Este trabalho foi financiado por Marie Curie internacional reintegração subvenção.

1. Fabricação de dispositivos <ol><li> Comprado DTPA-D SU-8 molde de controle e mofo SPR220-7 fluxo da microfluídica Stanford Fundição ( <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / grupo / fundição</a> ). </li><li> Expor os moldes de silicone de clorotrimetilsilano (TMCS) de vapor por 10 min para promover a libertação de elastómero após os passos de cozimento 9. </li><li> Prepara-se uma mistura de elastómero de silicone com base e agente de cura (misturar bem), em duas diferentes proporções de 5:1 e 20:1 para o controle de fluxo e de moldes, respectivamente. Os rácios diferentes são necessários para a ligação apropriada de múltiplas camadas. </li><li> Despeje a PDMS 05:01 sobre a camada de controlo (cerca de 5 mm de altura). Degas camada de controlo e cozê-la por 30 min a 80 ° C. Revestimento Spin (Laurell, EUA), a mistura a 20:1 PDMS sobre a camada de fluxo a 2.600 rpm durante 60 segundos e, em seguida, cozer a 80 ° C durante 30 min. A velocidade de rotação revestidor é optimizado para actuação da válvula, a uma pressãode 15 psi. Girando rápido resultará numa camada mais fina com uma pressão mais baixa activação e vice-versa. Os dispositivos que utilizam têm um limite de 25 psi no controle e 10 psi no fluxo, acima do qual desprendimento do substrato pode ocorrer. </li><li> Separou-se a camada de controlo do molde. Faça isso devagar e ter cuidado para não descascar o padrão SU8. Em seguida, corte o dispositivo em torno de seu perímetro e furos para acessar os canais de controlo. </li><li> Alinhe o fluxo e as camadas de controle manualmente sob um estereoscópio. Comece alinhando o canto superior esquerdo, a válvula de botão (camada de controlo) deve ser no meio da câmara de reacção (camada de fluxo). Em seguida, alinhe a primeira linha e gentilmente liberar a linha camada de controle por linha. Certifique-se de que todas as válvulas de botão está no meio das câmaras de reacção e de que as válvulas de entrada de endereço e atravessar os canais de fluxo na posição correcta. O processo pode ser repetido até que todas as linhas localmente estão alinhados. No final, libertar qualquer tensão no b PDMSy levantando-o cuidadosamente a partir dos lados e cantos. Não levante muito ou desalinhamento pode ocorrer. </li><li> Asse durante 2 horas a 80 ° C. </li><li> Corte em torno do perímetro do dispositivo de descascar e o dispositivo de camada dois (chip) a partir do molde de fluxo. Furos de acesso aos canais de fluxo (Figura 1). </li></ol> 2. Arraying DNA e Alinhamento Dispositivo <ol><li> Produzir genes sintéticos pela montagem PCR. Os genes sintéticos são compor de T7 promotor, sítio de ligação ao ribossoma (RBS), ORF com dois marcadores de epitopo (uma em cada extremidade), e um terminador de T7 4. Os genes podem variar em comprimento de 100 pb até, pelo menos, 5.000 pb. </li><li> Preparar os genes sintéticos para arraying: preparar uma mistura de poli-etileno glycole (1,25%) e D-trealose di-hidratada (125 mg / ml) e 2 ul de distribuição por reacção em 384 poços de placa. Esta solução irá reduzir a ligação irreversível do DNA no vidro, bem como para a visualização durante alinhamento 10. </li&gt; <li> Transferir os genes sintéticos para a placa de cavidades 384. Geralmente as concentrações de ADN pode variar de 10 ng / ul a 100 ng / ul concentração final. Adicionar dH 2 O para um volume final de 20 ul (depende microarrayer e tipo pino). </li><li> Detectar uma série de genes sintéticos sobre substratos de vidro epoxi revestidos utilizando um microarrayer. Usamos MicroGrid 610 (Bio Robotics) com pinos SMT-S75 silicone (Parallel Synthesis, EUA). Contactar a impressão do ADN, com esses pinos específicas, resulta em manchas com diâmetro de cerca de 100 fim sobre a superfície de vidro. Cada pino de carga é suficiente para cerca de 100 pontos. Verifique se os campos de coluna e de linha correspondem ao dispositivo específico utilizado. O dispositivo usamos contém 16 colunas e 40 linhas com um arremesso de 680 mM por 320 pm, respectivamente. </li><li> Alinhar manualmente o dispositivo de microfluidos para a matriz de gene sob um microscópio estereoscópico. A mancha de ADN deve estar no meio das câmaras de DNA. Iniciar o alinhamento, localizando a primeira fila de pontos below a primeira fila de câmaras de DNA. Em seguida, alinhar o resto das linhas de acabamento com ajuste de precisão de todo o dispositivo. Uma vez que a matriz é alinhado cuidado deve ser tomado para aliviar qualquer stress na PDMS, levantando-a localmente. Se houver tensão deixado no PDMS não pode ligar bem ao microarray. </li><li> Finalmente, o dispositivo de ligação para a lâmina de vidro por incubação durante a noite numa placa quente a 80 ° C. </li></ol> 3. Priming e ativar o dispositivo <ol><li> As válvulas na camada de controle são comandados a partir do computador utilizando o LabVIEW. O script LabVIEW controla uma série de válvulas de solenóide através de um micro caixa de comando electrónica (adquirido a partir de Stanford Microfluidics Foundry). O bloco de válvulas solenóide está ligado a ar comprimido, os quais controlam o fluxo de ar e pressão em que as válvulas de controlo do dispositivo. </li><li> Conectar o dispositivo ao colector de válvulas de solenóide através de um tubo de plástico flexível com um diâmetro interno de 0,02 &quot;(Tygon) E pino de aço inoxidável (New England pequenos tubos Corporation). </li><li> Encher os tubos com DDW e inserir o pino nos furos de acesso da camada de controlo. Certifique-se de que cada um dos tubos está ligado ao seu canal de controlo correspondente. </li><li> Execute o aplicativo LabVIEW no computador para ativar os canais de controle. Através da activação da válvula a partir do script LabVIEW, que aplica a pressão do ar, o que por sua vez, vai empurrar a água para os canais de controlo de PDMS. Definir a pressão de ar de 5 psi. Recomenda-se para encher o &#39;sandwich&#39; e as válvulas de endereço em primeiro lugar, a fim de identificar conversas cruzadas entre os canais de controlo de dispositivos defeituosos. Em caso de conversas cruzadas, atuação da linha de controle &quot;sanduíche&quot; levará à atuação do pescoço ou linhas de controle de botão. Isto é semelhante a um curto-circuito eléctrico. Um dispositivo com a diafonia é defeituoso e não pode ser utilizado. </li><li> Depois de todos os canais de controlo e as válvulas estão cheios de DDW, as válvulas são preparadas e ready para bloquear os canais de fluxo abaixo delas. Aumentar a pressão de ar de 15 psi. Ativação da válvula é controlado a partir de um programa LabVIEW através de um conjunto de chaves liga / desliga conectados a válvulas solenóides individuais. Cada switch controla uma linha de controle específico através da sua válvula solenóide correspondente. Ligando o botão do interruptor (no script) será aplicada pressão de ar no tubo correspondente. A pressão do ar vai empurrar o DDW na linha de comando e resultará na expansão das válvulas microfluídicos, bloqueio do canal por baixo. Desligar uma válvula de controlo, irá libertar a pressão do ar e, posteriormente, libertar o bloqueio do canal de fluxo respectivo. </li><li> Para assegurar que todas as válvulas estão abertas, ligar um tubo a uma das entradas de fluxo de ar e fluxo para dentro do dispositivo em psi 4-5. Isso vai liberar quaisquer válvulas pegajosas da lâmina de vidro. </li><li> Finalmente, o dispositivo está preparado e pronto. Feche todas as entradas e &#39;pescoço&#39; válvulas, para iniciar a química de superfície. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Surface Chemistry <ol><li> De forma a facilitar a auto-montagem de uma matriz de proteína sobre a superfície e impedir a adsorção não específica no interior do dispositivo microfluidico, a superfície é modificada quimicamente: </li><li> A fluir através de um componente do dispositivo, ligar um novo tubo com a solução necessária para um dos canais de escoamento do dispositivo. Ligue o lado livre do tubo, para o colector de manual e abrir o fluxo de pressão de ar (5 psi). </li><li> Carregar 40 ul de biotinilado-BSA (1 ug / uL) em um novo tubo e fluxo aproximadamente metade dela durante 20 min através do dispositivo, o BSA irá ligar à superfície de epóxi. </li><li> Use Hepes (50 mM), para lavar o substrato que não reagiu, entre cada uma das etapas da química de superfície diferentes. </li><li> Estrepavidina fluxo de 25 ul (0,5 ug / uL) durante 20 minutos, no topo do biotinilado-BSA. </li><li> Lavar com Hepes, durante 5 minutos. </li><li> Feche o &quot;botão&quot; da válvula e fluir o resto do biotinilada-BSA (como descritocama, supra), a passivação da superfície circundante do botão. </li><li> Lavar com Hepes, durante 5 minutos. </li><li> Libertar o &quot;botão&quot; da válvula e do fluxo de 30 ul de penta-His-biotina (0,16 ug / uL) durante 20 minutos. O anticorpo irá ligar-se a estreptavidina o exposto, especificamente para a área sob o &quot;botão&quot; criação de uma matriz anti-His. </li></ol> 5. Protein Expression <ol><li> Expressar as proteínas no dispositivo usando coelho transcrição rápida de reticulócitos acoplados e reação de tradução. A expressão da proteína a partir dos genes sintéticos manchado no dispositivo cria uma matriz de proteínas prontas para usar. Por exemplo, uma tal utilização é para uma tela de ligação às proteínas. </li><li> Abra o &#39;pescoço&#39; válvulas e fluxo de reticulócito de coelho transcrição rápida acoplados e reação de tradução através do dispositivo para a câmara de DNA. Em seguida, fechar as válvulas &quot;sanduíche&quot; e separar cada gene de seu ambiente. Incubar o dispositivo sobre uma placa de aquecimento durante 2,5 horas a 30 ° C. Expresso proteins vai difundir a partir da câmara de DNA para a câmara de reacção espontânea (pescoço de válvula é aberta) e se ligam ao anticorpo anti-His sob o &quot;botão&quot; válvula de imobilização da proteína através da sua extremidade C-terminal tag. </li><li> Rotular as proteínas com C-myc anticorpo Cy3. O anticorpo irá ligar ao seu epítopo correspondente localizado na extremidade N-terminal da proteína. </li><li> Determinar os níveis de expressão de proteínas com um scanner de microarray (LS Reloaded, Tecan) usando um laser de 532 nm e 575 nm de emissão de filtro. </li></ol> 6. Resultados representativos 1. Fabricação de dispositivos Um projeto gráfico para o dispositivo foi criado pelo AutoCAD com base em nossas necessidades experimentais. O projeto foi impressa em um filme de transparência por um setter imagem de alta resolução. Esta transparência serve como um fotomáscara em fotolitografia contato. Uma técnica microusinagem de superfície foi usado para criar modelos de 3-D de uma pastilha de silício determinado pelos padrões inscritos no tele máscaras utilizadas. O dispositivo de microfluidos foi fabricado em silicone do molde de fundição de elastómero de silicone de polidimetilsiloxano (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, EUA) (Figura 1). Cada dispositivo é constituído por duas camadas de PDMS alinhados, o fluxo e a camada de controlo. O molde foi primeiramente exposta a clorotrimetilsilano (TMCS, Aldrich) de vapor durante 10 minutos para promover a libertação de elastómero após os passos de cozimento. Uma mistura de elastómero de silicone com base e agente de cura foi preparado em duas proporções diferentes de 5:1 e 20:1 para o controle de fluxo e de moldes, respectivamente. A camada de controlo foi desgaseificada e cozido durante 30 min a 80 ° C. A camada de fluxo foi inicialmente revestido girar (Laurell, EUA) a 2600 rpm durante 60 segundos e aquecidas a 80 ° C durante 30 min. A camada de controle foi separado de seu molde e furos de controle de acesso de canal foram perfurados. Em seguida, as camadas de escoamento e de controlo foram alinhadas manualmente sob um estereoscópio e cozidos durante 2 horas a 80 ° C. O dispositivo de duas camadas foram descascadas from o molde de fluxo e de fluxo de canais de acesso buracos foram perfurados. 2. Descrição do Dispositivo A capacidade do dispositivo pode variar desde 500 até 10.000 células unitárias (Figura 2). O dispositivo consiste em duas camadas; camada de escoamento (cinzento) e controlo de camada (cor). A camada de controlo contêm uma variedade de válvulas com diferentes funções. Cada célula unitária, na camada de fluxo, é composto de um DNA e uma câmara de reacção e é controlado por três tipos de válvulas de micromecânica; &#39;pescoço&#39;, &#39;botão&#39;, e &#39;sandwich&#39; (figura 2A). &quot;Gene sintético» A spotted depositado no interior da câmara de DNA é bloqueada a partir da câmara de reacção através do &quot;pescoço&quot; da válvula (verde). Lavagem de captura e mecânico de proteínas de superfície ligados na câmara de reacção é efectuada pelo &quot;botão&quot; da válvula (azul). A &quot;sanduíche&quot; de válvula permite que cada reacção ocorra na sua própria unidade de célula (vermelho). As válvulas de endereço pode dividir o dispositivo até 8 seções independentes, por diferent ensaio condição. Além disso, a camada de controlo contêm válvulas de entrada que permitem que o fluxo de fluido escolhido para a camada de fluxo. Os canais de controle de PDMS são cheios com ADD. Quando a válvula é accionado o aumento de pressão (15 psi) resulta na expansão do PDMS. Em locais onde a membrana é fina o suficiente (ou seja, cruzando de controle e linhas de fluxo), este é suficiente para bloquear completamente a linha de fluxo. Altura da célula unitário médio é de 10 um, e volume médio das células da unidade é menor do que 1 nl. 3. , Expressão de proteínas e Detecção As proteínas foram expressas no dispositivo utilizando coelho transcrição rápida de reticulócitos acoplados e reacção de tradução (Promega). A expressão das proteínas criado um array de proteínas prontas para uso em uma tela de ligação (Figura 3). Uma mistura de expressão (12,5 uL) foi carregado para o dispositivo e, em seguida, inundado para as câmaras de DNA, abrindo as válvulas de &quot;pescoço&quot;. Em seguida, os &quot;sanduíche&quot; válvulas foramfechado deixando cada célula unitária separada das suas células vizinhas e do dispositivo foi incubada numa placa de aquecimento durante 2,5 horas a 30 ° C. Proteínas expressas difundem através da câmara de gene para dentro da câmara de reacção, em que a sua extremidade C-terminal tag Sua podia ligar o anticorpo anti-His (Qiagen) localizada sob o &quot;botão&quot; válvula de imobilização da proteína para a superfície. As proteínas foram marcadas com um C-myc Cy3 (Sigma), que se ligou ao seu epítopo correspondente localizado na extremidade N-terminal da proteína e rotularam. Níveis de expressão de proteína foram determinadas com um scanner de microarray (LS Reloaded, Tecan) usando um laser de 532 nm e 575 nm de filtro. A matriz de proteína resultante consiste em vários níveis de expressão da proteína. Normalmente, cerca de 20% de uma biblioteca de genes não conseguem expressar a níveis detectáveis. Nenhuma correlação com o tamanho da proteína foi observada 3. Níveis de fundo foram determinados utilizando câmaras que não foram manchadas com o ADN. Assim, os sinais das câmaras de proteína correspondentes devem-se a ser noise ou adsorção não específica dos anticorpos de rotulagem. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fabrication chip. (A) foram tratados com moldes vapores TMCS por 10 min. (B) PDMS é fundido no controle e fluxo de moldes de silicone. (C) Tanto o controle de fluxo e de moldes são cozidas em 80 ° C durante 30 min. (D) A camada de controlo do molde desenrolada, cortada ao tamanho e as entradas de controlo são perfuradas. (E) A camada de controle é alinhada com a camada de fluxo sob um estereoscópio e em seguida cozido em 80 ° C durante 2 horas. Em paralelo com a fabricação de dispositivos PDMS, uma série de genes sintéticos são microarrayed sobre substratos de vidro revestidos com epóxi (CEL Associates). (F) O dispositivo é então alinhado com o DNA microarray prendendo os &quot;genes sintéticos&quot; dentro das câmaras de DNA. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Uma foto do Dispositivo PING. (A) O dispositivo consiSão de duas camadas alinhados PDMS (controle e fluxo). A camada de escoamento contém câmaras paralelas de ADN e de reacção (a cinzento) controladas por válvulas de micromecânica (&quot;botão&quot;, &quot;sandwich&quot; e &quot;pescoço&quot;) na camada de controlo. (B) As camadas são alinhados a um microarray de impresso, que cada câmara de programas de DNA com uma única mancha. Isso elimina qualquer contaminação potencial. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagens de fluorescência de uma proteína de matriz criada com um chip microfluídico. Os genes de impressos foram expressos para proteínas dentro do dispositivo (na câmara de DNA) e foram puxadas para baixo para a superfície (abaixo do &quot;botão&quot; de válvula na câmara de reacção) através da sua C-terminal tag dele. A expressão proteica foi detectada utilizando o seu C-myc N-terminal tag e um anticorpo específico de fluorescência. Intensidades de sinal diferentes indicam diferentes níveis de expressão da proteína. Un-manchado câmaras serviram como controle para o fundo leVels.

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	<li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+column:+Microfluidic+high-throughput+screening.">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li><li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanoliter+systems.">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li><li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography.">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks.">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li><li>Einav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+hepatitis+C+target+and+its+pharmacological+inhibitors+by+microfluidic+affinity+analysis.">Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.</a> Nature. 26, 1019-1027 (2008).</li><li>Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis.">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).</li><li>Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).</li><li>Ramachandran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).</li><li>Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).</li><li>Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supports+for+microarray+immunoassays.">Solid supports for microarray immunoassays.</a> Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).</li><li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B.">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo, apresentamos um método para matrizes de geração de proteínas de alto rendimento, utilizando uma plataforma microfluídica. A geração da matriz é baseada em microarray de impressão de moldes de ADN in vitro e a expressão de proteína a partir do ADN no interior do dispositivo microfluidico. Nossa plataforma microfluídica romance tem várias vantagens importantes sobre os métodos usados ​​atualmente, que o tornam uma ferramenta promissora e geral para prot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PDMS-184 SYLGARD </td><td> Dow Corning EUA </td><td> ESSEX-DC </td></tr><tr><td> Clorotrimetilsilano (TMCS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> Epóxi substratos de vidro revestidos </td><td> CEL Associates EUA </td><td> VEPO-25C </td></tr><tr><td> Poli etileno glycole (PEG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81260 </td></tr><tr><td> D-trealose di-hidratada </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Biotinilado-BSA </td><td> Perfurar </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidina </td><td> Perfurar </td><td> 31050 </td></tr><tr><td> penta-His-biotina </td><td> Qiagen </td&gt; <td> 34440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">Biological Industries</a> </td><td> 03-025 1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc anticorpo Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Caixa de controle </td><td> Stanford microfluídica Fundição </td><td></td></tr><tr><td> Molde </td><td> Stanford microfluídica Fundição </td><td></td></tr><tr><td> Pin </td><td> New England pequenos tubos Corporação </td><td></td></tr><tr><td> Tygon tubulação microbore </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Microarrayer </td><td> Bio Robótica </td><td> MicroGrid 610 </td></tr><tr><td> Pinos de silicone </td><td> Paralelo Syntese </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

high-throughput protein expression generator using a microfluidic platform

Campos rápido crescimento, como a biologia de sistemas, exige o desenvolvimento e implementação de novas tecnologias, permitindo medições de alto rendimento e de alta fidelidade de grandes sistemas. Microfluídica promete cumprir muitos desses requisitos, como a realização de experimentos de alto throughput screening on-chip, abrangendo ensaios bioquímicos, biofísicos e baseada em células 1. Desde os primeiros dias de dispositivos microfluídicos, este campo tem evoluído drasticamente, levando ao desenvolvimento de integração em larga escala de microfluidos 2,3. Esta tecnologia permite a integração de milhares de válvulas micromecânica em um único dispositivo com uma pegada de porte grande (Figura 1). Nós desenvolvemos uma plataforma de alto rendimento microfluídicos para a geração de expressão in vitro de matrizes de proteína (Figura 2) chamado Ping (Proteína Gerador de rede de interação). Estas matrizes podem servir como um modelo para vários experimentostais como a proteína-proteína 4, proteína-RNA de 5 ou proteína ADN-6 interacções. O dispositivo consiste de milhares de câmaras de reacção, que são programados individualmente utilizando um microarrayer. Alinhamento dos microarrays impresso para programas de dispositivos microfluídicos cada câmara com um único ponto eliminando a contaminação potencial ou reatividade cruzada Além disso, gerando microarrays utilizando técnicas de microarray padrão manchando também é muito modular, permitindo a arraying de proteínas, DNA 7 8, pequenas moléculas, e até mesmo as suspensões coloidais. O impacto potencial da microfluídica em ciências biológicas é significativo. Uma série de ensaios baseados em microfluídica já fornecido informações novas para a estrutura e função dos sistemas biológicos, e no campo da microfluídica continuarão a impactar biologia.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Apresenta-se um método de microfluidos para a expressão de arrays de proteínas. O dispositivo consiste de milhares de câmaras de reacção controladas por válvulas de micro-mecânicos. O dispositivo micro é acoplado a uma biblioteca de genes microarray-impresso. Estes genes são transcritos e traduzidos em seguida, on-chip, resultando numa matriz de proteína pronta para o uso experimental.

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

high-throughput-protein-expression-generator-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K visualizações.  Bar-Ilan University. Apresenta-se um método de microfluidos para a expressão de arrays de proteínas. O dispositivo consiste de milhares de câmaras de reacção controladas por válvulas de micro-mecânicos. O dispositivo micro é acoplado a uma biblioteca de genes microarray-impresso. Estes genes são transcritos e traduzidos em seguida, on-chip, resultando numa matriz de proteína pronta para o uso experimental.

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Bioengenharia

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identificação de alta duração da resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate no Tomate usando Ensaio de Inundação de Mudas

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...