Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação. Apoio adicional foi fornecido por NIDCD 5R01 DC007613.

1. Dissecção utrículo e Cultura <ol><li> Euthanize um adulto (4 semanas de idade ou mais velhos) do mouse através de um protocolo aprovado e decapitar. </li><li> Cortar o canal auditivo externo em ambos os lados da cabeça e puxar a pele para a frente para o nariz. Bisect a cabeça de trás para a frente e retirar o cérebro de ambos os lados para revelar o labirinto ósseo. </li><li> Aparar o crânio para longe da cóclea óssea e transferir o labirinto ósseo (incluindo a bolha) para um capuz de cultura de tecidos equipado com um microscópio de dissecação (Nota: Adenovirus trabalho deve ser realizado numa câmara de segurança biológica Classe II). </li><li> Na capa, transferir cada cóclea para um prato de 35 milímetros de cultura de tecidos contendo estéreis meios de dissecção (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Figura 1A). </li><li> Se a bula auditiva ainda está intacto (é possível remover a bolha durante a dissecção macroscópica, inserindo o seu polegar entre a bula eo ápice doa cóclea), utilizar duas pinças (um # 3 e # 5 um) para quebrar a bolha (Figura 1B). </li><li> Identificar os marcos da preparação cóclea óssea: ápice, base, ossículos, janelas oval e redonda, VIII raiz nervosa, canais semicirculares (Figura 1 C, D). </li><li> Colocar o ouvido interno no prato com o lado medial voltada para cima, de tal modo que as janelas oval e redonda e ápice estão na parte inferior do prato ea raiz do nervo VIII está virada para cima. Mantenha a preparação usando um # 3 fórceps na região dos canais semicirculares (Figura 1D). </li><li> Usando um bisturi equipado com uma lâmina de # 11, cortar o ápice da cóclea apenas apical para a raiz do nervo (Figura 1D). </li><li> Transformar a preparação de modo que a porção de corte é voltada para cima. Use o canal semicircular anterior como uma pega para estabilizar a preparação (Figura 1E). </li><li> Usando # 5 pinças, remova a cóclea nas modíolo baixopara a base. No ponto onde a região de gancho da cóclea vira para baixo, usar uma sonda fina (metade de um quebradas # 55 fórceps) para levantar a última prateleira óssea do lâmina espiral óssea (Figura 1F), revelando a sáculo. Apenas sob o sáculo é a platina do estribo, que é um marco importante. O utrículo é imediatamente adjacente ao platina do estribo (Figura 1G), e é rodeado por osso. Use a sonda para lascar o osso distância suficiente para revelar aproximadamente 1/3 do utrículo. Retire cuidadosamente o utrículo usando # 55 fórceps (Figura 1H). Este procedimento normalmente irá resultar na remoção do epitélio pigmentado telhado como o utrículo é puxada a partir da preparação óssea. No entanto, se o utrículo é removido com o epitélio telhado intacto, o telhado pode ser removida utilizando # 55 fórceps. </li><li> Utrículos para a infecção por adenovirus (ou experiências para imagens ao vivo) deve ter o otoconia removido durante a dissecção (antes da infecção).Neste caso, usar uma seringa Luer-Lock que é preenchida com os meios de dissecação e equipada com uma agulha de pequeno calibre (geralmente 26-28 manométrica). Segure o utrículo na borda usando # 55 fórceps (Figura 1I). Traga a ponta da agulha perto do utrículo com o bisel da agulha apontando para baixo. Use um fluxo de dissecar mídia para explodir o otoconia (Figura 1J). Alternativamente, otoconia pode ser removido por escovagem-los fora usando uma ferramenta de pestana (Ted Pella, Inc. # 113). Utrículos que não vão se submeter a infecção adenoviral são normalmente cultivadas de livre flutuação em placas de 24 poços de cultura de tecidos com o otoconia intacta (veja abaixo a correção pós-remoção otoconia, que é mais fácil). </li><li> Uma vez que todos os utrículos são dissecados, alterar os meios de comunicação de dissecação para meios de cultura estéril: DMEM F12 (Gibco # 11320) suplementado com 5% de FBS e 50 U / ml de penicilina G (Sigma). </li><li> Utrículos são cultivadas a 37 ° C e 5% de CO 2. Se as culturas são para ser maintaINED por mais de 48 horas, metade dos meios de cultura deve ser mudada a cada dois dias. Culturas pode ser mantida, durante uma semana ou mais. </li></ol> 2. Infecção por adenovírus de Células de Apoio Importante: Trabalhando com o adenovírus exige Nível de Biossegurança 2 (BSL2) procedimentos e certificação. Verifique com o seu Diretor de Biossegurança Institucional para a orientação e treinamento sobre BSL2 procedimentos. <ol><li> Dissecar utrículos como acima em meios de dissecção (sem soro). Remover otoconia como acima. </li><li> Quando pronto para infectar, transferir um utrículo (células ciliadas acima) em cada poço de uma mini-Nunc bandeja-(Fisher # 12-565-68) contendo 15 uL DMEM isento de soro F12 (isto é importante porque o soro pode inactivar o vírus) . Esta transferência é mais fácil com um 1,5 milímetros microcurette (# 10082-15 de Ferramentas Ciência Belas). </li><li> O nosso Ad-GFP é serotipo 5 com os genes virais E1 e E3 e apagados do promotor de CMV humano dirigindo o transgeno (GFP). Este vírus foi obtido a partir de Vector Biolabs (Philadelphia, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Os vírus de Stock são fornecidos em títulos de 1,0-4,0 × 10 10 PFU / ml. Adicionar 0,5-2 ul de estoque de vírus a cada poço contendo um utrículo (Figura 1D). A quantidade real utilizada varia, dependendo do título do vírus e do material. Nós normalmente infectam cada utrículo com 1,0-4,0 × 10 7 PFU. </li><li> Cultura os utrículos em vírus, contendo meios a 37 ° C / 5% de CO2 durante 2 horas. Após 2 horas, transferir os utrículos de volta para a placa de cultura de 24 poços contendo meio de cultura de tecidos com o soro. Cultura os utrículos durante a noite a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Utrículos pode ser usado no dia seguinte para experiências para imagens ao vivo, ou eles podem ser fixados para imunoquímica de células ciliadas (ver abaixo). Aumentos transgene virais expressão ao longo do tempo, por isso, se a expressão do transgene é baixa de 24 horas pós-infecção, ele podebenéfico para células de cultura de um período adicional de 24 horas em soro contendo meios de comunicação. Se você ver toxicidade celular de cabelo, reduzir a quantidade de vírus utilizado. </li></ol> 3. Fixação utrículo, Remoção otoconia e Imunoquímica <ol><li> No final do período de cultura, fixar utrículos em paraformaldeído a 4%, quer para 3 horas à temperatura ambiente (numa plataforma de agitação) ou durante a noite a 4 ° C. Utrículos de lavagem (3 vezes, 15 min cada) em 0,1 M (1X) pH tampão de Sorensen fosfato 7,4. Estes passos são realizados numa placa de cultura de 24 poços de tecido. </li><li> Otoconia remoção: Nota: otoconia deve ser removido antes da infecção com adenovírus (ver passo 1,11, supra). No entanto, utrículos que não são para ser infectadas podem ser cultivadas e fixada com o otoconia ainda intacta. Neste caso, use os passos descritos aqui para remover o otoconia após a fixação. Inspecione utrículos para qualquer epitélio pigmentado telhado restante. Remova cuidadosamente qualquer epitélio telhado restante usando dois f # 55orceps. Para remover o otoconia, substituir tampão de Sorensen de fosfato com 750-1000 uL Cal-Ex descalcificante (Fisher # CS510-1D). Deixe Cal-Ex em utrículos por 1 minuto e 40 segundos (não ultrapassar 2 minutos). Substituir Cal-Ex com 0,1 M de tampão fosfato de Sorensen e de lavagem (5 vezes, 5 min cada). </li><li> Incubar utrículos em boro-hidreto de sódio (Sigma # 452,882, 1% em água desionizada) durante 10 mins. Lavar utrículos em tampão fosfato 0,1 M de Sorensen (5 vezes, 5 min cada). </li><li> Utrículos lugar em solução de bloqueio (PBS + 2% de albumina sérica bovina + 0,8% do normal soro de cabra + 0,4% de Triton X-100) durante 3 horas à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. </li><li> Adicionar anticorpos primários e incubar durante a noite a 4 ° C. Anti-Miosina 7a (quer Proteus Biosciences # 25-6790 ou # 138-1 MYO7A a partir do Developmental Estudos Hybridoma Bank) em 1:100 em solução de bloqueio rótulos todas as células ciliadas. Para separadamente rotular células ciliadas striolar e não-striolar, utilizou-se um duplo Protoco-labell com anticorpo monoclonal anti-calmodulina (Sigma # 3545 C; 1:150) e policlonais anti-calbindina (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, EUA; 1:200). Os anticorpos secundário (geralmente Alexa Fluor anticorpos secundários conjugados de Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) são diluídos 1:500 em solução de bloqueio e incubadas durante 4 horas no escuro à temperatura ambiente em uma plataforma de agitação. </li><li> Utrículos montagem em lâminas de vidro usando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA). </li></ol> 4. Os resultados representativos Utrículos cultivadas utilizando este método reter complementos da tanto as células do cabelo e células de suporte (Figura 2). As células capilares nas culturas saudáveis ​​mostram redondos perfis nucleares rodeadas por finas regiões citoplasmáticas que são miosina 7a-positivo (Figura 2, painel superior). Células de suporte (marcado com anti-Sox2) são menores e mais densamente do que células ciliadas (Figura 2, painel inferior). Adeadenovírus infecta 25-50% das células de suporte na utrículo, e não as células ciliadas são infectadas (Figura 2, o Ad-GFP painéis). Deve notar-se que o título óptima de trabalho de cada adenovírus devem ser determinadas empiricamente, dado que a morte celular de cabelo é possível se o título virai é muito alta. Além disso, as regiões de danos mecânicos (causados ​​durante a dissecção) vai ocupar grandes quantidades de vírus. Estas regiões de danos mecânicos são facilmente distinguíveis por uma linha contínua de células com níveis muito elevados de expressão da GFP e células ciliadas ausentes. Isto está em contraste com a expressão da GFP dispersa em células de suporte de uma cultura danificado (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="A Figura 1"/> Figura 1. Utrículo Dissection. A: C A bula é quebrada usando duas pinças robustas::. Auditivo bulla (AB) B. Cóclea Bony (RW = janela redonda, S =. artéria estapediano, C = cóclea, st = estribo) D: A lâmina de bisturi (SB) é usado para cortar o ápice da cóclea apical do nervo craniano VIII (8 º N) ASC = E canal semicircular anterior..: A preparação é mantida firmemente usando uma pinça # 3 com um garfo inserido no canal semicircular anterior (ASC) eo outro sobre o osso mais exterior (setas). O labirinto membranoso é removido utilizando fórceps F:. Com o labirinto membranoso removido, o giro basal da lâmina espiral óssea é visível perto da região de gancho. Uma sonda fina é inserido por baixo desta prateleira ósseo para levantar a prateleira para cima e removê-la (seta) G:. Após a remoção do sáculo, utrículo (U) é visível imediatamente adjacente à platina do estribo (SF) H:. Utrículo (U ) é removido usando um fórceps # 55 (seta) SF = platina do estribo I:.. utrículo com otoconia (O) parcialmente removida umad sensoriais epitélio (SE) por baixo visíveis J:. otoconia (O) são removidos do utrículo com uma corrente de material fornecido por uma seringa com uma agulha de calibre 26. A sombra da agulha (S) é visível na parte inferior da imagem de K:. Utrículo com otoconia removido e epitélio sensorial (SE) L visível:. Infecção adenoviral: cada utrículo (U) é colocado em um poço individual de um mini -bandeja. Células de suporte são infectadas com adenovírus por pipetagem de vírus para dentro do poço (P = ponta de pipeta). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="A Figura 2"/> Figura 2. Adenovírus mediada infecção de células de suporte. Utrículos foram infectadas com adenovírus de condução de expressão da proteína fluorescente verde (Ad-GFP). Mostrado são imagens confocais da camada de células do cabelo e da camada de células de suporte na mesma área de um utrículo. As células ciliadas são rotulados com um anticorpo contra 7a Miosina(Magenta). Células de suporte são rotulados com um anticorpo contra Sox2 (vermelho). Esquemática mostra a estrutura do epitélio utricular sensorial e as localizações das células ciliadas (HC) e células de suporte (SC). Localizações de confocal (óptico) secções mostradas na parte superior (U) e inferior (L) Os painéis são indicadas por linhas tracejadas na esquemática. Os painéis superiores: Em imagens confocais tomadas ao nível dos núcleos de células ciliadas, Ad-GFP sinal aparece nos espaços entre as células ciliadas e não se sobrepõem com o cabelo 7a Miosina célula marcador. Os painéis inferiores: Em secções confocal ao nível dos núcleos das células de suporte, Ad-GFP sinal colocalizes com o marcador de células de suporte Sox-2. Resultados anúncio GFP-infecção em GFP expressão em células de suporte apenas, e não células ciliadas estão infectados. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="A Figura 3"/> Figura 3. Infecção adenoviral não resultar na morte das células ciliadas ou células de suporte. Utricles foram infectadas com o Ad-GFP em 4 × 10 8 PFU / ml. Utrículos foram marcadas com anticorpos contra Miosina 7a (marcador de células ciliadas) e Sox2 (suportando marcador de células). Células ciliadas e contagem de células de apoio foram iguais para utrículos controle e Ad-GFP utrículos infectados.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

As células pilosas sensitivas são susceptíveis à morte provocada por uma variedade de tensões, incluindo o envelhecimento, trauma de ruído, e exposição a drogas ototóxicas, incluindo os antibióticos aminoglicósidos e da cisplatina agente antineoplásico. Em mamíferos cabelo resulta de morte celular em perda permanente da audição e / ou distúrbio do equilíbrio. Em sistemas de modelo in vitro são ferramentas importantes para estudos que visem determinar os mecanismos celulares e molecula...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de Catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Meio 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine fórceps (# 55)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine fórceps (# 5)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fórceps (# 3)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilina G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Soro fetal de bovino</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini-bandeja-</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovírus GFP-</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ex-Cal descalcificante</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Boro-hidreto de sódio</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7 Anti-Miosina (policlonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7 Anti-Miosina (monoclonal)</td&gt;<td&gt; Desenvolvimento de Estudos Hybridoma Banco</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calmodulina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calbindina</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabela 1</strong&gt;. Reagentes e instrumentos utilizados na cultura utrículo e infecção por adenovírus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Nota: Ad-GFP normalmente é fornecido pelo Biolabs vetor em um título de estoque de 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Nós solicitada uma amplificação costume, a fim de proporcionar o vírus Estoque a um título de 1,2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

A perda de audição e distúrbios de equilíbrio são frequentemente causada pela morte das células ciliadas mecanosensorial, que são as células receptoras do ouvido interno. Uma vez que não há nenhuma linha de células que satisfatoriamente representa células capilares dos mamíferos, a investigação sobre as células ciliadas depende culturas de órgãos principais. A melhor caracterizados in vitro sistema modelo de células maduras de cabelo de mamíferos utiliza culturas de órgãos de utrículos de ratinhos adultos (Figura 1) 1-6. O utrículo é um órgão vestibular, e as células ciliadas do utrículo são semelhantes em estrutura e função das células ciliadas no órgão auditivo, o órgão de Corti. O adulto preparação utrículo rato representa um epitélio maduro sensorial para os estudos dos sinais moleculares que regulam a sobrevivência, a homeostase e morte dessas células. Mamífero células ciliadas são terminalmente diferenciadas e não são regenerados, quando são perdidos. Em não-mamvertebrados do Mali, auditivas ou morte celular vestibular cabelo é seguido por regeneração robusta que restaura a audição e equilíbrio funções 7, 8. Regeneração de células ciliadas é mediada por células gliais-like células de suporte, que contactam com as superfícies basolateral de células ciliadas no epitélio sensorial 9, 10. Células de suporte são também mediadores importantes da sobrevivência de células ciliadas e morte 11. Recentemente, desenvolveu uma técnica para a infecção de células de suporte em utrículos cultivadas utilizando adenovírus. Usando o adenovírus tipo 5 (dE1/E3) para entregar um transgene contendo GFP sob o controlo do promotor de CMV, descobrimos que o adenovírus especificamente e de forma eficiente infecta células de suporte. Suportando eficiência de infecção de células é de aproximadamente 25-50%, e as células do cabelo não estão infectadas (Figura 2). Importante, descobrimos que a infecção adenoviral de células de suporte não resultar em toxicidade para as células ciliadas ou células de suporte, tal como as contagens de células em Ad-GFP infutrículos ected são equivalentes aos da não-infectadas utrículos (Figura 3). Assim adenovírus mediada por expressão gênica em células de suporte de utrículos cultura fornece uma ferramenta poderosa para estudar os papéis de células de suporte, como mediadores da sobrevivência das células ciliadas, morte e regeneração.

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Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Células ciliadas mecanosensorial são as células receptoras do ouvido interno. A melhor caracterizado<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo de células maduras capilares dos mamíferos utiliza culturas de órgãos de utrículos de ratos adultos. Apresentamos a dissecção do utrículo rato adulto, e demonstramos adenovírus mediada por infecção de células de suporte no utrículos cultivadas.

Dissecção da utrículo rato adulto e adenovírus Infecção mediada por células Coadjuvante

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.6K visualizações.  Medical University of South Carolina. Células ciliadas mecanosensorial são as células receptoras do ouvido interno. A melhor caracterizado In vitro Sistema modelo de células maduras capilares dos mamíferos utiliza culturas de órgãos de utrículos de ratos adultos. Apresentamos a dissecção do utrículo rato adulto, e demonstramos adenovírus mediada por infecção de células de suporte no utrículos cultivadas.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Neurociência

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Fundição vascular cerebral do rato adulto for Imaging 3D e Análise morfológica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

Dissecção crio-seção da zona subependímal adulta para análise proteome quantitativa precisa e profunda

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Enriquecimento de Culturas de Neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal de Camundongos Adultos por Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...