Este método fornece soluções para as questões biológicas exigentes de hoje. A partir de um experimento FPOP em células, podemos estudar interações proteína-ligantes, locais de interação proteína-proteína e regiões de mudança conformacional. A vantagem dessa tecnologia é o uso de uma plataforma automatizada de seis poços baseada em PLACAs IC-FPOP que torna possível o crescimento de células e a realização de estudos FPOP em células apenas no laser.
Esse método pode ser usado em indústrias farmacêuticas e biotecnológicas, bem como em grandes institutos de pesquisa acadêmica e clínica, especialmente por pesquisadores biológicos em universidades que estudam a dinâmica proteica. Para começar, desaparafusar a incubadora da plataforma do estágio de posicionamento e desconectar as linhas de temperatura, gás e umidificador. Pulverize a incubadora com 70% de etanol e coloque-a na capa de cultura celular.
Remova a placa de seis poços da incubadora da plataforma, proteja a tampa original da placa e confirme a confluência celular usando um microscópio e coloque a placa de seis poços com células confluentes de volta na incubadora da plataforma dentro da capa de cultura celular. Insira três tubos Tygon pré-cortados em cada poço através das portas incorporadas, lavando os tubos nas paredes do poço e fixá-los com anéis impressos 3D personalizados. Prepare um script de software de integração para retirada da bomba.
Use uma bomba peristáltica para remover completamente a mídia celular de todos os seis poços. Os solventes prime em cada canal das outras três bombas peristálticas, em seguida, infundem peróxido de hidrogênio e tampão de saciar em seus respectivos tubos alternados até que os reagentes cheguem às portas da incubadora. Confirme se o raio laser foi angulado corretamente e atinge a incubadora desinibida.
Verifique a energia do laser usando um sensor externo. Prepare o script do software de integração para infusão da bomba após confirmar o alinhamento do feixe. Infundir 200 milimolars de peróxido de hidrogênio a 35 mililitros por minuto no primeiro poço.
Pressione o botão de partida no software laser na marca de cinco segundos para acionar o pulso na marca de 11 segundos no temporizador. Infundir 125 milimões solução quench a 35 mililitros por minuto no primeiro poço imediatamente após o pulso de laser. Mova manualmente o estágio de posicionamento para alinhar o próximo bem com o raio laser e repetir o processo para todos os poços.
Em uma capa de cultura celular, use um raspador de células para transferir as células de cada poço para tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Células centrífugas a 1.200 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernascer e resuspenque as células em 100 microliters de tampão de lise RIPA.
Transfira as células para tubos individuais de polipropileno de 1,2 mililitro. O flash congele todas as amostras em nitrogênio líquido e coloque-as em um congelador de menos 80 graus até usar. Para localizar as modificações do FPOP, analise o lisesato celular digerido usando a análise de espectrometria de massa da cromatografia líquida tandem e, em seguida, calcule a extensão da modificação.
Para confirmar que as condições da incubadora da plataforma são suficientes para a cultura celular na plataforma laser, o GCaMP2 foi transitoriamente transfectado em HEK293T e a eficiência de transfecção para ambas as placas foi avaliada através de imagens de fluorescência. Um ensaio de luciferase foi realizado para quantificar a eficiência da transfecção. As modificações do FPOP nas células HEK293T rotuladas no sistema de fluxo foram comparadas às rotuladas na incubadora da plataforma.
A incubadora da plataforma superou o sistema de fluxo tanto no número de proteínas modificadas quanto na cobertura total de FPOP nessas proteínas. No sistema de fluxo, foram detectados dois peptídeos modificados, fornecendo informações estruturais limitadas. No entanto, cinco peptídeos modificados que abrangem a sequência de actina foram detectados na incubadora da plataforma.
Os espectros tandem MS de actin com proline modificado em ambos os sistemas e peptídeo de actina não modificado são mostrados aqui. Os resíduos modificados do FPOP nas amostras da incubadora da plataforma continham 12 resíduos modificados, três resíduos modificados no sistema de fluxo e um resíduo modificado sobreposto. A análise da LC-MS MS revelou que 792 proteínas foram modificadas pelo In vivo FPOP na incubadora da plataforma em comparação com as 545 proteínas modificadas com o sistema de fluxo.
É imperativo manter as células em condições estéreis. Leve sempre a incubadora da plataforma para o capô de cultura celular estéril para inserir todas as placas, tubos e anéis necessários de seis poços. Isso garante a integridade do experimento.
