Este trabalho foi financiado pela NSF prêmio DBI 0852891. Parte deste trabalho também foi financiado pelo Centro de Biophotonics Ciência e Tecnologia, um designado NSF Centro de Ciência e Tecnologia gerido pela Universidade da Califórnia, Davis, no âmbito do Acordo de Cooperação n º PHY0120999.

1. Alguns cuidados devem ser tomados na preparação e colocação de uma amostra de Raman dentro deste sistema. <ol><li> Porque o sistema normalmente faz uso de muito alta abertura numérica com objetivos muito curta distâncias de trabalho, as amostras são colocadas em uma lamela. Amostras biológicas são normalmente colocados em uma lamela espessura No. 1 montado em uma câmara de célula Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA). </li><li> Amostras líquidas, em particular os tóxicos para os seres humanos, são colocados em um pequeno frasco de vidro com uma lamela cimentado à abertura por meio de um epóxi silicone. A garrafa é então invertido para a medição. </li><li> Porque o nosso sistema depende momento preciso da bomba e pulsos de sinal, somos constrangidos a não utilizar o ajuste do foco do nosso microscópio convencional, o que traduz o objetivo cima e para baixo. Isso adiciona e subtrai caminho óptico do nosso sistema. Em vez disso, nós colocamos as nossas amostras em um palco secundário montado em cima do palco microscópio que tem controle de foco independente. </li></ol> 2. A fim de ter tempo de gated espectros Raman, o feixe de excitação deve ser devidamente preparado. <ol><li> Começamos com a luz saindo de um 2,4 W sintonizável pulsado de Ti: Sapph laser (Chameleon, sistemas coerentes, Santa Clara, CA). Cada pulso na década de 80 MHz trem de pulsos tem 30 nJ de energia, tem uma largura temporal de 140 fs, e tem um espectro centrado em 808 nm com uma largura de banda espectral de ~ 6 nm. </li><li> Para evitar back-reflexões a partir de re-entrada na cavidade laser, a luz é transmitida através de um isolador Faraday. Uma placa de meia onda colocado antes do isolador Faraday permite ajuste contínuo da potência total enviado para o sistema. </li><li> Porque 6 nm é muito ampla largura de banda para resolver uma maioria dos modos de Raman, o feixe é enviado através de um filtro de banda muito estreita (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) centrado em 808 nm. </li><li> A luz é, então, focalizada por um gibão acromática (f = mm 100) em um 5 milímetros de borato de bário-β (BBO) cristal (CASIX, Fuzhou, Fujian, China PR) para reduzir pela metade o comprimento de onda de 808 nm a 404 nm. O cristal BBO é colocado em uma montagem com controles de ponta e de inclinação, e também montado em um estágio de tradução. Para maximizar a eficiência da conversão de comprimento de onda, o cristal deve ser colocado exatamente simétrica sobre o foco do gibão, e com seu eixo de cristal alinhados à polarização do feixe de entrada. </li><li> Porque a eficiência da conversão de comprimento de onda é dependente da polarização, o controle sobre a quantidade de luz enviada para a amostra pode ser obtido pela colocação de uma placa de meia onda segundo após o isolador de Faraday. Rodando este waveplate, a intensidade de luz enviado para a amostra pode ser ajustado independentemente da intensidade enviado no feixe de bomba (a ser discutido abaixo). </li><li> O comprimento de onda da luz é convertida recollimated por um gibão segundo acromática (f = mm 500) escolhidos de forma que o feixe de sair é grande o suficiente para encher a abertura parte de trás da objetiva do microscópio, e dirigido para um microscópio invertido (IX-71, Olympus, Center Valley, PA), por meio de dois espelhos de direção. </li><li> A objetiva do microscópio, sendo o elemento óptico alojados dentro do componente mais monolítico do sistema, define o eixo óptico. Para alinhar o feixe de excitação a este eixo, um espelho é colocado no plano da amostra do microscópio. Os dois espelhos de direção são, então, iterativamente sintonizado enquanto observa o back-raio laser refletida em um CCD cam-era (μEye, IDS, Obersulm, Alemanha) conectada a uma porta de imagem do microscópio. Assumindo que a imagem da câmera é centrada no microscópio de campo de visão, o raio é no eixo quando o ponto focal é centrado no chip de microscópio e tradução do objectivo ao longo do eixo z não altera o ponto central do feixe desfocado. </li><li> Quando uma amostra é colocada no plano da amostra e irradiado com luz laser Raman ocorre. Um filtro dicróica colocada abaixo da objetiva do microscópio separa o comprimento de onda deslocado luz Raman espalhada (e fluorescência) do feixe de excitação, direcionando a luz Raman espalhada para a porta do lado do microscópio. O microscópio foi modificada para remover as lentes dentro desse caminho, de tal forma que a luz do sinal emerge do microscópio colimado. </li><li> Porque o feixe de sinal emergentes do microscópio é maior do que a abertura clara dos polarizadores Glan-Thompson, um telescópio 0.47x confeccionada com dois doublets acromática (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) é usado para reduzir o feixe. </li><li> A luz do sinal é, então, polarizados por um polarizador Glan-Thompson orientada a 0 ° em relação à vertical no referencial de laboratório, e dirigido a um espelho dicróico onde é recombinado com o feixe de bomba. </li></ol> 3. Para que o portão óptica para operar com a máxima eficiência, é preciso ter cuidado na preparação do feixe de bomba (Kerr feixe) também. <ol&gt; <li> O pulso de bomba é ampliada pela primeira 0.35x com um telescópio construído com dois doublets acromática (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) para combinar com o tamanho final do feixe de sinal. </li><li> O feixe de bomba é então enviado para uma linha de atraso composto por um prisma ângulo direito colocado em um estágio de tradução linear que pode ser ajustado para assegurar sobreposição temporal da bomba e pulsos de sinal (ajuste a ser discutido abaixo). </li><li> Após a linha de atraso, o feixe é enviado através de uma placa de meia onda e polarizador orientado a 45 ° em relação à vertical no referencial de laboratório. Isso garante o bom estado de polarização do feixe de bomba quando atinge o meio não-linear. </li><li> A luz é então refletida em dois espelhos de direção, com um piezo-elétrico controles, que são usados ​​para ajustar finamente a posição do feixe de bomba de tal forma que se sobrepõe espacialmente com o feixe de sinal. A sobreposição é obtida observando a bomba e feixes de sinal em dois locais, um próximo e um longe do espelho dicróico onde as vigas são combinados. Usando o espelho de direção primeiro a sobreposição dos dois feixes no ponto próximo, eo espelho piezo a sobrepor-se as vigas no ponto de longe, o feixe de bomba pode ser feita exatamente colinear com o feixe de sinal. </li><li> Com os dois feixes combinado, o portão Kerr e sistema de coleta são criados para maximizar o tempo de gated coletados sinal. </li></ol> 4. Com os dois feixes combinado, o portão Kerr e sistema de coleta são criados para maximizar o tempo de gated coletados sinal. <ol><li> Os feixes de bomba e de sinal são os primeiros passados ​​por um filtro dicróico que tem um OD de 6 em 404 nm para evitar qualquer luz de excitação residual de espalhamento Raman emocionante dentro do meio não-linear. </li><li> A bomba e vigas de sinal são em seguida, ambos focados por um gibão acromática (f = mm 35) numa cuvete caminho ótico 1 centímetro de quartzo contendo o material não-linear. Qualquer material não-linear tendo um alto índice convenientemente não-linear (superior CS 2), e convenientemente curta resposta temporal (&lt;2 ps), pode ser utilizado aqui. Para estes experimentos, usamos dissulfeto de carbono, CS 2, que tem um índice não-linear n 2 = 3,1 x 10 -18 m 2 / W. A luz é então recollimated por um gibão segundo com uma distância focal idêntica à primeira. </li><li> As vigas são então passados ​​através de e Glan-Thompson analisador em um monte de rotação, e depois através de um conjunto de absorção e interferência filtros que combinadas têm um OD de 10 a 808 nm. </li><li> Finalmente, a luz do sinal é focada por um gibão acromática (f = mm 35) em uma fibra multimodo 50 mM óptica, onde a fibra é montado em um palco que permite a tradução em x, y, e z. A fibra é então acoplado a um espectrógrafo de imagem comercial com anexado câmera CCD (SP2300i e Pixis 100B, respectivamente, ambos fabricados pela Princeton Instruments, Trenton, NJ). </li><li> Para alinhar o sistema de coleta para maximizar sinal coletado, o analisador está definido para 0 ° e uma amostra de tolueno é colocado no plano da amostra. Ao ajustar o x, y, z e controles do monte de fibra, o sinal coletado Raman é otimizado. </li><li> Para garantir a adequada sobreposição espacial e temporal da bomba e feixes de sinal, um espelho é colocado no plano da amostra do microscópio. O filtro nm 404 é removido do sistema. Com o analisador a 90 ° rodada do feixe nm retroreflected 404 é enviado para o espectrógrafo com a intensidade ajustada de tal forma que não satura a câmera. Com o feixe de bomba desligada, o analisador é girado para minimizar o sinal transmitido nm 404. Com o feixe de bomba ligada novamente, o estágio de atraso é ajustado lentamente até que a transmissão da luz nm 404 começa a aumentar. Então, por iterativamente ajustar o estágio de atraso, o espelho piezo-elétricos, e os x, y, z e controles da fibra, um maximiza o sinal. </li><li> Porque a retro-refletida 404 nm e feixe de luz Raman espalhada pode demorar um pouco diferentes caminhos através do sistema, os ajustes finais são feitos colocando uma forte Raman dispersor (como tolueno) no palco da amostra e os ajustes ligeiramente o alinhamento, alterando a estágio de atraso, piezeo-elétrico, espelho e x, y, e z controles da fibra para otimizar o sinal Raman. </li></ol> 5. Coleção de um espectro de tempo-gated única Raman exige a aquisição de espectros de várias para corrigir artefatos do sistema. <ol><li> Com o analisador de set a 0 °, o feixe de excitação sobre a viga e bomba de fora, um espectro &quot;ungated&quot; é tomada, o que representa o espectro de que seria adquirido sem o benefício do sistema de tempo de selecção. </li><li> Com o analisador definido para 90 °, o feixe de excitação e do feixe de bomba de fora ainda, um espectro de fundo é tomada, o que representa a quantidade de luz difusa vazando através do polarizadores e outros elementos no sistema. </li><li> Com o analisador restantes em 90 °e todas as vigas, o espectro de &quot;gate&quot; é tomado, representando a luz Raman espalhada permitido através do polarizadores cruzados pela presença do feixe de bomba. </li><li> Finalmente, com o analisador ainda a 90 °, o feixe de excitação off eo feixe bomba, um espectro de fundo é tomada segundo, representando a contribuição para o espectro de &quot;gate&quot; de quantidades residuais de 808 nm de luz entrando no espectrógrafo. </li><li> Além disso, um espectro é tomado com todos os lasers off, caracterizando a linha de base nível de sinal &quot;dark&quot; da câmera e eletrônica. </li><li> Porque os espectros muitas vezes exigem longos tempos de integração, é imperativo para quebrar este tempo de integração em vários pedaços (frames) para permitir a correção adequada dos raios cósmicos - um problema comum quando a aquisição de dados durante períodos de vários minutos. </li></ol> 6. Uma vez adquirido, várias etapas de processamento são úteis para melhorar a qualidade ea aparência dos dados. <ol><li> Primeiro, todos os espectros são escuros corrigido subtraindo-se fora do espectro &quot;dark&quot;. </li><li> Para corrigir os raios cósmicos, os vários quadros que constituem uma aquisição são comparados uns com os outros em uma base de pixel por pixel. Para qualquer pixel de qualquer quadro que está fora de dois desvios mediana do valor médio para o pixel em todos os frames, valor que pixel é substituído pelo valor mediano em todos os frames. </li><li> Os quadros de raios cósmicos são, então, corrigido e média suavizada por um filtro Savitzky-Golay 1. </li><li> Para extrair o espectro de &quot;verdadeiro&quot; gated, subtraímos a &quot;excitação-only&quot; e &quot;bomba-only&quot; espectros do espectro medido fechado. </li><li> Finalmente, os espectros gated e ungated são, então, fundo corrigido subtraindo-se a 5 ª ordem polinomial, determinada pelo método de Lieber e Mahadevan-Jansen 2. </li></ol> 7. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama esquemático do sistema de propagação Kerr. O caminho do feixe bomba é mostrado em vermelho, enquanto o caminho SHG é mostrado em azul. O caminho onde Raman e de fluorescência são sobrepostas é mostrado em verde, enquanto o caminho onde a fluorescência tem sido temporalmente filtrados é mostrado em amarelo. Abreviaturas da seguinte forma: BPF, banda passante do filtro; CCD, charge-coupled device; DCM, dicróicas espelho; FI, Faraday isolador; λ / 2, placa de meia onda; LPF, longa-pass do filtro; médio, NLM não-linear; P polarizador, ; SHG, cristal geração de segundo harmônico. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 Top:. Raw espectros de cumarina dissolvidos em óleo de imersão. Curva vermelha mostra o espectro tomado com a porta abertas (analisador de conjunto para transmissão máxima). Curva preta mostra o espectro tomado com o analisador alinhados para transmissão mínima e uma bomba de feixe aplicado (o espectro gated). Curva azul mostra a spectum tomadas com o analisador alinhado para a transmissão mínima e nenhuma bomba feixe aplicado (portão mantida fechada). Curva verde mostra o espectro tomado com a bomba só feixe aplicado. Linhas tracejadas indicam magenta região espectral mostrado no painel abaixo. Todos os espectros foram suavizadas com uma ponto 11, de 3 ª ordem Savitzky-Golay filtro. Inferior: Spectra de cumarina dissolvido em óleo de imersão após fluorescência de fundo subtração. Curva vermelha é o espectro com a porta abertas, ea curva azul é o espectro fechado. O espectro gated mostra claramente a característica de pico de alta complicado número de ondas de óleos.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O campo da espectroscopia Raman biomédica tem visto um crescente interesse nos últimos anos diversas como resultado de seu potencial demonstrado para a resolução de vários desafios difíceis no diagnóstico biológico. Por exemplo, espectros Raman tem sido demonstrado que têm valor de diagnóstico do câncer de detecção de 3, 4, 5, 6. A espectroscopia Raman também tem sido utilizado na quantificação bacteriana 7, 8 e resposta à droga bacteriana 9. Ele também encontrou aplica...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Lentes </td><td> ThorLabs </td><td> Vários </td><td> Todas as lentes revestidas a ter perdas de transmissão máxima de 1% cada </td></tr><tr><td> Sintonizável Ti: Sapph a laser </td><td> Coerente </td><td> Camaleão </td><td> 30 nJ, 200 fs, 80 MHz </td></tr><tr><td> Objetiva de imersão 40X de petróleo </td><td> Olimpo </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1,35 </td></tr><tr><td> Microscópio invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX-71 </td><td> Modificado para remover todas as lentes na porta lateral </td></tr><tr><td> Metade placa de onda </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> Glan-Thompson polarizador </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ Perda de transmissão de 10% </td></tr><tr><td> Espectrômetro </td><td> PI Acton </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI Acton </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Software mathmatical </td><td> The MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> versão 2008a </td></tr><tr><td> Faraday isolador </td><td> EOT </td><td> BB8-5I </td><td></td></tr><tr><td> Piezo-elétrico espelho </td><td> Newport </td><td> AG-M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO cristal </td><td> CASIX </td><td> personalizado </td><td> 1 mm de espessura </td></tr><tr><td> Bandpass filtro 1 </td><td> Andover </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0,4 nm </td></tr><tr><td> Dichroic espelho </td><td> Semrock </td><td> FF662-FDI01 </td><td> limite da faixa de 662 nm </td></tr><tr><td> Filtro passa-tempo </td><td> Semrock </td><td> BLP01-405R </td><td> limite da faixa de 417 nm </td></tr><tr><td> Bandpass filtro 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 nm </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 335266 </td><td> Pureza de 99% </td></tr><tr><td> Cumarina 30 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 546127 </td><td> Pureza de 99% </td></tr><tr><td> Óleo de imersão </td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td> Tipo de DF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

A espectroscopia Raman é frequentemente assolada por um fundo fluorescente muito forte, particularmente para amostras biológicas. Se uma amostra é animado com um trem de pulsos ultra-rápidos, um sistema que pode temporalmente separadas espectralmente sobrepostas sinais em uma escala de tempo de picosegundos pode isolar rapidamente chegar luz dispersa Raman de tarde-de chegar a luz de fluorescência. Aqui nós discutimos a construção e operação de um sistema não-linear complexa óptico que utiliza todos os óptica de comutação em forma de um baixo consumo de energia óptico Kerr portão para isolar sinais Raman e de fluorescência. Um único laser de 808 nm com 2,4 W de potência média e taxa de repetição 80 MHz é dividida, com aproximadamente 200 mW de 808 nm de luz que está sendo convertido para &lt;5 mW de 404 nm de luz enviado para a amostra para excitar espalhamento Raman. Os restantes luz nm unconverted 808 é então enviada para um meio não-linear, onde ele atua como a bomba para o obturador totalmente óptica. O obturador abre e fecha em 800 fs com um pico de eficiência de aproximadamente 5%. Usando este sistema, somos capazes de separar com sucesso sinais Raman e fluorescência em uma taxa de repetição de 80 MHz a partir de energias de pulso e poderes média que permanecem biologicamente seguro. Porque o sistema não tem capacidade ociosa em termos de potência óptica, detalhamos várias considerações de design e de alinhamento que ajuda a maximizar o rendimento do sistema. Discutimos, também, o nosso protocolo para a obtenção da sobreposição espacial e temporal do sinal e vigas bomba dentro do meio Kerr, bem como um protocolo detalhado para aquisição espectral. Por fim, relatamos um representante alguns resultados de espectros Raman obtidos na presença de fluorescência forte usando o nosso sistema de tempo de selecção.

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Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Discutimos a construção e operação de um sistema não-linear complexa óptico que utiliza comutação totalmente óptica ultra-rápida para isolar Raman a partir de sinais de fluorescência. Usando este sistema, somos capazes de separar com sucesso sinais Raman e fluorescência utilizando energias de pulso e poderes média que permanecem biologicamente seguro.

Rejeição de fundo de fluorescência em Ressonância e microspectroscopy Raman espontâneo

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

rejection-fluorescence-background-resonance-spontaneous-raman

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K visualizações.  University of California, Davis. Discutimos a construção e operação de um sistema não-linear complexa óptico que utiliza comutação totalmente óptica ultra-rápida para isolar Raman a partir de sinais de fluorescência. Usando este sistema, somos capazes de separar com sucesso sinais Raman e fluorescência utilizando energias de pulso e poderes média que permanecem biologicamente seguro.

Vídeo: Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imagem Lifetime fluorescência de rotores moleculares em células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Bioengenharia

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para capturar imagens 4-Dimensional dos efeitos de modulação de tensão de cisalhamento sobre o coração em desenvolvimento de Zebrafish

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...