Este trabalho é apoiado pela National Science Foundation FIBR (NSF EF-0623664) e IDBR (NSF DBI-0754570). Este trabalho foi parcialmente financiado por fundos da National Science Foundation Grant FIBR 0623664 administrado pelo Centro de Biophotonics, uma Ciência NSF e Centro de Tecnologia, gerido pela Universidade da Califórnia, em Davis, nos termos do Acordo de Cooperação PHY 0120999. A pesquisa de Lisa Lapidus, Ph.D. é apoiado em parte por um Prémio Carreira na Interface Científica do Fundo de Bem-vindo Burroughs.

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Não temos nada a divulgar.

A mistura rápida tem sido uma meta de desenvolvimento para o campo de enovelamento de proteínas por muitos anos porque ele tem sido reconhecido que os processos moleculares de biomoléculas ocorrem em escalas de tempo que variam de picosegundos de segundos. Convencionais stopped-flow misturadores têm tempos mortos de 1-5 ms, que é limitada principalmente pela turbulência. Turbulentos misturadores de fluxo contínuo com tempos de mistura de 30-300 mS têm sido desenvolvidos nos últimos 15 anos por um pequeno número de grupos, mas geralmente exigem altas taxas de fluxo para atingir estes tempos de mistura e, portanto, usar um monte de amostra 6-8. Este protocolo descreve o uso de microfluídicos fichas de mistura para alcançar uma rápida diluição no regime de fluxo laminar. Existem múltiplas vantagens para trabalhar dentro deste regime, mas um um primário é a capacidade para simular todo o processo de mistura com elevada precisão, que permite uma para modificar a resposta de mistura. T-misturadores desenvolvidos por outros grupos com geom simplesetries demonstraram tempos de mistura de 100-200 mS que foram principalmente limitada pelo tamanho da canais 9-10. Por dimensionar o tamanho dos canais a 10 uM Cavaleiro reduziu o tempo de mistura a ~ 10 microsiemens 11. Yao e Bakajin mostraram que pequenas mudanças na geometria poderia levar a melhorias significativas no tempo de mistura 4. No entanto, que o trabalho mostrou que a aceleração da mistura pode também conduzir a fases mais lentas também. O desenho utilizado neste trabalho 12-13 é um compromisso entre os dois melhores modelos em referência 4 para minimizar o mais lento de decaimento exponencial na concentração de desnaturante e também para fazer a característica mais reprodutível em condicionamento DRIE. Tem havido alguma controvérsia no campo de ultra-rápida misturados durante a definição do tempo de mistura. É importante reconhecer a diferença entre &quot;tempo de mistura&quot; e &quot;tempo morto&quot;. O tempo morto é definido num misturador turbulento como o tempo durante o qual uma MEDIÇÃOt não pode ser feita, e pode de facto ser significativamente mais longo do que o tempo real de mistura. É tipicamente determinada por fazer várias medições de uma reacção bimolecular pseudo-primeira ordem (tais como supressão da fluorescência de triptofano por N bromosuccinate) a várias concentrações. Os decai observados exponenciais estão equipados para convergir em um único valor assumido como sendo t = 0 S e que o tempo entre o ponto eo primeiro ponto medido é o tempo morto. Para misturadores de fluxo laminar, as medições podem ser feitas durante o processo de mistura para que não haja tempo morto, apenas um tempo de mistura. O tempo de mistura é simplesmente o tempo de combinar duas soluções até uniformidade suficiente é atingido. Nós previamente definido o tempo de mistura para ser um tempo 90/10, o tempo para a concentração de desnaturante para diminuir de 90% a 10% do valor não misturado. No entanto, a forma da curva de mistura não é perfeitamente simétrica com a cauda do decaimento tendo um pequeno componente exponencial. Além disso, dobrar a proteína tem umaltamente dependência não-linear da concentração de desnaturante de modo que a dobragem pode, muitas vezes mesmo se iniciar o desnaturante só é reduzido por duas vezes. Portanto, temos, mais recentemente, o tempo de mistura definido como o tempo para reduzir a concentração de desnaturante de 80%. Certamente outras definições podem ser usados, dependendo dos requisitos da experiência. A utilização deste misturador para estudar enrolamento de proteínas tem consistentemente revelou resultados surpreendentes. Folding de citocromo c e apomyoglobin têm sido estudadas para ter várias etapas de dobramento e os resultados iniciais com misturadores de fluxo contínuo mostrou queda para ocorrer no ~ 100 mS prazo 10,14-15. Os nossos medições com este misturador mostrou que haja pelo menos 2 passos nesta escala de tempo, uma muito rápida, provavelmente não específica colapso, (como medido por Trp mudança de fluorescência espectral) dentro do tempo de mistura do misturador seguido por uma fase mais lenta (como medido pela têmpera do total de emissão Trp), que é provável que o first formação da estrutura nativa 5. Observamos, também, um processo de 50 mS no domínio da proteína L B1, derrubando a interpretação convencional que essa proteína é uma pasta 2-estado 13. Uma vantagem deste misturador rápido é que ele pode sondar a dobragem dos mais rápidos proteínas de dobragem que geralmente têm sido apenas mensurável por nanossegundos T salto-instrumentos. T-salto tipicamente requer a observação de dobragem / desdobramento relaxamento perto da temperatura de fusão da proteína e, portanto, nunca se segue a dobra de toda a população. Com esta mesa vimos a dobra de γ-repressor (λ 6-86) com ambos emissão total Trp e mudança espectral e encontraram evidências de que a proteína tem nenhuma barreira para dobrar sob fortes condições dobráveis ​​que não eram acessíveis a T anteriores -pular medições 12. Finalmente, medimos o dobramento da headpiece vilina HP-35, um dos tele mais rápidos pastas ainda medidos e verificou que a taxa de dobragem medido após a mistura é de ~ 5 vezes mais lento do que medido por T-jump sob as mesmas condições de 16. Isto sugere que a cinética de dobragem depende das condições de partida, a capotagem um pressuposto importante no campo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> AZ P4110 Photoresist </td><td> Materiais AZ eletrônicos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 Desenvolvedor K </td><td> Materiais AZ eletrônicos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baker PRS 2000 Stripper fotorresiste </td><td> Performance Materials Avantor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond Technologies </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 wafer de cobertura mM </td><td> SENSOR Prep Serviços </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espessura: 0,5 mm ± 0,025 milímetros Tolerâncias padrão (exceto quando indicado) Revestimento de superfície: SI: 4-8a; SII: 8-12a Flats: Um primária de DST-SEMI; Um Scribe Limpa e polida, os dois lados </td></tr><tr><td> 170 wafer de cobertura mM </td><td> SENSOR Prep Serviços </td><td> 7980 Wafers 2G </td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espessura: 0,17 mm ± 0,025 milímetros Tolerâncias padrão (exceto quando indicado) Revestimento de superfície: SI: 4-8a; SII: 8-12a Flats: Um primária de DST-SEMI; Um Scribe Limpa e polida, os dois lados </td></tr><tr><td> Etcher iônica reativa profunda para os óxidos </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Argon Laser Ion </td><td> Cambridge Laser Laboratories </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> lambda = 258 nm </td></tr><tr><td> Argon Laser Ion </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> lambda = 488 nm </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Olimpo </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Objetiva do microscópio </td><td> Thor Labs </td><td> RLO LMU-UVB 40X-0.5 NA </td><td> lambda = 258 nm </td></tr><tr><td> Objetiva do microscópio </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> lambda = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio Tradução Motorizada </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-12-6436 Series </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Photon Contador </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochrometer </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Andor Tecnologia </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de guanidina (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic mixers for studying protein folding

O processo pelo qual um dobras de proteínas em sua conformação nativa é altamente relevante para a biologia e saúde humana mas ainda pouco compreendido. Uma razão para isso é que a dobragem tem lugar durante um vasta gama de escalas de tempo, a partir de nanosegundos em segundos ou mais, dependendo da proteína 1. Convencionais stopped-flow misturadores têm permitido a medição da cinética de dobragem a partir de cerca de 1 ms. Recentemente, desenvolvemos um misturador de microfluídica que dilui desnaturante ~ 100 vezes em ~ 8 mS 2. Ao contrário de um misturador de stopped-flow, este misturador opera no regime de fluxo laminar em que a turbulência não ocorre. A ausência de turbulência permite simulação numérica precisa de todos os fluxos dentro do misturador com excelente concordância para experimentar 3-4. O fluxo laminar é conseguida por números de Reynolds Re ≤ 100. Para soluções aquosas, isto requer geometrias escala mícron. Nós usamos um substrato duro, tal como silício ou sili fundidaca, para fazer canais iM 5-10 de largura e 10 uM de profundidade (ver Figura 1). As menores dimensões, na entrada para a região de mistura, são da ordem de 1 mícron de tamanho. O chip é selado com um fino ou de vidro de sílica fundida lamela para o acesso óptico. Típicos totais taxas de fluxo linear são ~ 1 m / s, Re rendendo ~ 10, mas o consumo de proteínas é apenas ~ 0,5 nL / s ou 1,8 uL / hr. A concentração de proteína depende do método de detecção: Para triptofano fluorescência a concentração típica é de 100 uM (para 1 Trp / proteína) e para FRET a concentração típica é de ~ 100 nM. O processo de dobragem é iniciada por diluição rápida de desnaturante a partir de 6 M a 0,06 M de hidrocloreto de guanidina. A proteína em desnaturante alta flui para baixo de um canal central e está reuniu-se em ambos os lados na região de mistura por tampão sem desnaturante movendo ~ 100 vezes mais rápido (ver Figura 2). Esta geometria faz com que a constrição do fluxo rápido de proteína em uma estreitajet ~ 100 nm de largura. A difusão das moléculas de luz desnaturantes é muito rápida, enquanto que a difusão das moléculas de proteína pesados ​​é muito mais lenta, difundindo menos do que 1 mícron de 1 ms. A diferença de difusão constante do desnaturante e os resultados de proteína em diluição rápida do desnaturante a partir do fluxo de proteínas, reduzindo a concentração eficaz do desnaturante em torno da proteína. O jacto de proteína flui a uma taxa constante para baixo o canal de observação e de fluorescência da proteína durante a dobragem pode ser observada usando um microscópio confocal de varredura 5.

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Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Neste trabalho, explicar a fabricação ea utilização de um misturador microfluídico capaz de mistura de duas soluções em ~ 8 mS. Nós também demonstrar a utilização destes misturadores com detecção de fluorescência utilizando espectroscopia de UV e de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).

Misturadores microfluídicos para Estudar o dobramento de proteínas

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

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Bioengineering

14.9K visualizações.  Michigan State University. Neste trabalho, explicar a fabricação ea utilização de um misturador microfluídico capaz de mistura de duas soluções em ~ 8 mS. Nós também demonstrar a utilização destes misturadores com detecção de fluorescência utilizando espectroscopia de UV e de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).