Imagens vibracionais altamente multiplexadas fornecem uma abordagem óptica de um tiro para interrogar múltiplos marcadores proteicos em tecidos com resolução subcelular. Esta plataforma fornece uma imagem abrangente das interações proteicas dos sistemas biológicos. A principal vantagem dessa técnica é sua multiplexidade livre de ciclos.
Esta técnica é particularmente adequada para aplicações onde as estratégias de ciclismo não funcionam bem, como em seções de tecido grosso. Esse método permite a caracterização celular individual in situ para a compreensão de estruturas do sistema complexo, como a construção de atlas tecidual, micro ambientes tumorais fenotínuos e o circuito cerebral de criação de perfil. Para começar, prepare aproximadamente 0,1 bicarbonato de sódio molar no tampão PBS em PHA 0.3 para ser usado como tampão de conjugação e armazená-lo a quatro graus Celsius.
Em seguida, prepare três millimolar n-hidroxisuccinimide ester função solução sonda MARS em sulfóxido de dimetil anidro. Dissolva os sólidos de anticorpos no tampão de conjugação a uma concentração de dois miligramas por mililitro. Para anticorpos dissolvidos em outros buffers, concentre-os em um filtro centrífuga e, em seguida, adicione no tampão de conjugação a uma concentração de um a dois miligramas por mililitro.
Para realizar a reação de conjugação para anticorpos secundários, adicione 15 vezes o excesso molar da solução de corante à solução de anticorpos em um frasco de vidro lentamente com agitação e incubar a mistura de reação à temperatura ambiente com agitação por uma hora. Para realizar a purificação, prepare o chorume adicionando 10 mililitros de pó de resina de filtragem de gel em 40 mililitros de tampão PBS em um tubo de 50 mililitros. Mantenha a solução em um banho de água a 90 graus Celsius por uma hora.
Em seguida, decantar o supernaspe, adicionar o PBS até 40 mililitros, e armazenar o chorume a quatro graus Celsius. Embale a coluna de exclusão de tamanho com a solução de chorume até a altura de 10 a 15 centímetros, depois enxágue e lave a coluna com aproximadamente 10 mililitros de PBS para embalar ainda mais a resina. Posteriormente, pipeta a mistura de reação conjugal à coluna.
Depois de carregar a mistura de reação, adicione imediatamente um mililitro de PBS como o tampão de eluição. Em seguida, colete o eluente da solução conjugada olhando para a cor na coluna ou medindo a absorvância em 280 nanômetros. Usando o filtro centrífugo, concentre a solução coletada em um a dois miligramas por mililitro.
Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um limite em torno das seções teciduais na lâmina. Em seguida, incubar os tecidos com 0,3 a 0,5% PBST por 10 minutos e um tampão de bloqueio por 30 minutos. Para preparar a solução primária de coloração, adicione todos os anticorpos primários a 200 a 500 microliters de tampão de coloração nas concentrações desejadas.
Centrifugar a solução de coloração primária a 13.000 vezes G por cinco minutos e use o supernatante se o precipitado aparecer. Em seguida, incubar o tecido na solução de anticorpos primários a quatro graus Celsius por um a dois dias. Lave os slides três vezes com 0,3 a 0,5% PBST por cinco minutos em temperatura ambiente em um frasco de slides e certifique-se de que os tecidos estão imersos na solução.
Mais tarde, incubar o tecido em 200 a 500 microliters de tampão de bloqueio por 30 minutos. Para preparar a solução de coloração secundária, adicione todos os anticorpos secundários a 200 a 500 mililitros de tampão de coloração com concentrações desejadas. Em seguida, centrifugar a solução de coloração secundária a 13.000 vezes G por cinco minutos e usar o supernatante se precipitar aparecer.
Em seguida, incubar os tecidos em 200 a 500 microliters de solução de anticorpos secundários a quatro graus Celsius por um a dois dias. Em seguida, lave os slides duas vezes com 0,3 a 0,5% PBST em temperatura ambiente por cinco minutos cada. Além disso, incubar com 200 a 500 microliters de solução DAPI por 30 minutos.
Novamente, lave os slides três vezes com PBS à temperatura ambiente por cinco minutos cada e transfira as seções de tecido flutuante para as lâminas de vidro com a pipeta de queda de vidro. Espalhe o tecido com uma escova de tecido e limpe o ambiente com lenços umedecidos, se necessário. Posteriormente, monte o tecido em uma gota de reagentes anti-desbotados com uma mancha de vidro e fixe-o com esmalte.
Para realizar imagens multicanal-eprSRS, defina a potência laser do feixe da bomba para 10 a 40 miliwatts e o feixe de stokes para 40 a 80 miliwatts no painel de controle a laser. Em seguida, defina o tempo de habitação do pixel para dois a quatro microssegundos e use vários quadros em média de 10 a 20 quadros no software de microscopia. Além disso, defina as constantes de tempo do amplificador de travamento para metade do tempo de moradia dos pixels.
A imagem de corante raman de marcadores proteicos distintos e células HeLa paraformaldeído-fixo cortex cerebral do camundongo e tecido FFPE rim úmido foram realizadas através de rotulagem imuno. A imagem imuno-eprSRS de células HeLa com uma alfa-tubulina revelou estruturas subcelulares finas, como microtúbulos. A imagem eprSRS de Astrócitos Manchados de MARS 2145 e mars 2228 manchados neurônios de grânulo cerebelar no tecido cerebral do camundongo demonstrou padrões tridimensionais com resolução subcelular.
Foi realizada a imagem de fluorescência de rS SRS de sete cores de hormônios e fatores de transcrição no tecido de ilhota congelada do rato. As imagens obtidas revelaram um bom contraste e padrões corretos. Foram realizadas as imagens tandem de fluorescência de oito cores dos marcadores do tipo celular nos tecidos de cerebelo do camundongo fixo paraformaldeído.
Diferentes tipos de células foram identificadas, como neurônios de grânulo cerebelar, neurônios Purkinje, astrócitos, oligodenrócitos e neurônios GABAérgicos. Este procedimento pode ser ainda mais combinado com a limpeza tecidual para realizar imagens de proteínas altamente multiplexadas em tecidos intactos espessos. Nosso grupo desenvolveu um protocolo de limpeza de tecido sob medida para isso.
