Preparações de superfície coclear permitem a visualização de toda a lente do órgão de Corti usando imunohistoquímica e imagem confocal. Tem sido amplamente utilizado para a investigação de patologias cocleares específicas de interesse. Vamos modificar o método de microdisseção coclear.
A principal vantagem desta técnica é a adesão de um pedaço de epitélio coclear a tampas redondas de 10 milímetros para o procedimento de imunolabeling, evitando a perda de tecido durante as múltiplas etapas de lavagem. Além das patologias cocleares, a preparação da superfície coclear também pode ser utilizada para a expressão de avaliação e regeneração das células ciliar. Habilidades básicas de microscópio são necessárias para esta técnica e a demonstração visual do método pode ajudar a garantir que cada etapa seja executada corretamente.
Demonstrando o procedimento será Qiaojun Fang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para extração óssea temporal, imediatamente post-mortem puxar a pele anteriormente para expor o osso do crânio e usar a tesoura para cortar o osso do aspecto posterior para a frente ao longo da linha central do crânio. Use fórceps para remover o tecido cerebral antes de usar o polegar e o dedo indicador para remover manualmente os ossos temporais de camundongos com três meses de idade ou mais.
Coloque os ossos em uma placa de Petri de 30 milímetros de diâmetro contendo gelo fresco frio 4%PFA e PBS sob um microscópio de dissecção e remova os estribos da janela oval. Perfure a membrana da janela redonda com fórceps número cinco e use uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa de um mililitro contendo PFA fresco de 4%para fazer um pequeno buraco no ápice da cóclea. Permeia suavemente e lentamente a cóclea com uma solução fixativa através das janelas redondas e ovais até que a solução saia do pequeno orifício no ápice.
Em seguida, transfira até dois frascos de cochleae perfusados em frascos individuais de cintilação de 20 mililitros contendo 10 mililitros de 4%PFA por frasco e agitar suavemente as amostras por duas horas à temperatura ambiente, seguido de armazenamento noturno a quatro graus Celsius em um rotador. Na manhã seguinte, lave a cóclea com três lavagens de cinco minutos com PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, adicione 20 mililitros de 4%EDTA a cada frasco e gire as amostras por 48 horas a quatro graus Celsius com agitação suave.
Ao final da incubação, toque na porção vestibular óssea de cada cóclea com fórceps para avaliar a elasticidade das amostras. Se os ossos são elásticos ao invés de firmes, a cóclea foi decalcificada. Substitua o EDTA por cada amostra por PBS fresco.
Para microdisseção do epitélio coclear, segure a porção vestibular do osso temporal com fórceps e use um bisturi para cortar a curva apical em um ângulo de 45 graus. Corte verticalmente ao longo da linha tênue entre a janela redonda e a janela oval para separar a cóclea da porção vestibular e orientar a porção coclear com a curva basal em direção ao fundo e ao meio vira em direção ao topo da placa de Petri. A partir desta posição, corte a cápsula óssea e a parede lateral da curva média em direção ao final a partir do qual a seção apical foi removida e continue cortando para separar completamente a porção média das regiões basais e de gancho.
Colocando a porção basal e gancho com o local da membrana basilar orientada para o fundo do prato, corte verticalmente os medialis da região do gancho para remover os medialis e cortar as regiões basais e ganchos para separar a porção do gancho. Para evitar distorção do tecido, corte os medialis da região do gancho antes da separação da região basal de curva e gancho. Corte as porções relativamente grandes de cápsula óssea e tecido lateral da parede da curva média e segurando a parede lateral com fórceps para alinhar a cápsula óssea e a parede lateral com o fundo da placa de Petri, corte esses tecidos do lado da membrana basilar.
Em seguida, achate a amostra para orientar a superfície da célula ciliada sensorial para cima e corte o resto da cápsula óssea e da parede lateral. Em seguida, use fórceps para remover a membrana tectorial para separar completamente a região média e remover a cápsula óssea, tecido lateral da parede e regiões tectoriais das curvas restantes como apenas demonstrado. Quando todas as curvas cocleares tiverem sido dissecadas, espalhe 0,5 microliters de células e adesivos de tecido no centro de uma fenda redonda de 10 milímetros e deixe o adesivo secar por três a cinco minutos à temperatura ambiente.
Coloque as tampas secas na placa de Petri e coloque todos os quatro pedaços de cada amostra de epitélio sensorial em uma mancha de cobertura. Em seguida, use fórceps para agarrar uma borda de cada deslizamento de cobertura para transferir os espécimes para poços individuais de um prato de cultura celular de quatro poços para imunolabeling. Para a imunolabelação das preparações de sinapse coclear superficial, lave cada epitélio sensorial três vezes por cinco minutos em PBS fresco por lavagem, seguido pelo tratamento de cada amostra com dois mililitros de surfactante não iônico de 2% por 30 minutos à temperatura ambiente em um rotador.
Ao final da incubação, aspire a solução surfactante de cada poço e bloqueie qualquer ligação inespecífica com 100 microliters de solução de bloqueio por poço durante uma hora no rotador com agitação suave à temperatura ambiente. No final da incubação de bloqueio, lave as amostras três vezes com PBS como demonstrado sob agitação suave antes de rotular cada epitélio com 100 microliters dos anticorpos primários de interesse por 24 horas a 37 graus Celsius protegidos da luz. No dia seguinte, lave as amostras três vezes com PBS fresco e agitação suave por lavagem e rotule os espécimes com 100 microliters dos anticorpos secundários apropriados de interesse por duas horas a 37 graus Celsius protegidos da luz.
No final da incubação, lave as amostras com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco por lavagem antes de colocar cada tampa em lâminas individuais de microscópio de vidro com as amostras viradas para cima. Em seguida, adicione cuidadosamente oito microliters de um meio de montagem apropriado no centro de cada deslizamento de cobertura e use fórceps para montar outra cobertura de 10 milímetros em cada amostra. Em seguida, sele as laterais de cada sanduíche de deslizamento com esmalte transparente, coloque as amostras em uma pasta de slides de papelão e armazene os slides a quatro graus Celsius.
Embora a dissecção da cóclea de camundongos adultos para preparações superficiais não seja simples, os pesquisadores novos na técnica devem ser capazes de aprender o método depois de praticar com 10 a 15 ouvidos. A imunolabelagem de preparações superficiais de camundongos CBAJ não tratados de 10 a 12 semanas de idade com CTBP2 e GluA2 demonstra que tanto as fitas pré-sinápticas quanto os terminais postsináspicos, respectivamente, estão localizados abaixo dos núcleos internos das células ciliadas e são justapostas indicando sinapses funcionais. A imunolabelagem para minosina 7A e a contra-retenção com faloideína e DAPI revelam a presença de células ciliar sensoriais, incluindo as células ciliares externas e células ciliares internas e seus núcleos.
A imunolabelagem para minosina 7A e a contra-retenção com a faloidina não mostram diferenças na imunoreatividade ou uniformidade com ou sem o uso de adesivo celular e tecido. Além disso, a microscopia eletrônica de preparações superficiais de camundongos c57 pretos c57 de seis a oito semanas de idade demonstram um esterecilia bem organizada em forma de V de células ciliadas externas em três fileiras da amostra. Lembre-se de encher o coclear com solução fixação suavemente e lentamente através das janelas redondas e ovais até que a solução saia do pequeno orifício no ápice.
Antes de separar a região do gancho da curva basal, tome cuidado para cortar os medialis da região do gancho para facilitar a remoção dos medialis.
