Há muitas pessoas que contribuíram para este trabalho e são mais da membrana Caffrey Estrutural e Funcional Grupo Biologia, ambos membros passados ​​e presentes. Para todos, e especialmente para Jingquan Tan e Lyon José, nós estendemos nossos mais sinceros agradecimentos e apreciação. Este trabalho foi financiado em parte por doações da Fundação Ciência da Irlanda (07/IN.1/B1836), os Institutos Nacionais de Saúde (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e do 7 COST e Acções Marie Curie (CM0902 e PIEF-GA-2009 -235612).

1. Laboratório de Set-up pré-colheita <ol><li> Em preparação para a colheita, preencher a espuma seca Dewar com nitrogênio líquido e colocá-lo ao lado do microscópio, onde a colheita está a ter lugar. </li><li> Submergir o disco de memória, abra acabam, no nitrogênio líquido dentro do Dewar espuma e deixe-o esfriar completamente. </li><li> Assegurar uma micro-montagem de um tamanho que corresponde ao cristal a ser colhido numa varinha magnética (Figura 5). É importante ter à mão um número de reposição varas magnéticas pré-carregado com micro-montagens para atender a situações em que é necessária a colheita de cristais a partir das várias um bolus. Spare varinhas devem estar disponíveis em todos os momentos. </li><li> Coloque uma micropipeta, pontas e a solução precipitante que foi utilizado para o crescimento de cristais ao lado do microscópio colheita. Pode ser necessário para cobrir a mesofase e para evitar a secagem quando o poço é aberto. </li><li> Tenha um caderno e uma caneta no banco por perto e / ouo computador abrir. Estes serão utilizados para gravar observações sobre a qualidade, a aparência, a localização, número de puck armazenamento, etc, dos cristais à medida que são colhidas, crio-arrefecida e colocada em armazém. </li><li> Se um assistente está disponível para ajudar com a colheita que pessoa deve entender claramente que o protocolo seja seguido, a ordem em que os vários passos será realizada, e o seu papel no processo global. </li></ol> Com todos os materiais e equipamentos em local a nossa próxima tarefa é: 2. Identificar Pratos e poços que contêm cristais <ol><li> O método mais simples e direta para encontrar cristais cultiváveis ​​é inspecionar poços à mão usando um microscópio com normal e com luz polarizada cruzada. Ajustar a intensidade da luz que ilumina o microscópio pode ajudar a localizar cristais. </li><li> Alternativamente, um gerador de imagens, onde as placas são rastreadas automaticamente com normal e cruzado polarized luz, pode ser usado para procurar cristais. </li><li> Avaliar por olho gravado imagens digitais em um monitor de computador. </li><li> Marcar claramente os poços com cristais para colheita e registro de comentários sobre o tamanho, qualidade e localização dos cristais na mesofase no notebook ou em um computador. </li><li> Remova a placa contendo cristais para a colheita a partir do sensor de imagem. </li></ol> 3. Abrindo um poço com mesofase cúbico. Método 1 As placas em que os cristais cresçam pelo método de meso são placas de vidro em sanduíche (figura 2). A fim de aceder a mesofase e os cristais, são preferíveis, é necessário abrir o poço. Isto é feito por meio de uma ferramenta de corte para cortar o vidro lamela superior que veda o bem que pode, então, ser removido. Existem várias abordagens para o corte e remoção da lamela em mais de uma cristalização bem. O que deve ser usado é ditada pelo tipo of mesofase na qual o cristal se encontra em crescimento. Esta pode ser a fase muito viscosa e pegajosa cúbico (Figura 3A) ou a sua variante mais fluidos, a fase esponja (Figura 3B). Neste artigo de vídeo que mostram como abrir poços e na colheita de cristais de ambos os materiais de hospedagem. <ol><li> Coloque a placa de vidro cristalização sanduíche no palco de um microscópio de luz. </li><li> Utilizando uma ferramenta de corte de vidro score a lamela levemente com dois círculos concêntricos situados acima do espaçador e do lado de fora do perímetro da cavidade. Com uma ferramenta de corte novo, requer pressão aplicada pontuação mínima. Substituir a ferramenta com um novo quando a pressão necessária para contagem aumenta ainda fraccionada, o que normalmente ocorre após a abertura de 10 poços. </li><li> Quebra-se o vidro no espaço entre os dois círculos marcados com o propósito de libertar o lamela interior. Isso gera muitos cacos de vidro e pó. Limpá-las com uma umedecidotoalha de papel. </li><li> Retire a lamínula libertou segurando-o com uma pinça de ponta fina e inclinando-o longe de dentro e fora do poço. Neste caso, a fase cúbica permanece preso no lugar e na placa de base do poço. </li><li> Aumentar o zoom para obter uma visão mais clara da mesofase cúbico que agora está pronto para ser utilizado na colheita de cristal. </li></ol> 4. Abrindo um Bem com mesofase cúbico. Método 2 <ol><li> Utilizando a ferramenta de corte de vidro pontuação linhas rectas paralelas na lamela a um lado do poço, e que se estendem por todo o poço em si. Isto permite um acesso mais fácil a pinça e retirada da lamela. </li></ol> Nesta demonstração particular, a lamela rachaduras na libertação da lamela da superfície pegajosa espaçador. No processo, a lamela muda de posição e o precipitante separa da fase cúbica. Quando a lamela é levantado algum do precipitante a acompanha. Ficamos com um b expostosolus de mesofase sem qualquer precipitante circundante. Imediatamente, adicionar um precipitante ul fresco no topo do bolo utilizando uma micropipeta para impedir a mesofase de secar e passando por uma mudança de fase que podem danificar os cristais. O bólus está agora pronto para ser usado na colheita de cristais. 5. Abrindo um Bem com a Fase Esponja. Sem sucesso A fase esponja é menos tolerante a trabalhar com devido à sua capacidade de fluir. Se que os resultados de fluxo na fase esponja contactando o perímetro da capilaridade assim vai chamar a mesofase e os cristais serão perdidos. Um exemplo de que isso aconteça é mostrada neste vídeo. <ol><li> Zoom sobre a fase de esponja e alternar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais na fase de esponja. </li><li> Em preparação para a abertura do escore bem e cortar a lamela, como descrito na Seção 3. No processo, a lamela rachaduras. Na tentativação para abrir a bem os deslocamentos precipitantes na direcção da fenda e, eventualmente, que entra em contacto com o separador. Com o precipitante de alguma da fase esponja e da sua carga de cristais que se perderam. </li></ol> Nesta sequência particular, os polarizadores no microscópio não são completamente cruzados e os cristais podem ser vistos como objectos brilhantes ao mesmo tempo que o poço e os seus conteúdos permanecem visíveis. 6. Abrindo um Bem com a Fase Esponja. Com sucesso <ol><li> Zoom sobre a fase de esponja e identificar um cristal, tanto em normal e cruzado luz polarizada. </li><li> Pontuação, cortar e remover uma seção de lamínula cobrindo o bem, como na Seção 4.1. Incompleta cruzou a luz polarizada é usada para manter o controle do cristal. </li><li> Introduzir uma folha de papel de seda seca, através da abertura na lamela e para dentro do poço até ela tocar a solução precipitante. Pavio fora a solução cuidadosoly até que seja quase todos embora e depois remover o tecido. Isso faz com que o precipitado restante e fase esponja, com o cristal ainda no lugar, para retrair sob a lamela. </li><li> Pontuação, cortar e remover com uma pinça o resto da lamela, como na Seção 4.1. Neste caso, a fase esponja divide; alguns permanece no poço e algumas varas para a lamela. O cristal é em bolus na lamela. Pois há muito pouca presente precipitante, a fase esponja começa a sofrer uma transição de fase provavelmente devido a secagem. Isto pode ser visto como um anel de birrefringência que migra em direcção ao centro do bolo. Imediatamente adicionar precipitante para o bolus para deter a transição. O bolo já está pronto para uso em colheita de cristal. </li></ol> 7. Colheita e Cryo-arrefecimento cristais a partir da fase cúbica <ol><li> Ir e voltar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais nas bolus fase cúbicos no bem aberto. Em ta sua sequência de vídeo até quatro cristais birrefringentes pode ser visto nos bolus fase cúbica com luz polarizada cruzada. </li><li> Use uma. Montado crio-loop (Figura 5) para sondar a mesofase recém exposta para cristais, para pescar cristais e, em seguida, ao mergulhá-los, contido no crio-loop, em azoto líquido no vaso Dewar imediatamente após a colheita Idealmente, a colheita ea pressão refrigeração deve acontecer em um movimento contínuo e rápido. Como mesofase pouco aderente quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Em nossa experiência, crio-protetor não é necessária com no meso-crescidos cristais. </li><li> Uma vez que não é possível olhar para o cristal no crio-loop imediatamente após a colheita, inspeccionar o bolus mesofase usado para colher a fim de verificar que o cristal já não existe sugerindo que foi colhida com sucesso. </li></ol> 8. Colheita e Cryo-arrefecimento Cristais da Fase Sponge <ol><li> Ir e voltar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais no bolo fase esponja no poço aberto. Nesta sequência de vídeo muitos cristais birrefringentes pode ser visto no bolus sob luz polarizada cruzada. </li><li> Use uma. Montado crio-loop (Figura 5) para pescar cristais a partir da fase de esponja e mergulhá-los, contido dentro ou sobre a cryoloop, em azoto líquido no vaso Dewar imediatamente após a colheita Tal como acontece com a colheita da fase cúbica, idealmente, o processo de crio-resfriamento deve acontecer imediatamente o cristal é colhida com tão pouco tempo quanto possível decorrido entre o evento de colheita real e mergulhar em nitrogênio líquido. Como fase esponja pouco aderente quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Como se observa, crio-protetor não é necessária com no meso-crescidos cristais. </li></ol> 9. Armazenar em Cristais Dewars <ol><li> Depois mergulhou o circuito montado em ni líquidoTrogen colocá-lo em uma das ranhuras de fixação do disco de armazenamento no Dewar espuma. Todas as manipulações são realizadas com o circuito, a parte superior da varinha magnética e o disco imerso em azoto líquido. </li><li> Registrar o local e detalhes da colheita e crio-refrigerado cristal no notebook e / ou no computador. </li><li> Quando o disco no Dewar cheio de espuma ou de captura para o dia é completada a transferência do disco para dentro de um suporte de disco de um dispositivo de armazenamento em prateleira ou um Dewar transporte cheio com azoto líquido. Os cristais podem ser enviados em Dewars de transporte para a instalação síncrotron para a coleta de dados de difração. </li></ol> 10. Resultados representativos Os objetivos dos exercícios de colheita e crio-refrigeração demonstrado aqui são para transferir um cristal da mesofase hospedagem em crio-loops, para vitrificar o cristal em loop e colocá-lo no armazenamento em nitrogênio líquido em um Dewar. A situação ideal é quando a colheita e cryo-arrefecimento é feito de tal modo que a qualidade de difracção do cristal é preservada durante o processo. Como mesofase pouco quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Isto é para tornar a localização do cristal e centrando-o no feixe de raios-X que muito menos exigente, para acelerar o arrefecimento da crio-com vista à vitrificação, e para minimizar a interferência de fundo de dispersão a partir da mesofase durante a recolha de dados de difracção. Alguns exemplos de crio-arrefecidos amostras onde o cristal podem e não podem ser vistas são mostrados na Figura 6. Sempre que o cristal não pode ser visto a olho nu, é geralmente necessário recorrer a rastering difracção, a fim de encontrar o cristal e para centrá-la no feixe de recolha de dados 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representação esquemática de uma membrana biológica que mostra a bicamada lipídica e em que are situado a uma variedade de proteínas. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Uma totalmente carregado e selado de 96 poços da placa de vidro de cristalização sanduíche. Cada poço contém 50 nl fase cúbica e uma solução precipitante ul. Para maior clareza, a fase cúbica foi corado com Sudan Red e a solução precipitante compreende azul de metileno. A partir de Referência 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cristais de proteínas de membrana que crescem na mesofase lipídica. A. A fase cúbica com um cristal de bacteriorodopsina de H. halobium. B. fase A esponja contendo um cristal do receptor de vitamina B12 BtuB / transportador, a partir de E. coli. Da referência 25. As fases cúbicas e esponja têm contrastantes appeaRances como é óbvio, comparando os painéis A e B. A fase cúbica em que A é extremamente viscosa e retém a sua forma original. Ele não flui. Isto é particularmente evidente nas bordas dos bolus mesofase que têm uma aparência rugosa. Por contrato, a fase de esponja é consideravelmente menos viscoso e flui. Assim, a fase esponja não reter a sua forma original e as suas bordas são caracteristicamente lisa. Precipitantes que incluem Jeffamine, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentandiol, pentaeritritol propoxilato, butanodiol e hexanodiol, pode resultar em uma transição da fase cúbica para a esponja de 4,26. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. O fluxograma resume os passos envolvidos na produção de colheita, e crio-de arrefecimento em meso-crescidos cristais de proteína de membrana (A). Apenas os passos cercados pelo vermelho tracejadolinha, e descritos em detalhe em (B), são cobertos neste artigo JoVE. Um painel é de Referência 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Um vazio crio-loop montado em um pino que é realizada no local em uma varinha magnética. Vistas expandidas do pino (A) e micro-montagem (B) desta ferramenta importante para a colheita e crio-arrefecimento são mostrados. O loop vazio no final da micro-montagem em B é de 30 um de diâmetro. Apesar de não ter testado outros tipos de loop extensivamente, nós achamos que o MiTeGen laços trabalho mostrado bem com ambas as fases cúbicas e esponja. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Colhido e crio-arrefecido cristais de proteínas de membrana em crio-loop quando vistos com um microscópio in-line em uma linha de luz síncrotron. A, B. Exemplos de cristais colhidas (Caa3 citocromo oxidase 34 (A), quinase de diacilglicerol, DgkA (B)) em que os cristais (seta azul), são visíveis através da mesofase crio-arrefecido num C. Exemplo crio-loop. de onde o cristal colhido não é visível na mesofase crio-arrefecido num crio-loop. A ponta do laço é identificado com uma seta vermelha. A adesão mesofase crio-refrigerado é identificado com uma seta azul.

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A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo de vídeo, demonstramos como cristais crescidos numa mesofase lipídica são colhidas e crio-arrefecido em preparação para utilização na recolha de dados de difracção e, finalmente, para a determinação da estrutura. A mesofase hospedagem pode ser a fase viscosa e pegajosa cúbico ou a fase esponja mais fluido 4. Como as placas de sanduíche de vidro são abertas e como os cristais são colhidas depende muito do tipo de mesofase. É importante, portanto, saber qual dos dois é um lidar com antecedência. A identidade do lípido e do precipitante de hospedagem utilizado são importantes, a este respeito, e a aparência física dos bolus mesofase na cristalização bem podem ser usados ​​para distingui-los (Figura 3). A colheita de ambos os tipos de mesofase foi ilustrado neste artigo. Colheita de pequenos cristais de uma mesofase lipídico em placas de sanduíche de vidro é um processo trabalhoso que requer tempo, habilidade exper,IENCE paciência, e uma mão firme. É importante reservar uma quantidade de tempo adequado para a colheita e para configurar o laboratório para que todos os suprimentos e equipamentos estão à mão com antecedência. Uma segunda pessoa para facilitar a colheita não é essencial, mas é recomendado. Essa pessoa pode ajudar com o fornecimento de placas pré-marcadas para o indivíduo fazer a colheita, bem como a colocação de crio-refrigerados laços montados com cristais colhidas para o disco de armazenamento. O assistente também pode desempenhar um papel importante apoio na documentação de observações sobre os cristais feitos durante a colheita, que pode revelar-se crucial durante a coleta de dados de difração. Na ausência de um assistente, um dispositivo ativado por voz de gravação de áudio pode ser usado com vantagem para a documentação. Seguindo o protocolo descrito neste artigo irá ajudar a obter o Visualizador instalado e funcionando com a colheita de cristal. No entanto, é importante ter em conta que o processo não é linear e que practice é necessária antes de se lançar na colheita de cristais de proteínas de membrana valiosos. Recomenda-se, portanto, que as placas de teste com cristais de proteínas que não são particularmente valiosas ser experimentado em primeiro lugar. Isto irá fornecer a neophyte com experiência valiosa no corte de vidro, a remoção de fragmentos de vidro, erguendo-se a lamela de cima da mesofase, utilizando a funcionalidade de polarização no microscópio para observar cristais e localizá-los durante a colheita, e, finalmente, tratamento dos diferentes tipos de mesofases e colher a partir deles. A textura da mesofase, e, por extensão, a facilidade com que os cristais podem ser colhidos, que muda com o tempo, durante a cristalização. É importante, por conseguinte, para a prática de colheita de cristais de menor valor, mas com as que cresceram sob as mesmas condições como as mais importantes. É possível crescer cristais de lisozima e taumatina pelo meso ou no método de fase lipídica cúbica 28 e estes devem ser consideradosrado pelo modo de obter a familiaridade com os materiais e os métodos. Deve-se considerar também a trabalhar com a proteína livre de mesofase primeiro a saber de seus caprichos. Os procedimentos demonstrados aqui foram todas feitas em um confortável 20 ° C ou menos. É possível cultivar os cristais pelo método de meso a temperaturas mais baixas. Assim, como a mono-oleína lipídico hospedagem em um estado metaestável de fase podem ser utilizados, a 4 ° C 1,2,29,30. Uma alternativa é usar a racionalmente concebidos 7,9 MAG para a cristalização a baixa temperatura 31. Fazemos crysallogenesis baixa temperatura rotineiramente com metas determinadas proteínas de membrana. Neste caso, o crescimento dos cristais e a colheita é feita de uma cabina de refrigerador C 4 °. Trabalhando sob tais condições tem seus próprios desafios não menos do que é a necessidade de roupas quentes e confortáveis. O passo seguinte no processo global de determinação da estrutura cristalina através macromolecularestallography é coletar dados de difração em cristais colhidos e snap-resfriado, como demonstrado neste artigo. No meso-grown cristais são geralmente pequenas. No entanto, a recolha de dados úteis de difracção tem sido possível com os cristais possuindo uma dimensão máxima de 20 um 9. Para este efeito, micro-feixe síncrotron radiação X é usado e é o foco de um artigo separado JoVE nesta série 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Componentes </td></tr><tr><td> Pinças curvas </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Ponteiras descartáveis </td><td> Gilson </td><td> Vário </td><td> Descartável </td></tr><tr><td> Espuma dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Resíduos recipientes de vidro e metal </td><td> Daniels Saúde </td><td> DD479OL </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Ciclos de colheita </td><td> MiTeGen </td><td> Vário </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Colheita microscópio </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Caderno de anotações </td><td> Vário </td><td> NA </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Repulsão magnéticabotão varinha de carregamento de amostra </td><td> Hampton Research / dimensões moleculares </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Puck Original (para uso com ALS-estilo apenas robôs) </td><td> Posicionamento Sistemas de cristal </td><td> CP-111-035 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Dispositivos de pipetagem </td><td> Gilson </td><td> Vário </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Soluções precipitantes </td><td> Vário </td><td> Vário </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Posicionamento Sistemas de cristal </td><td> CP-111-030 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Puck Cane envio Guardadas (originais ALS-style) com cabo em forma de gancho e haste de travamento </td><td> Posicionamento Sistemas de cristal </td><td> CP-111-029 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Água purificada </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Óculos de segurança </td><td&gt; Vários </td><td> NA </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Bases Pin amostra - magnética (cobre ou não) </td><td> Posicionamento Sistemas de cristal </td><td> CP-111-015 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Envio dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Tecidos </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Descartável </td></tr><tr><td> Carboneto de tungstênio cortador de vidro (Scriber TCT) </td><td> Ferramentas Silverline (Yeovil, no Reino Unido) </td><td> 633657 </td><td> Ferramenta </td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

Uma via importante para a compreensão de como proteínas funcionar a um nível mecanístico é ter a estrutura da proteína alvo disponível, idealmente em resolução atómica. Presentemente, há apenas uma maneira para captar informação, tais como aplicado a proteínas integrais de membrana (Figura 1), e os complexos se formam, e esse método é a cristalografia de raios-X macromolecular (MX). Para fazer cristais de qualidade MX difracção que são necessários, no caso de proteínas de membrana, não se formam prontamente. Um método para cristalizar proteínas da membrana que envolve o uso de mesofases lipídicos, especificamente as fases cúbicos e esponja 1-5, ganhou atenção considerável devido tarde para o sucesso que teve no campo receptor acoplado à proteína G 6-21 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). No entanto, o método, doravante referida como a em meso ou método fase lipídica cúbico, vem com sua própria técnicadesafios. Estas surgem, em parte, devido à natureza geralmente viscoso e pegajoso da mesofase lipídico no qual os cristais, os quais são muitas vezes micro-cristais, crescer. Manipulando cristais torna-se difícil, como resultado e, particularmente, durante a colheita, 22,23. Os problemas surgem também no passo que precede a colher que requer que as placas de vidro em sanduíche no qual os cristais crescem (Figura 2) 24,25 são abertos para expor o bolus de mesofase, e os cristais na mesma, para a colheita, crio-arrefecimento e X eventuais -ray de coleta de dados de difração. As variantes de mesofase cúbicos e esponja (Figura 3) a partir da qual devem ser colhidas cristais têm reologias 4,26 profundamente diferentes. A fase cúbica é viscosa e pegajosa semelhante a uma pasta de dentes de espessura. Por outro lado, a fase de esponja é mais fluida com uma clara tendência para fluir. Por conseguinte, as diferentes abordagens para a abertura de poços de cristalização containicristais ng crescem na fase cúbica e esponja são chamados como, aliás, para diferentes métodos são necessários para a colheita de cristais a partir dos dois tipos de mesofase. Protocolos para fazer apenas que foram refinados e aplicados no Membrane Biology estrutural e funcional (MS &amp; FB) de grupo, e são descritos em detalhe neste artigo JoVE (Figura 4). São dados exemplos de situações em que os cristais são colhidos com sucesso e crio-arrefecido. Nós também dar exemplos de casos onde os problemas surgem que levam à perda irreparável de cristais e descrever como esses problemas podem ser evitados. Neste artigo o Viewer é fornecido com o passo-a-passo para a abertura de poços de vidro de cristalização de sanduíche, para a colheita e para crio-refrigeração cristais de proteínas da membrana que crescem em cúbico e em fases de esponja.

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Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Aqui é descrito procedimentos implementados na membrana Caffrey Estrutural e Grupo Biologia Funcional para colheita e crio-cool cristais de proteína de membrana lipídica cultivadas em fases cúbicas e esponja de uso na determinação estrutura usando cristalografia de macromoléculas de raios-X.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K visualizações.  Trinity College Dublin. Aqui é descrito procedimentos implementados na membrana Caffrey Estrutural e Grupo Biologia Funcional para colheita e crio-cool cristais de proteína de membrana lipídica cultivadas em fases cúbicas e esponja de uso na determinação estrutura usando cristalografia de macromoléculas de raios-X.

Vídeo: Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biologia

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.