Experimentos de cristalografia seriada podem ser desafiadores. Um obstáculo fundamental em sua prática é a criação de amostras microcristalinas. Este protocolo mostra como essas amostras podem ser criadas de forma confiável.
Este método usa endotiapepsina para fornecer uma estrutura para otimizar grandes cristais crescidos em placas de difusão de vapor de pequeno volume em lamas microcristalinas de grande volume. Não podemos afirmar que este protocolo será universalmente bem sucedido. No entanto, esperamos que as ideias e métodos aqui propostos forneçam a outros uma estrutura experimental para empregar em outras proteínas.
Para começar, prepare uma placa de 96 poços de duas gotas com o tampão de cristalização usando o robô Formulatrix. Usando uma mistura de robô de manuseio de líquidos, misture 150 nanolitros de endotiapepsina recém-descongelada com 150 nanolitros do tampão de cristalização em cada poço. Sele a placa e deixe os cristais crescerem por 24 horas dentro do Hotel Formulatrix.
Após 24 horas, quebre e remova os cristais de cinco poços da placa de cristalização de 96 poços. Coloque-os em 250 microlitros do tampão de cristalização em um tubo centrífugo de 1,5 mililitro colocado em um balde de gelo. Adicione 10 a 15 contas de vidro de um milímetro de tamanho no tubo da centrífuga.
Vórtice os cristais e contas a 1000 RPM por 30 segundos e substitua-os no gelo por 30 segundos. As sementes podem então ser usadas imediatamente ou armazenadas a menos 20 graus Celsius. Para realizar um experimento de morfograma, adicione cinco a 40% de concentrações de PEG 6000 com um molar Tris-HCl em pH sete e cloreto de magnésio 0,15 molar ao longo das colunas de placa de uma tela de grade de 96 poços de duas gotas Reparar uma diluição sequencial de endotiapepsina em acetato de sódio 0,1 molar de 100 a 12,5 miligramas por mililitro em oito etapas.
Em seguida, pipetar oito microlitros de cada diluição seguidos de dois microlitros de estoque de sementes para a placa do robô de manuseio de líquidos. Usando um robô de manipulação de líquidos, dispense 150 nanolitros de cada diluição de endotiapepsina nos subpoços um e dois da tela. Multi-aspirar 50 nanolitros de estoque de sementes descongeladas e 100 nanolitros da solução do poço do sub-poço dois e dispensar ambos na solução proteica.
Misturar soluções três vezes após a adição do tampão de cristalização ou tampão de cristalização e mistura de sementes. Agora sele a placa e a imagem em zero, três, seis, 12, 18 e 24 horas do primeiro dia todos os dias durante a primeira semana e todas as semanas nas próximas quatro semanas a 20 graus Celsius. Após 24 horas, observe a placa ao microscópio, estime o número de cristais dentro de cada poço e meça uma amostra dos cristais.
Registre essas estimativas na planilha do gerador de morfograma fornecida. Introduzir as concentrações iniciais de endotiapepsina e PEG 6000 nas caixas apropriadas. A planilha plotará automaticamente os resultados no formato de diagrama de fase tradicional com as concentrações de precipitante e proteína nos eixos X e Y, respectivamente.
Condições de poços que só dão origem a cristais em suas gotas semeadas indicam a região MetaEstável do diagrama, enquanto condições com cristais nas gotas semeadas e não semeadas indicam a zona de nucleação. A partir da análise do morfograma, selecione a condição mais promissora para escalonamento em placas de 24 poços. Em seguida, comece com 100 miligramas por mililitro de endotiapepsina e 35% PEG 6000.
Preparar cinco mililitros de tampão de cristalização com PEG 6000 a 35%, Tris-HCl 0,1 molar com pH sete e cloreto de magnésio 0,15 molar. Agora coloque 0,5 mililitros do tampão de cristalização em três poços de uma placa de gota suspensa de 24 poços untada. Misturar 15 microlitros de endotiapepsina com 15 microlitros de solução de cristalização sobre uma lamínula de tampa de vidro.
Coloque a solução sobre os poços e deixe a placa por 24 horas. Após 24 horas, olhe para a placa sob um microscópio, estime o número de cristais na gota e meça seu tamanho. Se os cristais estiverem incorretos, repita esta etapa, mas altere a concentração de proteína ou adicione sementes se a nucleação do cristal não for alta o suficiente.
Repita o experimento de escalonamento de 24 poços adicionando sementes em uma concentração maior de PEG 6000. Coloque 0,5 mililitros do novo tampão de cristalização em três poços de uma placa suspensa de 24 poços untada. Colocar 15 microlitros de endotiapepsina sobre uma tampa de vidro e misturar cinco microlitros de caldo de sementes e 10 microlitros de solução de cristalização com a solução de endotiapsina.
Inverta as escorregas de tampa, coloque-as sobre os poços e deixe por 24 horas. Verifique novamente as gotas para ver se os cristais são menores e têm uma concentração maior. Estime o número de cristais na gota e meça seu tamanho novamente para ver se eles agora estão no tamanho correto.
Para realizar um protocolo de batelada, prepare o tampão de cristalização de 40% PEG 6000, Tris-HCl 0,1 molar com pH sete e cloreto de magnésio 0,15 molar. Pré-misture 50 microlitros de caldo de sementes e 100 microlitros de solução de cristalização e misture com solução proteica no tubo centrífugo de 1,5 mililitro. Vórtice o tubo por 10 segundos e coloque-o em um balancim ou agitador a 20 graus Celsius.
Tome uma alíquota de 2,5 microlitros da solução em lote a cada 20 minutos. Monitorar o tamanho e o número dos cristais usando um hemocitômetro. Conte o número de cristais e meça seu tamanho ao microscópio.
Quando os cristais atingirem cerca de 15 mícrons de dimensão, extinguir a reação com 150 microlitros de acetato de sódio 0,5 molar suplementado com Tris-HCl 0,5 molar, cloreto de magnésio molar 0,075 e PEG 6000 20%. Verifique novamente o tamanho e a concentração de cristais usando o hemocitômetro. Guarde os cristais a 20 graus Celsius.
A análise do morfograma da endotiapepsina sugeriu que a nucleação foi influenciada tanto pelas concentrações de proteínas quanto pelas concentrações precipitantes. As regiões MetaStable, nucleação e precipitação do diagrama podem ser bem distinguidas. A adição de sementes aumentou significativamente o número de cristais em relação às gotas sem sementes.
A análise da microcristalização da endotiapepsina em volumes de 200 a 300 microlitros revelou as mudanças na nucleação dos cristais e a maior dimensão ao longo do tempo. O aumento da concentração de PEG para 35% melhorou significativamente a cristalização, com uma concentração final de cristal de cerca de 3,6 vezes 10 a seis por mililitro, e a maior dimensão cristalina de 42 micrômetros. Para reduzir o tamanho dos cristais finais, uma abordagem de redução da concentração de proteínas foi aplicada, o que infelizmente reduziu a concentração de cristais significativamente, e finalmente produziu cristais ainda maiores.
No entanto, a abordagem de aumentar a concentração de PEG para 40% produziu cristais em torno de 3,1 vezes 10 a seis por mililitro e um tamanho de aproximadamente 39 micrômetros. Além disso, a adição de sementes levou a um aumento significativo na concentração de cristais, em torno de 1,1 vezes 10 a oito por mililitro e dimensões menores, de aproximadamente 4,2 micrômetros. O efeito de têmpera tentado na reação de cristalização deu uma concentração final de cristal de cerca de 2,6 vezes 10 a seis por mililitro e um tamanho de aproximadamente 15 micrômetros.
A metade CC plotada contra a resolução dos dados de raios X mostrou uma ligeira diminuição na resolução do cristal dos volumes de 10 microlitros para 200 a 300 microlitros. No entanto, o cristal ainda difratou para 1,5 angstrum, o que foi considerado suficiente. A endotiapepsina é uma proteína perdoadora para trabalhar.
Esperamos que a tentativa deste protocolo de endotiapepsina gere ideias e métodos úteis para outras proteínas. Particularmente com a cristalografia, é benéfico ver como as coisas parecem e se sentem em vez de tentar apenas seguir um protocolo escrito. Esperamos que este vídeo lhe dê um pouco dessa sensação.
