Os autores gostariam de agradecer a Università degli Studi di Milano para apoio a Eliana Di Cairano (bolsa de pós-doutoramento) e Stefania Moretti (Ph.D. comunhão). Este trabalho foi apoiado pela Research University Programa PUR a CP Gostaríamos de agradecer ao Prof. Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, Reino Unido, para o pHluorin construir e Dr. Francesco Dotti para assistência na análise de dados, e Silvia Marsicano para assistência técnica.

1. Cultura de Células e Transfection <ol><li> Cultura de células SH-SY5Y NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando o neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. As células SH-SY5Y crescem como uma mistura de agregados flutuantes e as células aderentes. Siga as instruções relatadas no protocolo (densidade celular, a relação de divisão, etc.) Para ter células que crescem firmemente ligados a tampa de vidro, que é crucial para TIRFM. <ol><li> Antes de começar, sob a cabine de segurança biológica de fluxo laminar, perfazer o volume de solução de fosfato oportuno estéril salina de tampão (PBS) e meio de cultura. <ol><li> Adicione 50 ml de PBS com concentrações de 150 mM de NaCl, 24 mM de tampão fosfato, pH 7,4. Filtrar a solução. </li><li> Adicione 50 ml de meio de células a partir de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose, 10% inactivado pelo calor soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 ug / ml), L-glutamina ( 2 mM), epiruvato de sódio (1 mM). Filtrar a solução. </li></ol></li><li> Remover o meio de crescimento completo e lava-se as células com 3 ml de PBS. </li><li> Incubar as células com 2 ml de 0,05% de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (por placa de Petri de 6 centímetros) por 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 e separar as células utilizando uma pipeta. </li><li> Inactivar a tripsina por adição de 2 ml de DMEM, e recolher as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante, adicionar 1 ml de DMEM para a pastilha e a solução pipetar para cima e para baixo o suficiente para dispersar as células numa suspensão de células única. </li><li> Dividi-los 1: 4 em um novo diâmetro de prato 6 centímetros de Petri contendo 3 ml de meio completo. Manter as células em cultura em placas de Petri de diâmetro 6 cm, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Sub-cultura, uma vez por semana ou quando eles cobriram 80 - 90% da área da superfície. </li></ol></li><li> Chapeamento de células SH-SY5Y para geração de imagens <ol><li> Para experiências TIRFM, placacélulas nas tampas de vidro. Empregar tampas de vidro com 0,17 ± 0,005 milímetros de espessura e um índice de refração 1,5255 ± 0,00015. Antes de começar, prepare as lamelas de vidro como segue: <ol><li> Limpe o vidro cobre com 90% de etanol, O / N. </li><li> Lave-os bem em água destilada (três mudanças de água destilada). Vidro cobre a seco num forno de secagem. </li><li> Local cobre em placas de Petri e esterilizar em um forno pré-aquecido a 200 ° C durante 3 h. </li></ol></li><li> O dia antes da transfecção, colocar cada lamela numa caixa de Petri de 3,5 cm adicionar 1 ml de meio de cultura e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> Tripsinizar as células como descrito nos passos 1.1.3 - 1.1.5, suspender o sedimento de células em 1 ml de meio completo e contar. Calcula-se o volume correcto de suspensão de células a adicionar para cada placa de Petri para proporcionar 3 x 10 5 células / poço. Esta densidade é necessária para o crescimento celular óptimo e transfecção eficiente. Incubar a 37 ° C5% em uma incubadora de CO 2 O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection por polietilenimina (PEI) NOTA: Para visualizar vesículas sinápticas dinâmica, vetor pCB6 contendo synapto-pHluorin foi usado. O synapto-pHluorin foi gerada por fusão em quadro de uma variante da proteína fluorescente verde (GFP) e a proteína 16 de membrana vesicular sinaptobrevina 2. A construção tem sido extensivamente utilizada para investigar as propriedades dentro das vesículas sinápticas 9 neurónios sensíveis ao pH. <ol><li> Antes de iniciar a transfecção, fazer 10 ml das seguintes soluções. Mantenha as soluções máxima de 1 mês. <ol><li> Adicione uma solução de 150 mM de NaCl. Ajustar a pH 5,5 com 0,01 N de HCl. </li><li> Adicione uma solução de PEI a 10% de polietilenimina (PEI; linear de 25 kDa) em solução de NaCl 150 mM. O pH da solução sobe para 8,8. Ajustar o pH para 7,8 com 0,01 N de HCl. </li></ol></li><li> 24 h após o plaqueamento, o meio de remover e actualizar com 1,5 ml demeio completo. Manter as células a 37 ° C, numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> De acordo com a cabine de segurança biológica de fluxo laminar, num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 3 ug de ADN plasmídeo de 25 ul de solução de NaCl 150 mM e 100 ul de uma solução de PEI 3,5 centímetros por placa de Petri. </li><li> Vortex durante 10 segundos, depois incubar a mistura de ADN / PEI durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicione cuidadosamente a mistura de ADN / PEI para a placa de Petri contendo lamelas com células e agitar suavemente para distribuir igualmente o reagente na placa de Petri. </li><li> Após 4 h alterar a forma e incubar as células S / N a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Realizar experimentos com imagens 24-48 horas após a transfecção. </li></ol></li></ol> Imagem 2. celular por reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRFM) <ol><li> Imagem set-up <ol><li> Realizar imagem TIRF com o set-up descrito na Figura 1. É composto por uma motorizada invertidamicroscópio (Figura 1, inserir A), a fonte de laser (Figura 1, inserir B) e o TIRF-deslizante (Figura 1, inserir C). Alcance iluminação TIRFM através de uma alta abertura numérica (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar) óleo 100X, objetiva de imersão. </li><li> Para iluminação TIRFM, empregar um multi-line (458/488/514 nm) 100 mW laser de argônio-ion. Usando um modo de fibra mono, introduzir a luz do laser polarizada linearmente para o caminho do feixe, através do controle deslizante TIRF. Insira o controle deslizante TIRF para o plano diafragma de campo luminoso do caminho do feixe de luz refletida. <ol><li> Para iluminação de campo grande, ligue o microscópio para uma lâmpada de mercúrio de curto-arco convencional HBO luz branca. Um duplo prisma-mantendo polarização no controle deslizante garante a combinação simultânea de iluminação TIRF e luz branca. </li></ol></li><li> Filtra-se a luz laser com um filtro de excitação (largura de banda 488/10 nm) montado sobre uma roda de filtro, introduzido no caminho do laser. Empregaruma alta velocidade, do obturador, controlado por software para permitir o controlo rápido da iluminação do laser. Para a análise pHluorin, montar uma banda passar 525/50 nm filtro de emissão. Capturar imagens digitais (512 x 512 pixels) em uma câmera CCD refrigeração rápida com o software ProPlus Imagem. </li></ol></li><li> Atingir iluminação TIRF (Figura 2) <ol><li> Ligue os lasers, o computador, a câmera, a roda de filtros, e os controladores do obturador; em seguida, aguarde 20 minutos antes do início do experimento, como os lasers precisa para se aquecer e estabilizar. </li><li> Antes de imagem, faça o volume oportuno das seguintes soluções. <ol><li> Adicione 50 ml de solução de Krebs (KRH) em NaCl 125 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1,2 mM, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 25 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) (tamponada a pH 7,4), 2 mM de CaCl 2, e 6 mM de glucose. </li><li> Adicione 10 ml de solução de KCl-KRH (pH 7,4) com NaCl 80 mM, KCl 50 mM, MgSO4 1,2 mM, 1,2 mM de KH 2 PO 4, HEPES 25 mM (tamponado a pH 7,4), 2 mM de CaCl 2, e 6 mM de glucose. </li></ol></li><li> Remova a tampa de vidro com células transfectadas e inseri-lo na câmara de imagem adequada. Montar a câmara e adicionar 500 ul de solução de KRH no centro do copo. </li><li> Adicione o óleo sobre o objetivo. Coloque a câmara de imagem na fase do microscópio e posicionar o objectivo sob a lamela de vidro. Posicione a tampa segura sobre a amostra. </li><li> No modo de epifluorescência, concentrar-se na lamela (superfície superior) e escolha células transfectadas colocados no centro da câmara. Selecione as células cujo sinal fluorescente pode ser claramente gravada usando um tempo de exposição abaixo de 80 ms. </li><li> Sob o controle do software, mude para iluminação TIRF no modo ao vivo. </li><li> Para definir a configuração TIRF, verifique a posição da viga que emerge da objetiva, na capa da amostra (Figura 2B). Quando o feixe é posicionado no centro de tele lente objectiva (Figura 2A, esquerda), uma mancha é visível no centro da tampa TIRF amostra (Figura 2B, à esquerda) e a célula é criada uma imagem em modo de epifluorescência (vários planos focais, alta fluorescência de fundo; Figura 2C, esquerda) . </li><li> Para atingir o ângulo crítico, mover o ponto focado na direcção Y (para a frente ou para trás; Figura 2B, ao centro) com o parafuso de ajustamento de ângulo sobre o cursor TIRF (Figura 1C). Quando o feixe converge sobre o plano da amostra com um ângulo maior que o ângulo crítico (Figura 2A, à direita), o local desaparece e uma fina linha recta, é evidente centrada no meio da tampa da amostra (Figura 2B, para a direita). </li><li> Para ajustar o ângulo TIRF usar a amostra de células (Figura 2C). Assista a imagem de fluorescência no vídeo, nesta fase, uma imagem de epifluorescência-like é ainda visível. Delicadamente, mova o parafuso até TIRF concondição é alcançada: apenas um plano óptico da célula está em foco (ou seja, a membrana de plasma em contacto com a tampa-derrapante), isto resulta em uma imagem plana com alto contraste (Figura 2C, à direita). </li></ol></li><li> Imaging Amostra <ol><li> Defina o canal único experimento time-lapse. Para minimizar a fotodegradação, capturar a imagem usando baixo tempo de exposição e de alto ganho. Tempos de exposição apropriados são entre 40 - 80 ms. Adquirir imagens em 1 - frequência de amostragem de 2 Hz. Cinética de vesículas podem ser amostragem melhor apreciado com maior freqüência (10 Hz). O tempo normal de observação é geralmente 2 min. </li><li> Adicionar 500 ul de células de solução e ficha KRH no modo TIRFM. Esta é a condição de repouso. Salve as imagens seqüenciais de tempo. </li><li> Concentre-se na mesma célula e registro sob as mesmas condições de descanso (potência laser, tempo de exposição, número de quadro). Depois de cinco frames, adicionar 500 ml de solução de KCl-KRH e manter KCl na câmara.Esta é a condição estimulada; guardar as imagens seqüenciais de tempo. </li></ol></li></ol> Análise 3. Imagem e Processamento de Dados NOTA: Para analisar imagens, macros têm sido desenvolvidos no laboratório, com base em funções existentes de software de análise de imagem; macros similares estão disponíveis on-line (URL fornecida na Tabela de Materiais e Equipamentos). <ol><li> A intensidade de fluorescência quantificação <ol><li> Usar uma macro &quot;Sequência intensidade de fluorescência&quot; para a quantificação da intensidade de fluorescência numa região de interesse (ROI) da imagem, ao longo do filme. </li><li> Abra as imagens em tempo-seqüencial. Vá para o menu macro e selecione &#39;Sequence intensidade de fluorescência&#39;. Na janela de &quot;análise&quot; aparece &quot;, selecione o ROI&quot;. </li><li> Escolha uma das ferramentas de seleção no menu para criar o ROI. Colocar 3 ROIs nas regiões da membrana celular, sem manchas (ROI fundo). Empregar this &quot;ROI fundo&quot; para avaliar a fotodegradação e para definir o limiar para a análise de eventos de fusão (Figura 3A). </li></ol></li><li> Fotodegradação correção e determinação do limiar (Figura 3B) <ol><li> Para avaliar a fotodegradação, abrir as linhas de fluorescência de intensidade &quot;ROI de fundo&quot;, (Figura 3ba). Normalizar os valores da intensidade de fluorescência em cada quadro para o valor de intensidade inicial (F0) (F / F0) (Figura 3BB). Calcular a média dos valores. </li><li> Realce os dados médios e criar um gráfico de linha usando as opções do menu gráfico. </li><li> A partir do menu de análise de dados, selecione &quot;linha de tendência&quot; para abrir a caixa de diálogo análise trama. Selecione o tipo de regressão. Defina regressão &quot;exponencial&quot;. Em seguida, selecione &quot;equação de exibição no chart&quot;. Na janela de gráfico, a equação exponencial aparece e os valores dos parâmetros são atribuídos automaticamente, (Figura 3BC </strong&gt;). </li><li> Aplicar a correcção exponencial para os valores de intensidade de cada quadro a seguir: Fn (corrigida) = Fn / exp (-n * a) Fn = intensidade de fluorescência experimental medido no quadro n; n = número de quadros; a = factor de branqueamento (constante que expressa a taxa de perda de intensidade devido à fotodegradação; &#160; Figura 3BD). </li><li> Para definir o limite, abrir um &quot;ROI background&quot; normalizada e corrigidos, calcular o sinal de fluorescência média e seu desvio padrão (SD). O valor médio mais 3 SD representa o limiar (Figura 3BE). Utilize este limiar para a análise de dados. </li></ol></li><li> Selecção de casos de fusão utilizando um procedimento semi-automático <ol><li> Abra as imagens em tempo-seqüencial com software de análise de imagem. Aplicar um filtro Gaussian para a seqüência de imagens ativa. </li><li> Analisar as imagens usando a função &quot;contar objetos&quot; ou uma macro que permite a seleçãode um objeto cuja pixels têm intensidade média de fluorescência dentro de um intervalo definido. Definir a intensidade intervalo manualmente, usando a função de limiar (vá para o menu bar, definir um limiar medida → para destacar a área de interesse). Um limiar adequado é de 30% em relação ao sinal de fundo fluorescente local. </li><li> Aplique uma macro &quot;Filtros de objetos&quot; para selecionar apenas os objetos que satisfaçam os seguintes critérios: <ol><li> Aplicar opção faixas (min e max inclusive) para o aspecto. Aspecto relata a relação entre o eixo maior e o eixo menor da elipse equivalente ao objecto. Aspect é sempre ≥1. Valores adequados são min = 1, max = 3. </li><li> Aplicar gamas de diâmetro. Diâmetro relata o comprimento médio dos diâmetros medidos com intervalos de dois graus unir dois pontos de contorno e que passa através do centro de gravidade do objecto. Defina o intervalo em pixels (ou em um, se estiver usando um sistema calibrado). </li><li> Defina o intervalo ideal em preliminexperimentos ary: selecionar manualmente os pontos de interesse e, em seguida medir o seu diâmetro usando a função de perfil trama. </li></ol></li><li> Selecione &quot;objetos de exibição&quot;: objetos selecionados vão aparecer sobreposto à imagem TIRFM (Figura 4B). </li><li> Inclua na análise apenas aqueles pontos que mostram uma curta (um a três quadros) aumento transitório na intensidade de fluorescência, imediatamente seguido por uma acentuada perda de sinal (manchas transientes). Empregar a seleção circular para criar um ROI diâmetro de aproximadamente um local radialmente em torno da vesícula / pontos selecionados (ROIs experimental). Execute esta etapa manualmente. </li><li> Com os ROIs seleccionado, calcular a intensidade de fluorescência média de cada ROI ao longo do filme. </li></ol></li><li> A análise dos dados (Figura 3C-D) <ol><li> Exportar o curso a tempo das mudanças de fluorescência medidos em cada &quot;ROI experimental&quot; para uma folha de cálculo; (Figura 3DA). Normalizar o valor de intensidade em cada quadro com a intensidade de fluorescência inicial (F / F0), (Figura 3Db). </li><li> Aplicar a correcção exponencial para os valores de intensidade de cada quadro como relatado no passo 3.2.4 (Figura 3Dc). </li><li> Para calcular o número total de eventos de fusão (número máximo), o tempo de cada fusão ocorre (largura de pico) e a amplitude do pico fluorescente (altura do pico e AUC) aplicar funções lógicas usando pacotes de planilhas ou de matemática. Um exemplo de análise de eventos de fusão usando fórmulas lógicas é relatado na Figura 3DD e 3DE. </li><li> Assuma que o aumento da intensidade de fluorescência que excede o limiar (intensidade média de fluorescência de fundo de 3 DP ±) como a fusão das vesículas com a membrana plasmática e o pico resultante como um evento de fusão. </li><li> Calcule a largura do pico como diferença entre o último eo primeiro valor x de cada pico. Multiplique este valor para 1 / (frequência de amostragem). Considere isso um valoré o momento de fusão das vesículas e adesão na membrana plasmática antes vesícula re-acidificação e reciclagem (Figura 3DD). </li><li> Calcule o AUC de células inteiras como uma soma de valores ao longo do limite. Considere esse valor como variação líquida fluorescente durante o tempo de gravação devido ao espontânea (repouso) ou evocado (estimulada) atividade sináptica. </li><li> Calcula-se a altura do pico como a diferença entre o valor de y máxima de cada pico e o limiar. Considere esse valor como indicativo do tipo de fusão (fusão única vs. simultânea / sequencial ou transitória vs. fusão completa). </li></ol></li></ol>

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Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este trabalho apresenta um protocolo para a imagem e analisar vesículas dinâmica em células secretoras, usando vetores codificados em cDNA fluorescentes e TIRFM. Os principais elementos de uma imagem com qualidade por TIRFM são a seleção do modelo de celular e transfecção de células com indicadores ópticos geneticamente codificados de liberação da vesícula e reciclagem. TIRFM é idealmente adequado para as células em crescimento aderente a uma cobertura de vidro planas e sufici...

A transmissão sináptica química entre neurónios é um dos principais mecanismos de comunicação no sistema nervoso. Baseia-se na liberação de neurotransmissores através de um ciclo dinâmico de fusão das vesículas e recuperação no local da pré-sináptico. Muitas das proteínas envolvidas na dinâmica das vesículas foram identificados; no entanto, sua contribuição específica para o fenômeno ainda precisa ser esclarecido 1. A nossa compreensão é parcialmente limitada pelo facto de que os ensaios mais amplamente utilizados para a exo / endocitose nem sempre são as mais adequadas. Vários estudos relacionados com a fusão das vesículas e dinâmicas dependem de técnicas eletrofisiológicas. Esta técnica fornece uma melhor resolução temporal e é excelente para investigar a fusão inicial de vesículas para a membrana do plasma, mas é incapaz de detectar muitos dos eventos moleculares subjacentes que suportem a função de pré-sináptico. A microscopia electrónica, por outro lado, proporciona os melhores morphological descrição de cada passo singular, mas o aspecto dinâmico do acontecimento não pode ser capturado, como as amostras devem ser fixados a fim de ser analisado. O advento de novas técnicas de gravação óptica 2,3, em combinação com os avanços na fluorescente sondas moleculares desenvolvimento 4-6, permite a visualização de processos exocíticas em células vivas, proporcionando novos níveis de informações sobre a estrutura e função sináptica. Estudos iniciais exploradas corantes dependentes de atividade estirilo (FM1-43 e corantes orgânicos relacionados) 7,8. State-of-the-art técnicas de imagem empregar variantes da proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) amarrado a vesículas proteínas luminais 9 sensíveis ao pH. Estas sondas são normalmente desligado quando presente nas vesículas devido ao baixo pH luminal. Após a fusão com a membrana plasmática, o interior das vesículas está exposta ao espaço extracelular neutro, o pH<html> abruptamente aumenta, alivia a extinção dependente de protões de pHluorin e o sinal fluorescente rapidamente aparece. Como a mudança de pHluorin é mais rápido do que o evento de fusão, através da monitorização da fluorescência aumenta, a fusão das vesículas com a membrana podem ser medidos e analisados. Como as moléculas da superfície marcadas com pHluorin sofrem endocitose, o sinal de fluorescência, subsequentemente, regressa ao nível basal, por conseguinte, a mesma construção pode também ser utilizada para monitorar vesícula reciclagem 9. Enquanto o sensor de pH com etiquetas de vesículas assegura a visualização de somente aquelas vesículas que realmente fundem com a membrana plasmática, a imagem em alta resolução espacial e temporal, é necessário para descrever detalhadamente os passos envolvidos nos processos de endocitose exo /. A técnica óptica que proporciona a resolução espacial e temporal, é necessário microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM), um pedido de microscopia de fluorescência 10. &quot;&gt; A reflexão interna total ocorre na interface entre a lamela de vidro e a amostra. Quando o percurso da luz atinge a lamela de vidro com um ângulo de incidência maior do que o ângulo crítico, a luz de excitação não é transmitido para a amostra, mas é completamente reflectido de volta. Nestas condições, forma-se uma na interface onda evanescente de luz e se propaga no meio com menor densidade óptica (a amostra). À medida que a intensidade do campo evanescente decai exponencialmente com a distância a partir da interface (com uma profundidade de penetração cerca de 100 nm) apenas os fluoróforos mais próximo em proximidade com a tampa-derrapante pode ser animado, enquanto os mais longe do limite não são. Em células transfectadas com construções de GFP, esta profundidade corresponde a proteínas expressas na membrana plasmática ou em estruturas vesiculares aproximando-se. Tal como fluoróforos no interior da célula não pode ser excitado, a fluorescência de fundo é minimizado, e uma imagem com um sinal muito alta / rato fundoio é formada 11. Várias características tornam TIRFM a técnica de escolha para o monitoramento vesículas dinâmica. O perfeito contraste e o sinal-para-ruído elevado rácio de permitir a detecção de sinais de muito baixo a partir das vesículas resultantes individuais. Aquisição de imagem baseada em chip em cada quadro fornece a resolução temporal necessário para detectar processos altamente dinâmicos. Por fim, a exposição mínima de células à luz a qualquer outro avião na amostra reduz fortemente fototoxicidade e permite a gravação de longo lapso de tempo com duração de 12. A análise dos dados continua a ser o aspecto mais desafiador e crucial desta técnica. A maneira mais simples para controlar a fusão das vesículas é medir a acumulação de proteínas repórter fluorescente à superfície da célula, ao longo do tempo 13. À medida que aumenta de fusão, líquidos aumenta de sinal de fluorescência bem. No entanto, este método pode subestimar o processo, particularmente em células grandes e em condições de repouso,porque os processos de endocitose e fotodegradação compensar o aumento na intensidade de fluorescência devido à vesícula exocitose. Um método alternativo é seguir cada evento único fusão 14. Este último método é muito sensível e pode revelar detalhes importantes sobre os mecanismos de fusão. No entanto, ele requer a seleção manual de eventos únicos, porque os procedimentos completamente automatizados para seguir vesículas e registrar a flutuação de seus sinais fluorescentes nem sempre estão disponíveis. Observação da dinâmica das vesículas requer células de amostragem em alta freqüência. Isto gera uma grande quantidade de dados que não podem ser analisados ​​manualmente. A proposta deste artigo é o de otimizar a técnica de imagem TIRFM para monitorar o basal e liberação de neurotransmissores estimulada na linha de células de neuroblastoma SH-5YSY, e descrever, passo-a-passo, um procedimento desenvolvido no laboratório de análise de dados, tanto em níveis de célula inteira e única de vesículas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Vesículas sinápticas liberar neurotransmissores nas sinapses químicas através de um ciclo dinâmico de fusão e recuperação. Monitorando a atividade sináptica em tempo real e dissecando as diferentes etapas da exo-endocitose no nível single-vesícula são cruciais para entender as funções sinápticas na saúde e na doença. Geneticamente codificado sondas sensíveis ao pH diretamente direcionados para vesículas sinápticas e Total Internal Reflection microscopia de fluorescência (TIRFM) fornecem resolução espaço-temporal necessário para acompanhar a dinâmica das vesículas. O campo evanescente gerado pela reflexão interna total só pode excitar fluorophores colocados em uma camada fina (&lt;150 nm) acima da tampa de vidro no qual as células aderir, exatamente onde os processos de exo-endocitose ter lugar. As imagens de alto contraste resultantes são ideais para vesículas rastreamento e análise quantitativa de eventos de fusão. Neste protocolo, SH-SY5Y n humanoeuroblastoma células são propostos como um modelo válido para estudar a libertação de neurotransmissores no nível único de vesículas por TIRFM, devido à sua superfície plana e a presença de vesículas dispersas. Os métodos para o crescimento SH-SY5Y como células aderentes e para transfectar-los com synapto-pHluorin são fornecidos, bem como a técnica para executar TIRFM e imagiologia. Finalmente, uma estratégia com o objetivo de selecionar, contar e analisar eventos de fusão a nível de célula inteira e única de vesículas é apresentado. Para validar a abordagem de análise de procedimento de imagem e dados, a dinâmica das vesículas pHluorin-marcados são analisados ​​sob repouso e estimulada (despolarização concentrações de potássio) condições. Despolarização da membrana aumenta a freqüência de eventos de fusão e provoca um aumento paralelo do sinal de fluorescência líquida registrada em células inteiras. Análise Single-vesícula revela modificações de comportamento fusion-evento (altura aumentou pico e largura). Estes dados sugerem tha despolarização de potássio não só induz uma liberação maciça neurotransmissor, mas também modifica o mecanismo de fusão das vesículas e reciclagem. Com a sonda fluorescente adequada, esta técnica pode ser utilizada em diferentes sistemas celulares para dissecar os mecanismos de secreção constitutiva e estimulada.

Os procedimentos de imagem TIRF e análise de dados descritos foram concebidos para estudar vesículas dinâmica em sistemas celulares. Esta técnica pode ser usada para determinar os efeitos das moléculas de sinalização e as drogas em eventos de fusão e dinâmica das vesículas de neurotransmissores 17. Usando as proteínas da membrana de plasma marcadas com GFP, a análise TIRFM foi empregue para caracterizar o tráfico constitutiva de transportadores de glutamato GFP em células gliais e células epite...

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K visualizações.  Università degli Studi di Milano. This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

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Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neurociência

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized cells use this process to execute vital body functions such as insulin secretion from &#946; cells and neurotransmitter release from chemical synapses. Owing to its physiological significance, exo-/endocytosis has been one of the most studied topics in cell biology. Many tools have been developed to study this process at the gene and protein level, because of which much is known about the protein machinery participating in this process. However, very few methods have been developed to measure membrane lipid turnover, which is the physical basis of exo-/endocytosis.
This paper introduces a class of new fluorescent lipid analogs exhibiting pH-dependent fluorescence and demonstrates their use to trace lipid recycling between the plasma membrane and the secretory vesicles. Aided by simple pH manipulations, those analogs also allow the quantification of lipid distribution across the surface and the intracellular membrane compartments, as well as the measurement of lipid turnover rate during exo-/endocytosis. These novel lipid reporters will be of great interest to various biological research fields such as cell biology and neuroscience.

This protocol presents a fluorescence imaging method that uses a class of pH-sensitive lipid fluorophores to monitor lipid membrane trafficking during cell exocytosis and the endocytosis cycle.

Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Análises da Actin Dynamics, Clutch Coupling e Força de Tração para o Avanço do Cone de Crescimento

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...