Somos gratos a Takaji Wakita e Bukh Jens para JFH1 e isolados J6CF, respectivamente. Além disso, agradecemos Charles Rice para Hein-7.5 células e do anticorpo 9E10, Steven Foung para o anticorpo específico CBH-E2-23, e todos os membros do Departamento de Virologia Experimental, Twincore para sugestões e discussões.

<ol>
	<li>Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+hepatitis+C+virus+subgenomes+in+nonhepatic+epithelial+and+mouse+hepatoma+cells.">Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells.</a> J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).</li><li>Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonhepatic+cell+lines+HeLa+and+293+support+efficient+replication+of+the+hepatitis+C+virus+genotype+2a+subgenomic+replicon.">Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon.</a> J. Virol. 79, 592-596 (2005).</li><li>Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+subgenomic+replicons+in+the+human+embryonic+kidney+293+cell+line.">Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line.</a> J. Virol. 78, 491-501 (2004).</li><li>Date, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+2a+hepatitis+C+virus+subgenomic+replicon+can+replicate+in+HepG2+and+IMY-N9+cells.">Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).</li><li>Chang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+hepatitis+C+virus+(HCV)+RNA+in+mouse+embryonic+fibroblasts:+protein+kinase+R+(PKR)-dependent+and+PKR-independent+mechanisms+for+controlling+HCV+RNA+replication+and+mediating+interferon+activities.">Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities.</a> J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).</li><li>Zhong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro.">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).</li><li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture.">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309, 623-626 (2005).</li><li>Wakita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome.">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat. Med. 11, 791-796 (2005).</li><li>Witteveldt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD81+is+dispensable+for+hepatitis+C+virus+cell-to-cell+transmission+in+hepatoma+cells.">CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells.</a> J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).</li><li>Bitzegeio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+hepatitis+C+virus+to+mouse+CD81+permits+infection+of+mouse+cells+in+the+absence+of+human+entry+factors.">Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors.</a> PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).</li><li>Lindemann, D., Goepfert, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+foamy+virus+envelope+glycoproteins.">The foamy virus envelope glycoproteins.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).</li><li>Brohm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+determinants+important+for+hepatitis+C+virus+p7+function+in+morphogenesis+by+using+trans-complementation.">Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation.</a> J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).</li><li>Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+trans-encapsidation+of+hepatitis+C+virus+RNAs+into+infectious+virus-like+particles.">Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.</a> J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).</li><li>Koutsoudakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+steps+of+hepatitis+C+virus+infection+by+using+luciferase+reporter+viruses.">Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses.</a> J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).</li><li>Frentzen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completion+of+hepatitis+C+virus+replication+cycle+in+heterokaryons+excludes+dominant+restrictions+in+human+non-liver+and+mouse+liver+cell+lines.">Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines.</a> PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).</li><li>Lindemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+particle-associated+glycoprotein+signal+peptide+essential+for+virus+maturation+and+infectivity.">A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity.</a> J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).</li><li>Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+permissive+cell+lines+for+subgenomic+and+genomic+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication.</a> J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).</li></ol>

TP recebeu honorários de consultoria da Biotest.

Apresentamos dois métodos para induzir a formação heterocário em células em cultura para a análise de dominantes negativos restrições que impedem a replicação do HCV. Utilizando estes procedimentos que excluída a presença de um factor dominante expressa constitutivamente ou induzida por vírus em vários figado humano não-e em linhas celulares de murídeo do fígado. O primeiro ensaio analisa principalmente se os fatores de restrição de impedir a montagem HCV e liberação de progênie infecciosa. Uma vez...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> 41965-039 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Non-aminoácidos essenciais </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> 11140-035 </td></tr><tr><td> A penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo </td><td> PAA, Cölbe, Alemanha </td><td> A15151 </td></tr><tr><td> α-E2 (CBH23) </td><td> gentilmente cedido por Steven Foung 10 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma, Steinheim, Alemanha </td><td> A2833-106 </td></tr><tr><td> Glutationa </td><td> Sigma, Steinheim, Alemanha </td><td&gt; G4251-1G </td></tr><tr><td> Blasticidina </td><td> Invivo Gen, San Diego, EUA </td><td> Ant-bl-1 </td></tr><tr><td> G418 (geneticina) </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> 11811-064 </td></tr><tr><td> Polietileno-glicol-1500 </td><td> Roche, Mannheim, Alemanha </td><td> 10783641001 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Roth, Karlsruhe, Alemanha </td><td> 0.335,3 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roth, Karlsruhe, Alemanha </td><td> 3051,2 </td></tr><tr><td> Soro de cabra </td><td> Sigma, Steinheim, Alemanha </td><td> G9023-5mL </td></tr><tr><td> α-NS5A (9E10) </td><td> Gentilmente cedido por Charles Rice 7 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-fenilindol dicloridrato) </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td></tr><tr><td> Alexa-Fluor 546 - cabra anti-IgG humana </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> A21089 </td&gt; </tr><tr><td> Alexa-Fluor 488 - cabra anti-IgG de rato </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> A10680 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> CellTracker CMTMR </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> C2927 </td></tr><tr><td> CellTracker CMFDA </td><td> Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha </td><td> C2925 </td></tr><tr><td> Fluoromount </td><td> Sigma, Steinheim, Alemanha </td><td> F4680-25ML </td></tr><tr><td> Todos os outros produtos químicos </td><td> Roth, Karlsruhe, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> De cultura de células materiais </td><td> Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha </td><td></td></tr></tbody></table>

two methods of heterokaryon formation to discover hcv restriction factors

Vírus da hepatite C (HCV) é um vírus hepatotrópico com uma gama de hospedeiros restrita aos seres humanos e chimpanzés. Embora HCV replicação de RNA tem sido observada em linhas de células humanas não-hepáticas e de murídeo, a eficiência foi muito baixa e necessários procedimentos de longo prazo de selecção utilizando HCV replicão constrói expressando dominantes antibiótico-seleccionáveis ​​marcadores 1-5. HCV in vitro de pesquisa é, portanto, limitados a linhas celulares de hepatoma humano permissivas para a entrada do vírus e conclusão do ciclo de vida do vírus. Devido a HCVs tropismo espécies estreito, não existe nenhum modelo animal imunocompetente pequena disponível que sustenta o ciclo de replicação do HCV completa 6-8. Replicação ineficiente do HCV em células não-humanos, por exemplo de origem do rato é provavelmente devido à falta de incompatibilidade genética de factores do hospedeiro essenciais de dependência e / ou expressão de factores de restrição. Investigamos se a propagação HCV é suprimida por fa restrição dominantectors em qualquer linhas de células humanas derivadas de tecidos não-hepáticas, ou em linhas de células do fígado de rato. Para este fim, desenvolvemos dois independentes condicionais de complementação trans métodos que dependem somática fusão celular. Em ambos os casos, a conclusão do ciclo de replicação viral só é possível em os heterocariontes. Por conseguinte, a complementação trans-sucesso, o que é determinado por medição da produção de novo de descendência virai infecciosa, indica ausência de restrições dominantes. Especificamente, subgenómico replicões de HCV que transportam um transgene de luciferase foram transfectados para altamente permissivas células de hepatoma humano (Huh-7.5 células). Subsequentemente, estas células foram co-cultivados e fundidos a várias células humanas e de murino expressando HCV núcleo proteínas estruturais, envelope 1 e 2 (E1, E2) e acessório proteínas p7 e NS2. Desde que a fusão celular foi iniciada por meio de tratamento com polietileno-glicol (PEG), a cultura libertado infecciosa virai aaARTIGOS que as células infectadas sem tratamento prévio de uma forma do receptor-dependente. Para avaliar a influência das restrições dominantes sobre o ciclo de vida viral, incluindo entrada de célula, tradução do RNA, replicação e montagem do vírus, que se aproveitou de uma linha celular humana do fígado (Huh-7 células Lunet N 9) que não tem expressão endógena de CD81, um factor de entrada essencial do HCV. Na ausência de CD81 ectopicamente expressa, estas células são essencialmente refractário para infecção por VHC 10. Importante, quando co-cultivadas e fundidos com células que expressam CD81 humano, mas falta pelo menos um outro fator fundamental a entrada de células (ou seja, SR-BI, CLDN1, OCLN), apenas os resultantes heterocários exibir o conjunto completo de fatores de entrada HCV necessárias para a infecção. Portanto, para analisar se factores de restrição dominantes suprimir a conclusão do ciclo de replicação do HCV, que fundiram células Lunet N com várias células de origem humana e do rato que preenchem a crit acima mencionadoeria. Quando a co-cultura de células foram transfectadas com uma proteína do envelope viral altamente fusogénicos mutante do vírus sincicial protótipo (PFV 11) e subsequentemente desafiados com partículas infecciosas HCV (HCVcc), de novo de produção de vírus infeccioso foi observada. Isso indica que o HCV concluído com êxito o seu ciclo de replicação em heterocárions descartando assim a expressão de fatores de restrição dominantes nessas linhas celulares. Estas novas condicionais de complementação-trans métodos serão úteis para pesquisar uma grande painel de linhas celulares e células primárias para a expressão de factores específicos de HCV de restrição dominantes.

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Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Descrevemos dois métodos para condicional<em&gt; Trans</em&gt; Complementação de vírus da hepatite C (HCV) de montagem e da realização do ciclo de vida completo viral, que se baseiam na formação de heterocarionte. Estas técnicas são adequados para triagem de linhagens de células que expressam fatores de restrição dominantes, que impedem a produção de progênie HCV infeccioso.

Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

two-methods-heterokaryon-formation-to-discover-hcv-restriction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K visualizações.  Twincore, Centre for Experimental and Clinical Infection Research. Descrevemos dois métodos para condicional Trans Complementação de vírus da hepatite C (HCV) de montagem e da realização do ciclo de vida completo viral, que se baseiam na formação de heterocarionte. Estas técnicas são adequados para triagem de linhagens de células que expressam fatores de restrição dominantes, que impedem a produção de progênie HCV infeccioso.