Agradecemos ao grupo Kenis na Universidade de Illinois em Urbana-Champaign para discussões úteis e generosamente proporcionar a utilização de instalações de salas limpas. Este trabalho foi financiado por um Pathway NIH para Independence Award PI, sob Grant No. 4R00HG004183-03 (Charles M. Schroeder e Melikhan Tanyeri). Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation através de uma Bolsa de Investigação Pós-Graduação para Eric M. Johnson-Chavarria.

A armadilha consiste em uma hidrodinâmica de duas camadas híbridas dispositivo (PDMS (polidimetilsiloxano) / vidro) microfluídicos para confinamento de partículas. Os passos 1-2 descrevem a fabricação de dispositivos microfluídicos e Passos projeto de dispositivos 3-4 discutir e operação. 1. SU-8 Fabricação Mold (não mostrado no vídeo) <ol><li> Limpe duas lâminas de silício (3 &quot;de diâmetro) com acetona e álcool isopropílico (IPA). </li><li> Bolachas secas com N 2 e colocá-los numa placa de aquecimento a 65 ° C por 1 min para remover a umidade residual. </li><li> Spin-coat wafer # 1 com SU-8 2050 fotorresiste (PR) por 30 segundos a 4000 rpm para criar um molde de ~ 40 mm de espessura para a camada fluídica. Spin-coat wafer # 2 com PR por 30 segundos a 1500 rpm para criar um molde de ~ 150 mm de espessura para a camada de controle. </li><li> Wafer bake macio # 1 a 65 ° C por 3 min e depois a 95 ° C por 6 min. Wafer bake macia # 2 a 65 ° C por 5 min e depois a 95 ° C por 20 min. </li><li> Expor wafers de UV com suas respectivas máscaras (wafer # 1: portos e canais fluídicos, wafer # 2: port e camada de controle) e intensidade de exposição adequado (~ 150 mJ / cm 2, ~ 260 mJ / cm 2, respectivamente). </li><li> Pós bake wafer # 1 a 65 ° C por 1 min e depois a 95 ° C por 6 min. Pós bake wafer # 2 a 65 ° C por 5 min e depois a 95 ° C por 10 min. </li><li> Desenvolver placas com propileno glicol éter acetato de metila (PGMEA) até que não curado PR é removido. Enxágüe com wafers IPA e seque com N 2. </li></ol> 2. Fabricação de dispositivos microfluídicos <ol><li> Silanizadas a superfície do SU-8 moldes colocando as bolachas em um dessecador sob vácuo para ~ 10 min com um prato de vidro, contendo algumas gotas de triclorosilano. Silanização da superfície auxilia na descascar as réplicas (PDMS) fora dos moldes SU-8. </li><li> Misture e degas PDMS na base: relações reticulador de 15:1 e 5:1 para o fluídica e camadas de controle, respectivamente. </li><li> Spin-coat a mistura PDMS 15:01 no molde camada fluídica (wafer # 1) por 30 segundos a 750 rpm e em seguida, coloque a bolacha em uma placa de Petri. Coloque o molde camada de controle em uma placa de Petri e despeje a mistura 05:01 PDMS no molde a uma espessura de ~ 4 mm. </li><li> Wafers assar / PDMS por 30 min a 70 ° C para curar parcialmente as camadas PDMS. </li><li> Após esfriar o wafers / PDMS à temperatura ambiente, corte a réplica PDMS, que irá formar a camada de controle (wafer # 2), a partir da placa de Petri com um bisturi e retire-a do molde SU-8. Perfurar uma porta de acesso ao microcanais que atuará como a válvula de membrana em-chip com uma agulha de calibre 21. </li><li> Lugar a réplica PDMS com a camada de controle sobre o wafer # 1 (que tem o spin-revestido PDMS camada fluídica). Alinhe cuidadosamente e selar a camada de controle para a camada fluídica usando um microscópio estéreo. Certifique-se de remover todas as bolsas de ar entre as camadas e leve ao forno a 70 ° C durante a noite para curar completamente as duas camadas. Esta etapa de cozimento irá resultar em uma laje de PDMS monolítico com duas camadas. </li><li> Após o resfriamento à temperatura ambiente, cortar e descascar a réplica PDMS contendo tanto o controle e as camadas fluídicas fora do SU-8 molde com um bisturi. Retire o excesso e separar PDMS cada unidade dispositivo com uma lâmina de barbear. Furador portas de acesso para os microcanais na camada fluídica com uma agulha de calibre 21. </li><li> Ligação da laje do PDMS a uma lamela para obter um dispositivo completo. Primeiro, limpe uma lamela (No: 1.5, 24 x 45 mm) com acetona e IPA. Em seguida, tratar tanto a lamela e as superfícies PDMS réplica com plasma de oxigênio abaixo de 500 mTorr por 30 segundos e, imediatamente, levar as duas superfícies em contato para formar um selo irreversível. </li><li> Asse os dispositivos durante a noite para aumentar a adesão entre as camadas de PDMS ea lamela. </li></ol> Descrever os passos 3-4 implementação da armadilha hidrodinâmico usando o dispositivo micro descrito acima. 3. Setup Armadilha hidrodinâmico Experimental <ol><li> Coloque o dispositivo microfluídicos para o palco de um microscópio invertido e prenda com grampos palco. </li><li> Encher dois à prova de gás seringas separadamente com soluções tampão e amostra e colocá-los em uma bomba de seringa Harvard Apparatus (PHD 2000 Programável). O buffer e as soluções da amostra são entregues ao dispositivo micro através de um 1 ml e uma seringa de 250 L, respectivamente. Tipicamente, a 50 mM Tris / HCl solução tampão Tris (pH 8,0) contendo 0,02% v / v Triton X-100 é usado como solução tampão. A solução da amostra é constituída por uma suspensão de partículas (por exemplo, esferas de poliestireno fluorescente) na solução tampão. </li><li> Estabelecer as conexões entre as seringas fluídico (entregar a amostra eo buffer) eo dispositivo microfluídicos. Conectar as seringas para 1 / 16 &quot;de diâmetro externo (OD) x 0,020&quot; de diâmetro interno (ID) perfluoroalcoxi tubo (PFA) usando adaptadores luer-lock. Ligue a outra extremidade do tubo de PFA para os portos de entrada do dispositivo micro com 24 meta avaliarl tubulação. A T-válvula pode ser colocado entre a seringa amostra eo porta amostra no dispositivo microfluídicos para controlar a entrega da amostra. </li><li> Estabelecer as ligações fluídico para os canais de saída no dispositivo microfluídicos. Conectar os dois canais de saída para tubos de PFA (1 / 16 &quot;OD x 0.020&quot; ID), utilizando 24 tubos de metal calibre. A tubulação PFA para as tomadas devem ser de igual comprimento. Tubos submergir ambas tomada em um tubo de centrífuga de 1,5 mL preenchido com solução tampão, que serve para manter uma queda de pressão constante entre as seringas e os canais de saída. </li><li> Encha a válvula on-chip com transportadora de petróleo fluorados usando uma seringa de plástico 3 mL luer-lock para impedir que o ar vaze para a camada fluídica durante a operação. O ar na câmara de válvula é empurrado através da membrana PDMS no microcanais na camada fluídica e, posteriormente, removido do dispositivo com o fluxo do fluido através das portas de saída. </li><li> Conectar um gás inerte sob pressão de alimentação (nitrogênio) para a porta na camada de controle on-chip para operação da válvula. Para este fim, usamos um tanque de nitrogênio (2200 psi) e um regulador de pressão eletrônico para o fornecimento 0-30 psi à válvula on-chip no aparelho microfluídicos. O tanque de nitrogênio é ligado ao regulador de pressão utilizando ¼ &quot;OD x 0,170&quot; tubo de ID. O regulador de pressão é conectado ao dispositivo micro através de 1 / 16 &quot;OD x 0.020&quot; ID tubulação PFA com 24 tubos de metal calibre em seu término. </li><li> Lave as ligações fluídicas eo dispositivo micro com 0,5 mL de solução-tampão para garantir que todas as bolhas de ar são removidas do sistema, incluindo os canais de saída. Típicas taxas de fluxo usado para limpar faixa de bolhas entre 2000-5000 mL / hr. Após as bolhas de ar são lavados para fora dos canais microfluídicos, reduzir a taxa de fluxo de 50-100 mL / h, que é uma taxa de fluxo volumétrico típico para a captura de partículas. </li><li> Neste ponto, as conexões são estabelecidas fluídico, a amostra e as soluções tampão são entregues ao dispositivo micro a um fluxo fixo (5-10 mL / hr), e o dispositivo está pronto para capturar hidrodinâmico. </li></ol> 4. Procedimento Trapping hidrodinâmica <ol><li> Executar o custom-built código LabVIEW, que automatiza armadilhas de partículas (ver nota de Utilização de LabVIEW código abaixo). </li><li> Usando o microscópio xy tradução estágio posição, a região captura (cross-slot) no centro da visão da câmera. Traga a região armadilhas em foco da lente objetiva e ajustar as configurações da câmera para otimizar as condições de imagem. </li><li> Escolha uma região retangular de interesse (ROI) dentro do campo da câmera de vista de tal forma que o centro do ROI será a posição do centro armadilha. </li><li> Inicializar a pressão compensada aplicada à válvula on-chip. Em um dos canais de saída, uma constrição mM 100-200 gama é introduzida para fornecer uma pressão de deslocamento para a válvula on-chip. A pressão de off-set constante permite a válvula on-chip para ajustar a posição do ponto de estagnação nas imediações do centro do canal cruz-slot. Para a maioria dos experimentos, a pressão de deslocamento é ajustada entre 0-12 psi dependendo das dimensões do canal (altura e largura), a largura da constrição, e as especificações da válvula on-chip (tamanho da válvula, a espessura da membrana, etc.) </li><li> Iniciar o controlador de feedback e ajustar o ganho proporcional para otimizar a resposta armadilha. O controlador de realimentação irá ajustar a pressão aplicada à válvula on-chip, a fim de mover a posição de ponto de estagnação, o que minimiza o erro ou a distância entre a posição da partícula eo ponto de ajuste (centro armadilha). Dependendo do caudal e da posição da válvula on-chip, existe um valor de ganho proporcional ideal, o que aumenta a estabilidade armadilha e elimina oscilações de partículas indesejadas. </li><li> Armadilha uma partícula. O código de LabVIEW automaticamente armadilha uma das partículas que entram na região de captura. Uma vez que uma partícula desejado está preso, é possível desligar o fluxo da amostra e isolar a partícula presa em solução tampão, se desejar. </li><li> Monitorar a partícula preso e manter o foco de partículas dentro do plano da imagem usando foco manual ou um microscópio de configuração automática de foco. Pode ser necessário ajustar um pouco o ganho proporcional do controlador de realimentação, a fim de assegurar a estabilidade armadilha durante o curso de um evento de captura longa escala de tempo (minutos a horas). </li></ol> Código LabVIEW: Nota de Utilização de Controlador de comentários Captura de partículas automatizado é obtida utilizando um algoritmo de controle de feedback linear implementado usando um código LabVIEW personalizado. O código de LabVIEW capta imagens de uma câmera CCD e transmite um potencial elétrico (tensão) a um regulador de pressão, que modula a posição ativa (estado parcialmente aberto / fechado) de uma válvula pneumática on-chip dinâmico. Como a válvula muda de posição, a taxa de fluxo hidrodinâmico em uma linha de saída is ajustado, assim, re-posicionar o ponto de estagnação e permitindo captura hidrodinâmico. As etapas do ciclo de feedback são seqüencialmente e iterativamente executado a uma taxa de captura de imagens (10-60 Hz). O código de LabVIEW executa os seguintes passos durante cada ciclo de retroalimentação: <ul><li> . Captura de imagem Uma imagem é adquirida por um &quot;target&quot; de partículas na região de captura do dispositivo micro usando microscopia de fluorescência com uma lente objetiva de 10x (NA: 0,4) e uma câmera CCD. </li><li> Rastreamento de partículas posição centróide. Partículas é determinado, eo algoritmo de rastreamento de partículas é iniciada. Partículas são localizados pela montagem do perfil de intensidade de emissão da partícula para uma função propagação do ponto (PSF), a partir do qual a posição do centróide é determinado. </li><li> Controle de fluxo de campo. A pressão atualizados destinado a válvula on-chip dinâmico é calculado utilizando um algoritmo de controle de feedback com um controlador proporcional. Desta forma, a ação da válvula é a re-posicionar o ponto de estagnação, que exerce uma força hidrodinâmica sobre a partícula, a fim de orientar a partícula em direção ao centro armadilha. </li></ul> O código de LabVIEW registra os seguintes dados para cada imagem capturada durante a captura de partículas: 1) o tempo decorrido, 2) centróide (x, y de posição) da partícula presa, 3) posição do centro armadilha, 4) a distância da partícula do pressão armadilha centro, 5) aplicada à válvula on-chip. Além disso, o código também grava um filme da partícula preso em formato de arquivo AVI. 5. Resultados representante Nós preso esferas de poliestireno fluorescentes de vários tamanhos (100, 540, 830 nm, diâmetro e 2,2 mm) usando uma armadilha hidrodinâmico. Figura 1 (a) mostra uma imagem de uma partícula presa na junção cruzada slot-in um dispositivo micro. A trajetória de uma partícula presa pode ser determinada diretamente a partir dos dados gravados por posição centróide o código LabVIEW durante um evento de captura ou através do rastreamento e localização de uma partícula presa a partir do arquivo de filme gravado. Figura 1 (b) mostra a trajetória de uma partícula presa (2,2 mM fluorescentes poliestireno talão) ao longo da direção do canal de saída. O talão é inicialmente preso (quadrados) por 3 min e depois é liberado da armadilha e foge junto a um dos canais de saída (círculos). Trajetórias de partículas ao longo do eixo de compressão de fluxo (direção do canal de entrada; dados não mostrados) são semelhantes às trajetórias de partículas ao longo do eixo do fluxo extensional (direção de saída), como mostrado na Figura 1 (b). Um histograma de deslocamento de partículas do centro da armadilha para um cordão preso (2,2 de diâmetro mm) ao longo das direções do canal de saída é mostrado na Figura 1 (c). Usando o algoritmo de controle de feedback descrito neste trabalho, as partículas presas estão confinados dentro de ± 1 mícron do centro da armadilha ao longo do canal de entrada e saída de direções. Um esquema do dispositivo micro usado para capturar hidrodinâmico é mostrado na Figura 2. O dispositivo integrado microfluídicos consiste de uma camada fluídica e uma camada de controle e é fabricada utilizando litografia de multicamadas padrão suave como descrito neste artigo. A camada fluídica contém os canais tampão e amostra, bem como a geometria do canal cruz-slot para facilitar a captura hidrodinâmico. A camada de controle consiste em uma válvula pneumática posicionados acima de um dos canais de saída na camada fluídica, eo controle e camadas de fluidos são separados por uma membrana elastomérica fina. Durante a operação do dispositivo, a válvula na camada de controle é pressurizado com gás nitrogênio, o que obriga a fina membrana na camada fluídica, induzindo uma constrição no canal de saída. A válvula pneumática dinâmica contrai o canal de saída por quantidades variáveis, alterando a pressão aplicada na camada de controle, que ajusta as taxas de fluxo relativo na tomada de canais e permite fina escala o controle do ponto de estagnação. <img src="/files/ftp_upload/2517/2517fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Trapping de partículas. (A) Imagem de um talão única confinada na armadilha hidrodinâmico. Além do talão no centro armadilha, várias contas untrapped são mostradas na região de captura. (B) Trajetória de uma partícula presa ao longo dos canais de saída (quadrados). Quando a partícula é liberada da armadilha (seta), que escapa ao longo de um dos canais de saída (círculos). (C) Histograma dos deslocamentos de um talão presos (2,2 de diâmetro mm) do centro da armadilha ao longo dos canais de saída. <img src="/files/ftp_upload/2517/2517fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2:. Esquemática do dispositivo micro para capturar hidrodinâmica hidrodinâmico A armadilha é construído utilizando um dispositivo de duas camadas microfluídicos. A camada de fluidos consiste de uma entrada da amostra, fnossas enseadas buffer, e duas saídas de resíduos. A camada de controle consiste de uma válvula pneumática de membrana situada no topo de um dos canais de saída na camada fluídica. A constrição no canal de saída opostas fornece uma pressão de deslocamento para a válvula pneumática. Dimensões canal típicos variam entre 100-500 mM. Na região (A), é o fluxo de entrada da amostra focada por duas entradas de buffer. Na região (B), fluxos de entrada de oposição convergem na junção cruzada slot-trapping onde ocorre. A válvula pneumática (C) é posicionado no topo de um dos canais de saída. A posição do ponto de estagnação é modulado pela regulação da pressão a esta válvula.

<ol>
	<li>Tanyeri, M., Johnson-Chavarria, E. M., Schroeder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Trap+for+Single+Particles+and+Cells.">Hydrodynamic Trap for Single Particles and Cells.</a> Applied Physics Letters. 96, 224101-224101 (2010).</li><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+Single-Beam+Gradient+Force+Optical+Trap+for+Dielectric+Particles.">Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles.</a> Optics Letters. 11, 288-290 (1986).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+Micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: Micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).</li><li>Chiou, P. Y., Ohta, A. T., Wu, M. C., C, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+manipulation+of+single+cells+and+microparticles+using+optical+images.">Massively parallel manipulation of single cells and microparticles using optical images.</a> Nature. 436, 370-372 (2005).</li><li>Cohen, A. E., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+trapping+and+manipulating+nanoscale+objects+in+solution.">Method for trapping and manipulating nanoscale objects in solution.</a> Applied Physics Letters. 86, 093109-09 (2005).</li><li>Evander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+acoustic+cell+trapping+in+a+microfluidic+perfusion+system+for+online+bioassays&amp;quot;,+Analytical+Chemistry+79.">Noninvasive acoustic cell trapping in a microfluidic perfusion system for online bioassays&amp;quot;, Analytical Chemistry 79.</a> , 2984-2991 (2007).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Kim, M. C., Wang, Z. H., Lam, R. H. W., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+better+cell+trap:+Applying+Lagrangian+modeling+to+the+design+of+microfluidic+devices+for+cell+biology.">Building a better cell trap: Applying Lagrangian modeling to the design of microfluidic devices for cell biology.</a> Journal of Applied Physics. 103, (2008).</li><li>Lutz, B. R., Chen, J., Schwartz, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+tweezers:+1.+Noncontact+trapping+of+single+cells+using+steady+streaming+microeddies.">Hydrodynamic tweezers: 1. Noncontact trapping of single cells using steady streaming microeddies.</a> Analytical Chemistry. 78, 5429-5435 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos atuais de microfluídicos para a manipulação de partículas com base no fluxo hidrodinâmico pode ser caracterizada como métodos baseados em contato ou sem contato. Contato com os métodos baseados em uso de fluxo de fluido para confinar e imobilizar fisicamente partículas contra as paredes do canal microfabricated 9, enquanto o contato de métodos não dependem de circulação de fluxo ou microeddies 10. Neste trabalho, apresentamos um método para solução livre de captura de par...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>21 gauge blunt needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Zephyrtronics</td>
<td> ZT-5-021-1-L</td>
<td>For punching port holes in PDMS</td>
</tr>
<tr>
<td>3 ml plastic syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309585</td>
<td>For filling valve with oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Si wafers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University Wafer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> 3&#x201D; P(100) single side polished 380 &mu;m test grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48404-428</td>
<td>24 x 40 mm #1.5</td>
</tr>
<tr>
<td>DAQ card</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Instruments</td>
<td>PCI 6229</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spherotech</td>
<td>FP-2056-2</td>
<td>2.2 &mu;m Nile red</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorinert </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>FC 40</td>
<td>Fluorinated carrier oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LabVIEW</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Instruments</td>
<td>Version 9.0f3 (32bit)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>MZ6</td>
<td>For aligning PDMS control layer to fluidic layer.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mechanical Convection Oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> VWR</td>
<td>1300U</td>
<td>For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers.</td>
</tr>
<tr>
<td>Microfluidic tubing and connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings</td>
</tr>
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Silicones</td>
<td>RTV 615 A&amp;B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasma Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harrick</td>
<td>PDC-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pressure Transducer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proportion Air</td>
<td>DQPV1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spin Coater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Specialty Coating Systems</td>
<td>G3P-8 Spin Coat</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photoresist</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem</td>
<td>SU 8 2050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD 2000 Programmable</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Terminal Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Instruments</td>
<td>BNC 2110</td>
<td>For analog output to pressure regulator and read out.</td>
</tr>
<tr>
<td>UV Collimated Light Source and Exposure System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OAI</td>
<td>Model 30 Enhanced Light Source</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a microfluidic-based hydrodynamic trap for single particles

A capacidade de limitar e manipular partículas individuais em solução livre é uma tecnologia capacitadora essencial para a ciência fundamental e aplicada. Métodos para a captura de partículas baseado em técnicas ópticas, magnéticas eletrocinética, e acústico têm levado a grandes avanços na física e na biologia molecular que vão desde o de nível celular. Neste artigo, apresentamos uma técnica nova baseada microfluídicos para a captura e manipulação de partículas com base exclusivamente no fluxo de fluido hidrodinâmico. Usando este método, nós demonstramos aprisionamento de partículas micro e nano-escala em soluções aquosas para escalas de tempo. A armadilha hidrodinâmicas consiste de um dispositivo integrado microfluídicos com uma geometria do canal cruz-slot onde duas correntes opostas laminar convergir, gerando um fluxo extensional planar com um ponto de estagnação do fluido (velocidade zero pontos). Neste dispositivo, as partículas estão confinadas no centro armadilha por controle ativo do campo de fluxo para manter a posição da partícula no ponto de estagnação do fluido. Desta forma, as partículas são efetivamente presos em solução livre usando um algoritmo de controle de feedback implementado com um código LabVIEW custom-built. O algoritmo de controle consiste de aquisição de imagem para uma partícula no dispositivo micro, seguido pelo rastreamento de partículas, a determinação da posição da partícula centróide e ajuste ativo de fluxo de fluido através da regulação da pressão aplicada a uma válvula pneumática on-chip usando um regulador de pressão. Desta forma, o on-chip funções da válvula de medição dinâmica para regular as taxas de fluxo relativa nos canais de saída, permitindo fina escala de controle de posição estagnação ponto e captura de partículas. A armadilha hidrodinâmico microfluídicos baseados apresenta várias vantagens como um método para a captura de partículas. Trapping hidrodinâmica é possível para qualquer partícula arbitrária sem requisitos específicos sobre as propriedades físicas ou químicas do objeto preso. Além disso, prendendo hidrodinâmica permite o confinamento de um objeto alvo &quot;single&quot; de partículas em suspensões concentradas ou lotado, o que é difícil usar a força métodos alternativos baseada em campo com armadilhas. A armadilha hidrodinâmico é user-friendly, fácil de implementar e pode ser adicionado ao existente dispositivos microfluídicos para facilitar a análise de captura e de longa data de partículas. No geral, a armadilha hidrodinâmica é uma nova plataforma para o confinamento, micromanipulação, e observação de partículas, sem a imobilização de superfície e elimina a necessidade de potencialmente perturbativos campos ópticas, magnéticas e elétricas no aprisionamento solução livre de partículas pequenas.

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A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Neste artigo, apresentamos um método baseado em microfluídicos para o confinamento de partículas com base no fluxo hidrodinâmico. Demonstramos prendendo partículas estáveis ​​em um ponto de estagnação de fluidos utilizando um mecanismo de controle feedback, permitindo assim confinamento e micromanipulação de partículas arbitrário em um microdispositivo integrado.

A Armadilha hidrodinâmica microfluídicos baseados em partículas individuais

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

a-microfluidic-based-hydrodynamic-trap-for-single-particles

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SCIENTISTS IN ACTION

16.6K visualizações.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Neste artigo, apresentamos um método baseado em microfluídicos para o confinamento de partículas com base no fluxo hidrodinâmico. Demonstramos prendendo partículas estáveis ​​em um ponto de estagnação de fluidos utilizando um mecanismo de controle feedback, permitindo assim confinamento e micromanipulação de partículas arbitrário em um microdispositivo integrado.

Vídeo: A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Bioengenharia

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocolo Relativo Avaliação hidrodinâmica de Tri-folheto polímero Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Plataforma microfluídico com multiplexada detecção electrónica do Ordenamento do Rastreamento de Partículas

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...