Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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Gostaríamos de agradecer à bolsa BE1911/8-1 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), ao projeto GLUE da LOEWE e ao centro de pesquisa colaborativa Transport and Communication across Membranes (SFB807) pelo apoio financeiro.

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Os autores não têm nada a revelar.

A configuração e as estratégias para otimizar a expressão da FC e a inserção co-translacional de MPs funcionais em nanodiscos são descritas. O equipamento necessário compreende um biorreator, um dispositivo de prensa francês ou similar, um leitor UV/VIS e de fluorescência, vasos de reação CF adequados para uma configuração de dois compartimentos e uma incubadora com temperatura controlada. Outros equipamentos padrão são centrífugas para a colheita de células de E. coli, bem como centrífugas de...

As proteínas de membrana (MPs) são alvos desafiadores em estudos de produção de proteínas devido à sua insolubilidade em ambientes aquosos. As plataformas convencionais de produção de MP compreendem sistemas baseados em células, como E. coli, levedura ou células eucarióticas. As MPs recombinantes sintetizadas são extraídas das membranas celulares ou redobradas dos corpos de inclusão1. Após a solubilização do detergente, os MPs podem ser transferidos para ambientes de membrana adequados por protocolos de reconstituição in vitro estabelecidos. Além de vesículas e lipossomas, a reconstituição de MP em membranas planares na forma de nanodiscos2 ou partículas de salipro3 tornaram-se técnicas rotineiras nos últimos tempos. No entanto, todas essas estratégias implicam o contato detergente com MPs que pode resultar em desestabilização, dissociação de oligômeros e até mesmo perda de estrutura e atividade proteica4. A triagem para condições ideais de solubilização e reconstituição de detergentes pode, portanto, ser tediosa e demorada5.
A natureza aberta dos sistemas livres de células (FC) permite que a reação de expressão seja diretamente fornecida com membranas pré-formadas com uma composição lipídica definida. Nesse modo de expressão à base de lipídios (L-CF), os MPs sintetizados têm a oportunidade de inserir co-translacionalmente nas bicamadas fornecidas 6,7 (Figura 1). Nanodiscos constituídos por uma proteína de andaime de membrana (MSP) em torno de um disco planar de bicamada lipídica8 parecem ser particularmente adequados para essa estratégia 9,10. Os nanodiscos podem ser rotineiramente montados in vitro com uma variedade de lipídios diferentes, são muito estáveis e os estoques podem ser concentrados até 1 mM. No entanto, a expressão de MSP em E. coli e sua purificação são necessárias. Como estratégia alternativa, a MSP pode ser coexpressa em conjunto com a MP alvo em reações de FC fornecidas com lipossomas11,12,13. Modelos de DNA para MSP e MP são adicionados à reação e MP / nanodiscos podem se formar após a expressão. Embora a produção de MSP seja evitada, a estratégia de co-expressão requer um ajuste fino cuidadoso das concentrações finais do molde de DNA e maiores variações na eficiência da produção de amostras podem ser esperadas.
A inserção co-translacional de MPs em membranas de nanodiscos pré-formados é um mecanismo não fisiológico e ainda amplamente desconhecido, independente de máquinas de translocon e sequências de sinais13,14,15,16. Os principais determinantes da eficiência de inserção são o tipo de proteína de membrana, bem como a composição lipídica da membrana fornecida, com preferência frequente por lipídios carregados negativamente15,17. Como as membranas dos nanodiscos são relativamente confinadas em tamanho, uma quantidade substancial de lipídios é liberada após a inserção do MP18. A variação do tamanho do nanodisco permite a inserção e o ajuste de complexos de MP oligoméricos superiores15,18. Entre outros, a montagem correta de complexos homooligoméricos foi mostrada para o canal iônico KcsA, para a bomba iônica proteorhodopsina (PR) e para o transportador multifármaco EmrE15,18. É provável que os MPs entrem na membrana simétrica do nanodisco de ambos os lados em frequência relativamente igual. Por conseguinte, deve considerar-se que diferentes monómeros ou oligômeros inseridos em um nanodisco podem ter orientações opostas. No entanto, um viés na orientação pode ser causado por mecanismos de inserção cooperativa, conforme relatado para a formação de hexâmeros PR e tetrâmeros KcsA18. Um viés adicional na orientação do MP pode resultar de interruptores de orientação de MPs inseridos provavelmente na borda das membranas de nanodisco.
A produção de lisados de FC a partir de cepas de E. coli é uma técnica de rotina confiável e pode ser realizada em praticamente qualquer laboratório bioquímico19,20. Deve-se considerar que, além da formação de pontes dissulfeto, a maioria das outras modificações pós-translacionais está ausente se um MP for sintetizado usando lisatos de E. coli. Embora isso possa gerar amostras mais homogêneas para estudos estruturais, pode ser necessário excluir efeitos potenciais sobre a função de alvos individuais de MP. No entanto, a produção eficiente de amostras de alta qualidade de receptores acoplados à proteína G (GPCR)14,21,22, transportadores eucarióticos 23 ou grandes conjuntos heteroméricos 24 em lisados de E. coli CF indica sua adequação até mesmo para alvos complexos. As quantidades de escala preparativa (≈ 1 mg/mL) de uma amostra podem ser obtidas com a configuração livre de células de troca contínua de dois compartimentos (CECF), composta por uma mistura de reação (RM) e um compartimento de mistura alimentar (FM). O volume de FM excede o volume RM de 15 a 20 vezes e fornece um reservatório de compostos e precursores de energia de baixo peso molecular19. A reação de expressão é, portanto, estendida por várias horas e o rendimento final do alvo MP é aumentado. Os compartimentos RM e FM são separados por uma membrana de diálise com um ponto de corte de 10-14 kDa. Os dois compartimentos requerem um projeto especial do recipiente de reação do CECF (Figura 1). de diálise comerciais como recipientes RM em combinação com recipientes de plexiglass sob medida que seguram o FM são exemplos adequados. Os rendimentos de MP podem ainda ser manipulados modificando as relações RM:FM ou trocando o FM após um certo período de incubação.
O rendimento e a qualidade de um MP frequentemente exigem intensa otimização dos parâmetros de reação. Uma vantagem importante da expressão da FC é a possibilidade de modificar e ajustar quase qualquer composto de acordo com os requisitos individuais de um MP. Uma estratégia simples é concentrar-se primeiro em melhorar o rendimento de um MP, estabelecendo um protocolo básico de produção e, em seguida, otimizar a qualidade do MP ajustando as condições de reação e dobramento. A ausência de processos fisiológicos nos lisados da FC e sua reduzida complexidade resultam em altas taxas de sucesso para a produção eficiente de MPs25. Considerações de rotina para o desenho do molde de DNA e otimização da concentração de íons Mg 2+ são, na maioria dos casos, suficientes para a obtenção de rendimentos satisfatórios26. Dependendo do modo de expressão, a otimização da qualidade do MP pode se tornar demorada, pois uma maior variedade de parâmetros precisa ser rastreada14,17,22.
Para estabelecer a plataforma de expressão de FC descrita, são necessários protocolos para a produção de lisado de E. coli CF (i), RNA polimerase T7 (ii), nanodiscos (iii) e os compostos básicos de reação do CECF (iv) (Figura 1). Os derivados A1927 ou BL21 da cepa de E. coli K12 são frequentemente utilizados para a preparação de lisatos eficientes de S30 (centrifugação a 30.000 x g). Além dos lisatos S30, os lisados correspondentes centrifugados em outras forças-g (por exemplo, S12) podem ser usados. Os lisados diferem na eficiência da expressão e na complexidade do proteoma. O proteoma do lisado S30 preparado pelo protocolo descrito tem sido estudado em detalhes28. O proteoma S30 ainda contém algumas proteínas residuais da membrana externa que podem causar problemas de fundo na expressão e análise dos canais iônicos. Para tais alvos, recomenda-se o uso de lisados S80-S100. Uma modificação valiosa durante a preparação do lisado é a indução da resposta SOS por choque térmico combinado e fornecimento de etanol na fase de crescimento do tronco médio das células. Os lisados HS30 resultantes são enriquecidos em chaperonas e podem ser usados em misturas com lisados S30 para melhorar a dobragem MP22. A expressão de FC em lisados de E. coli é operada como um processo de transcrição/tradução acoplado com moldes de DNA contendo promotores controlados pela RNA polimerase T7 (T7RNAP). A enzima pode ser eficientemente produzida em células estelares BL21(DE3) que transportam o plasmídeo pAR121929.
Duas cópias do MSP1E3D1 se reúnem em um nanodisco com um diâmetro de 10-12 nm, mas o protocolo descrito abaixo também pode funcionar para outros derivados do MSP. No entanto, nanodiscos maiores do que aqueles formados com MSP1E3D1 tendem a ser menos estáveis, enquanto nanodiscos menores formados com derivados de MSP, como MSP1, podem não acomodar MPs maiores ou complexos de MP. Os nanodiscos MSP1E3D1 podem ser montados in vitro com uma grande variedade de diferentes lipídios ou misturas lipídicas. Os nanodiscos pré-formados são geralmente estáveis por > 1 ano a -80 °C, enquanto a estabilidade pode variar para diferentes componentes lipídicos. Para a triagem dos efeitos lipídicos no dobramento e estabilidade de um MP, é necessário preparar um conjunto abrangente de nanodiscos montados com uma variedade representativa de lipídios/misturas lipídicas. Os seguintes lipídios podem dar uma boa seleção inicial: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).
Um protocolo para a preparação de uma reação de 3 mL de CECF é descrito. É possível aumentar ou diminuir ainda mais a escala em uma proporção de 1:1. Para a configuração do CECF de dois compartimentos, deve ser preparado um RM contendo todos os compostos e um FM contendo apenas os compostos de baixo peso molecular. Dispositivos comerciais de diálise de 3 mL com MWCO de 10-14 kDa podem ser usados como recipientes RM, que são então colocados em recipientes de plexiglass feitos sob medida que seguram o FM (Figura 1D)30. A proporção de RM:FM é de 1:20, de modo que 60 mL de FM devem ser preparados para 3 mL RM. Qualidade, concentração ou tipo de vários componentes podem ser críticos para o rendimento final e/ou qualidade do MP sintetizado (Tabela 1). Os modelos de DNA devem ser preparados de acordo com as diretrizes publicadas e a otimização do códon do quadro de leitura do alvo pode melhorar significativamente o rendimento do produto26. Para a reação do CECF em escala preparativa, descreve-se um protocolo estabelecido para a produção de RP. Para estabelecer protocolos de expressão para novos MPs, geralmente é necessário realizar telas de otimização de determinados compostos (Tabela 1) para melhorar o rendimento e a qualidade. Para íons Mg2+ , existe uma concentração ótima bem focada que frequentemente mostra variação significativa para diferentes modelos de DNA. Outros compostos de reação da FC, como novos lotes de lisados T7RNAP ou S30, podem alterar ainda mais a concentração idealde Mg 2 +. Como exemplo, uma tela típica de Mg 2+ dentro da faixa de concentração de14-24 mM e em etapas de 2 mM é descrita. Cada concentração é rastreada em duplicatas e em reacções do CECF à escala analítica. Como recipiente de reação CECF, os recipientes de plexiglas Mini-CECF30 feitos sob medida que contêm o RM são usados em combinação com microplacas padrão de 24 poços que seguram o FM (Figura 1B). Alternativamente, cartuchos de diálise comerciais em combinação com microplacas de poço de 96 profundidades ou outros dispositivos dialisadores comerciais em configurações apropriadas podem ser usados (Figura 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td><td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td><td>Merck (Germany)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Alprenolol hydrochloride</td><td>Merck (Germany)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&amp;reg;</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Type GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor Type 884 124/1</td><td>B.Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td><td>Schott Duran (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5&#039;-triphosphate disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose monohydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectrum&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Labs Spectra/Por&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td><td>Fisher Scientific (Germany)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid calcium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>French pressure cell disruptor</td><td>SLM; Amico Instruments (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (Germany)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&amp;beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 dialysis units</td><td>Scienova (Germany)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N-2&lt;/em&gt;-Hydroxyethylpiperazine-&lt;em&gt;N&#039;-2&lt;/em&gt;-ethansulfonic acid (HEPES)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylphosphocholine</td><td>Antrace (USA)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone/peptone from caseine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump: ip-12</td><td>Ismatec (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (Finland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Nanodrop</td><td>Peqlab (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&amp;reg;</td><td>Tecan (Switzerland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultra sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&amp;rsquo;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 antifoam</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

Os sistemas de expressão livre de células permitem o design personalizado de ambientes de reação para suportar o dobramento funcional de proteínas complexas até mesmo, como proteínas de membrana. Os procedimentos experimentais para a inserção co-translacional e dobramento de proteínas de membrana em membranas pré-formadas e definidas fornecidas como nanodiscos são demonstrados. O protocolo é completamente livre de detergente e pode gerar miligramas de amostras purificadas dentro de um dia. As amostras de proteína/nanodisco de membrana resultantes podem ser usadas para uma variedade de estudos funcionais e aplicações estruturais, como cristalização, ressonância magnética nuclear ou microscopia eletrônica. A preparação de componentes-chave básicos, como lisatos livres de células, nanodiscos com membranas projetadas, soluções de estoque críticas, bem como a montagem de reações de expressão livre de células de dois compartimentos é descrita. Como os requisitos de dobramento das proteínas de membrana podem ser altamente diversos, um dos principais focos deste protocolo é a modulação de parâmetros e etapas de reação importantes para a qualidade da amostra, como compostos críticos básicos de reação, composição de membrana de nanodiscos, ambiente redox e chaperona ou design de modelo de DNA. Todo o processo é demonstrado com a síntese de proteorhodopsina e um receptor acoplado à proteína G.

O impacto dos compostos de reação de ajuste fino no rendimento final ou na qualidade dos MPs sintetizados é exemplificado. Uma abordagem de rotina frequente é ajustar a concentração ideal de Mg2+ em reações de FC pela expressão de proteína fluorescente verde (GFP) como um monitor conveniente da eficiência do sistema. Como exemplo, a GFP foi sintetizada a partir de um vetor pET-21a(+) em concentrações de Mg 2+ entre 14 e24 mM (Figura 2). A análise SDS-PAGE ...

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Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

A inserção co-translacional em nanodiscos pré-formados torna possível estudar proteínas de membrana sintetizadas livres de células em ambientes lipídicos definidos sem contato com detergentes. Este protocolo descreve a preparação de componentes essenciais do sistema e os parâmetros críticos para melhorar a eficiência da expressão e a qualidade da amostra.

Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.3K visualizações.  Goethe University Frankfurt. A inserção co-translacional em nanodiscos pré-formados torna possível estudar proteínas de membrana sintetizadas livres de células em ambientes lipídicos definidos sem contato com detergentes. Este protocolo descreve a preparação de componentes essenciais do sistema e os parâmetros críticos para melhorar a eficiência da expressão e a qualidade da amostra.

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Bioquímica

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Formulação e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a particularly attractive option for studying membrane proteins, especially in the context of ligand-receptor interactions. The method pioneered by Sligar and colleagues is based on the amphipathic properties of an engineered highly a-helical scaffold protein derived from the apolipoprotein A1. The hydrophobic faces of the scaffold protein interact with the fatty acyl side-chains of the lipid bilayer whereas the polar regions face the aqueous environment. Analyses of membrane proteins in nanodiscs have significant advantages over liposome because the particles are small, homogeneous and water-soluble. In addition, biochemical and biophysical methods normally reserved to soluble proteins can be applied, and from either side of the membrane. In this visual protocol, we present a step-by-step reconstitution of a well characterized bacterial ABC transporter, the MalE-MalFGK2 complex. The formation of the disc is a self-assembly process that depends on hydrophobic interactions taking place during the progressive removal of the detergent. We describe the essential steps and we highlight the importance of choosing a correct protein-to-lipid ratio in order to limit the formation of aggregates and larger polydisperse liposome-like particles. Simple quality controls such as gel filtration chromatography, native gel electrophoresis and dynamic light scattering spectroscopy ensure that the discs have been properly reconstituted.

Nanodiscs are small discoid particles that incorporate membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. We provide a visual protocol that shows the step-by-step incorporation of the MalFGK2 transporter into a disc.

Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Biologia

Padrão de proteína reversível controlado por luz em membranas lipídicas

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autor em destaque: Recrutamento de proteínas comutáveis por foto para padrões reversíveis em sistemas celulares artificiais

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Padrões dinâmicos de proteínas induzidas por luz em membranas modelo

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

Bioengenharia

Protein Translocation Machinery on the ER Membrane

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides into the ER lumen and their insertion into the ER membrane.
Sec61 protein conducting channel
In eukaryotes, the translocon complex comprises a core heterotrimeric translocator channel called the Sec61 complex. This channel includes three transmembrane proteins, Sec61&#945;, Sec61&#946;, and Sec61&#947;, and is the largest subunit of the translocon complex. In higher eukaryotes, such as mammals, the channel is capped in its resting state to prevent the leakage of ions like calcium into the cytosol.
Accessory protein complexes associated with the Sec61 channel
Sec62 and Sec63 are integral transmembrane proteins associated with the Sec61 complex. They are primarily involved in the functioning of the Sec61 channel&#39;s lateral gate and aid in the exit of the signal sequence and transmembrane domains into the lipid bilayer.
The translocon-associated protein or TRAP complex is a hetero-tetrameric constitutive subunit of the translocon complex, present behind the Sec61 channel. It assists in the binding of signal peptides having low hydrophobicity to the Sec61 channel. The oligosaccharyltransferase (OST) complex is another closely associated complex, which transfers pre-assembled glycans to select asparagine residues.
Some proteins, like the signal peptidase complex, associate with the translocon complex under specific conditions. For instance, the signal recognition particle receptor (SR) only interacts with the Sec61 channel to hand over the ribosome-nascent peptide complex during active translocation. Other proteins like lectin chaperones (calnexin and malectin) and sensor molecules (IRE1) associate with the translocon to correctly fold the incoming polypeptide or signal misfolded proteins.

Maquinaria de Translocação de Proteínas na Membrana do ER

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides ...

Education

JoVE Core

Biologia Celular

Unidade 1

Transporte Transmembranar no Retículo Endoplasmático e Peroxissomos

TERMOS E CONCEITOS CHAVE

Cotranslational Protein Translocation

Translocation of proteins across membranes is an ancient process that occurs even in bacteria and archaebacteria. In fact, the components of the translocation machinery are still conserved between prokaryotes and eukaryotes.
Sec61 channel partners for cotranslational translocation
During cotranslational translocation, the Sec61 channel partners with the signal recognition particle (SRP), the signal recognition particle receptor (SR), and the ribosomes to transport the nascent polypeptide chain into the lumen.
SRP mediates ribosome attachment to the Sec61 complex via the polypeptide exit tunnel of the large ribosomal subunit. The GTPase domains on both SRP and SR carry out GTP hydrolysis, which supports the transfer of the target polypeptide to the Sec61 channel. Subsequently, the ribosomes act as primary translocation motors and push the protein towards the ER lumen. Except for the GTPs spent during peptide chain elongation, no additional energy is expended for the protein to descend through the channel.&#160;
Accessory translocon complex proteins involved in cotranslational translocation
The translocating chain-associating membrane (TRAM) protein and translocon-associated protein (TRAP) complex are auxiliary components associated with the Sec61 channel during SRP-mediated translocation. The TRAP complex is a substrate-specific complex essential for secure anchoring of the signal sequences having low hydrophobicity. Its proteins directly interact with Sec61 and keep the channel in open confirmation to compensate for the weak interaction with the signal sequence.
On the other hand, TRAM is a membrane protein that acts as a chaperone. It assists in folding and membrane integration of cotranslationally translocating proteins.

Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados

Resumo

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Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

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Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

Padrões dinâmicos de proteínas induzidas por luz em membranas modelo

Padrões dinâmicos de proteínas induzidas por luz em membranas modelo

Padrões dinâmicos de proteínas induzidas por luz em membranas modelo

Maquinaria de Translocação de Proteínas na Membrana do ER

Translocação Cotraducional de Proteínas