Mantenha desidratado </td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / mL) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Alíquota, deionizada e freeze </td></tr><tr><td> Sulfato de dextrano MW&gt; 500000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Solução alíquota de 60% e congelar </td></tr><tr><td> Solução Denhardt nos concentrar 50X </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Alíquotas e congelar </td></tr><tr><td> Tampão de citrato de sódio 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; DNA de esperma de salmão (cortado) 10 mg / mL </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Alíquotas e congelar </td></tr><tr><td> TRNA de levedura (10 mg / mL) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Alíquotas e congelar </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5X em solução de hibridização in situ bloqueio </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 estreptavidina </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado anti-estreptavidina </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Alíquotas e congelar </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Hibridização fluorescente in situ (FISH) é uma poderosa técnica que é usada para detectar e localizar seqüências específicas de ácidos nucleicos no ambiente celular. A fim de aumentar o rendimento, FISH pode ser combinado com a citometria de fluxo (fluxo FISH) para permitir a detecção de alvo sequências de ácidos nucleicos em milhares de células individuais. Como resultado, o fluxo de FISH oferece uma vantagem distinta sobre lisado / ensemble com base em métodos de detecção de ácidos nucleicos, porque cada célula é tratada como uma observação independente, permitindo assim mais forte análises estatísticas e variância. Esses atributos têm solicitado o uso de métodos FISH e fluxo de FISH em um número de diferentes aplicações ea utilidade desses métodos tem sido demonstrado com sucesso em telomere determinação identificação 1,2 comprimento, celular e expressão gênica 3,4, monitoramento de multiplicação viral em células infectadas 5, e análise da comunidade bacteriana e enumeração6. Tradicionalmente, a especificidade dos métodos de FISH e fluxo de FISH tem sido transmitida por sondas de oligonucleotídeos de DNA. Recentemente, no entanto, a substituição de sondas de DNA oligonucleotídeo com análogos de ácidos nucléicos como sondas FISH FISH e fluxo tem aumentado a sensibilidade e especificidade de cada técnica devido às altas temperaturas de fusão (T m) destes análogos de ácidos nucléicos naturais 7,8 . Bloqueado ácidos nucleicos (LNA) sondas são um tipo de ácido nucléico analógicos que contêm nucleotídeos LNA spiked ao longo de um DNA ou RNA seqüência 9,10. Quando acoplado com fluxo de FISH, sondas LNA já foi mostrado para outperform sondas de DNA convencional 7,11 e tem sido utilizado com sucesso para detectar mRNA eucarióticas 12 e RNA viral em células de mamíferos 5. Aqui nós expandir essa capacidade e descrever um método de fluxo de LNA FISH, que permite a detecção específica de RNA na célula bacterianas (Figura 1). Especificamente, estamos interessados ​​na detecção de pequenos não-codificantes reguladoras RNA (sRNA), que têm atraído um interesse considerável nos últimos anos, pois foram encontrados para servir como elementos reguladores-chave em muitos processos celulares críticos 13. No entanto, existem ferramentas limitadas para estudar sRNAs e os desafios de detectar sRNA em células bacterianas é devido em parte ao tamanho relativamente pequeno (tipicamente 5-30 nucleotídeos de comprimento) e baixa abundância de moléculas sRNA, bem como a dificuldade geral em trabalhar com menor células biológicas com diferentes membranas celulares. Neste método, descrevemos fixação e permeabilzation condições que preservam a estrutura das células bacterianas e permitir a penetração de sondas LNA, bem como as etapas de amplificação de sinal que permitem a detecção específica de baixa abundância sRNA (Figura 2).

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Um método high-throughput romance é descrito que permite a detecção e quantificação relativa de RNA pequeno e expressão do RNAm da única células bacterianas usando bloqueado sondas de ácidos nucléicos e citometria de fluxo por fluorescência<em&gt; In situ</emHibridização&gt;.

Fluxo de ácido nucléico bloqueado Citometria de fluorescência In situ Hibridação (LNA fluxo FISH): um método para detecção de RNA bacteriano Pequenas

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

locked-nucleic-acid-flow-cytometry-fluorescence-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

25.2K visualizações.  Naval Research Laboratory. Um método high-throughput romance é descrito que permite a detecção e quantificação relativa de RNA pequeno e expressão do RNAm da única células bacterianas usando bloqueado sondas de ácidos nucléicos e citometria de fluxo por fluorescência In situ.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Imunologia e Infecção

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

Transfecção e Mutagênese de genes alvo em células de mosquito por Locked de ácido nucléico modificados Oligonucleotídeos

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent &#39;Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV models are limited to hepatoma cell lines (such as HepG2 and Huh7) overexpressing a functional HBV receptor, sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP). Here, we used 293T-NE-3NRs (293T&#160;overexpressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) as model cell lines.&#160;HBV infection in these cell lines was performed either by using concentrated HBV virus particles from HepG2.2.15 or co-culturing HepG2.2.15 with the target cell lines. HBcAg immunofluorescence for HBcAg was performed to confirm HBV infection. The two methods presented here will help us study HBV infection in non-hepatic cell lines.&#160;&#160;

This manuscript describes a detailed protocol for Hepatitis B virus (HBV) infection in novel engineered 293T cells (293T-NE-3NRs, expressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and traditional hepatic cells (HepG2-NE, expressing human NTCP).

Modelagem da infecção por vírus da hepatite B em células não hepáticas 293T-NE-3NRs

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

Um pequeno RNA não codificante MicC contribui para a virulência em proteínas da membrana externa em Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...