Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão CA113734 concedido a F Yull e do Departamento de Assuntos de Veteranos (TS Blackwell).

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care Vanderbilt University Institucional e Comitê de uso. 1. Preparando Ratos transgênicos <ol><li> Ratinhos fêmea, positivo para o (N-kB F-G-L uciferase FP) repórter NGL transgene (descrito anteriormente 1) são utilizadas para este procedimento. Quando as fêmeas são pelo menos 6 semanas de idade, eles acasalar com um macho tipo FVB selvagem. Harem criação podem ser utilizadas (até 4 fêmeas em uma gaiola com um macho). (Nota: ratos da estirpe FVB foram utilizados para o estudo ratos mais escuras, tais como da estirpe C57BL6 podem também ser usados, mas estes ratos deve ser raspada antes da imagiologia.). </li><li> A partir de 15 dias pós-acasalamento, as fêmeas verificar regularmente para detectar sinais de gravidez (girth salientes grande). Cada fêmea deve ser separada uma vez grávida eo homem retirado da gaiola de criação uma vez que a última fêmea fica grávida. </li><li> Assista as fêmeas separados umd anotar a data de nascimento, quando aparece uma maca. A ninhada de pelo menos 6 crias é necessária para a lactação adequada. Oito dias após o nascimento da ninhada, prosseguir com o protocolo (ver Figura 1 para um esquema timeline). </li></ol> 2. Preparação para Injeção <ol><li> Dissolve-se o E. LPS de E. coli em PBS para uma concentração final de 0,1 ug / uL. 50 ul desta solução, ou um total de 5 ug, irá ser injectado na glândula mamária. Preparar um segundo tubo de PBS por si só deve ser usado para a injecção de controlo. </li><li> Definir-se um escopo de dissecação e de anestesia isoflurano. Um aparelho de nariz-cone deve ser fixado à fase do escopo de dissecação em que o rato será colocado. Uma boa fonte de luz, seja do âmbito próprio ou de holofotes extras também deve estar preparado. </li><li> Uma vez que o set-up é completa, iniciar a máquina isoflurano e fluxo de ar. </li></ol> 3. Injeção intraductal de LPS <ol><li> Carregar a seringa agulha curta com 50 ul da solução de LPS. Defina este lado. </li><li> Anestesiar o mouse para ser injetado pela primeira colocação do sexo feminino em uma caixa cheia de isoflurano e, depois, a respiração é lenta, ela passar para o palco e colocar o nariz dentro do nariz cone. Use uma pitada de igual para confirmar o mouse é totalmente anestesiado. Monitorizar a respiração do rato ao longo do processo e ajustar o nível de isoflurano em conformidade. A gaiola contendo a ninhada de filhotes que a fêmea tem sido tomadas a partir deve ser cuidadosamente retiradas até que a barragem pode ser devolvido após o procedimento. </li><li> Use uma pequena gota de etanol de 70% para fazer o casaco e colocar o plano para ajudar a visualizar o mamilo ligados à direita # 4 glândula mamária inguinal no abdômen inferior do mouse. </li><li> Concentre-se no âmbito de dissecação para uma visão ideal do mamilo. Com cuidado, use um conjunto de pinça fina para continuar a desenhar o mamilo longe da pele, mas não punção ou ferir o mamilo de forma alguma. Ofórceps nunca devem ser apertados em conjunto, quando da manipulação do tecido, mas utilizado com um porão de luz que requer uma quantidade mínima de tensão na mamilo. </li><li> Use a pinça na mão esquerda para segurar delicadamente o mamilo no lugar. Lentamente trazer a seringa pré-carregada no campo de visão usando a mão direita. A seringa deve ser mantido de modo a que nenhum reposicionamento tem que ocorrer de forma a injectar o conteúdo. </li><li> Uma vez que a seringa está em vista, procurar com cuidado na abertura pequena ductal dentro do centro do bocal, e inserir a seringa. </li><li> Sem reposicionar a mão, injecta o conteúdo da seringa e remover a agulha do mamilo. </li><li> Carregar uma segunda seringa com 50 ul de PBS para o controlo de injecção. Reposicionar o mouse sobre o palco e para a melhor vista da esquerda mamilo glândula mamária inguinal º 4 do outro lado do abdômen inferior do mouse. Repita os passos 3,4-3,7 utilizando a seringa PBS-carregado. </li><li> Uma vez que ambas as injeções são complEte, descontinuar a anestesia e mova o mouse para uma gaiola de recuperação. Monitorar a fêmea para assegurar que ela se torna móvel dentro de 5 min. Permitir que o rato para permanecer na gaiola de recuperação durante 1 hora. Depois de 1 hora de recuperação, coloque as costas feminino na gaiola com sua ninhada de filhotes. Ratos devem ser monitorizados periodicamente por 6 horas após a injecção antes de proceder à imagem. Em nossa experiência, não há conseqüências adversas foram observadas em qualquer fêmea ou os filhotes durante o período entre a injeção e de imagem. No entanto, se os sinais de perigo são observadas no sexo feminino (por exemplo, a postura arqueada, mordendo ou guarda do local de injecção, letargia geral) ou os filhotes (sem movimento, cor azulada da pele) a experiência deve ser interrompida. </li></ol> 4. Bioluminescent Imaging para Visualize NF-kB Atividade <ol><li> Uma vez que ratos foram transportados para a unidade de imagem, iniciar o procedimento de imagem, abrindo o software e inicializar a máquina. Ligue o éoflurane máquina e do fluxo de ar, assegurando que a anestesia é a fluir para ambos a caixa e a câmara de geração de imagens. </li><li> Posicione o mouse sob anestesia isoflurano na caixa de anestesia claro. Uma vez que a respiração desacelerou, use uma pitada de igual para confirmar o mouse é totalmente anestesiado. Em seguida, injecta-se 100 uL de substrato de luciferina no rato por injecção de retro-orbital 5 usando uma seringa estéril. </li><li> Transferir imediatamente o mouse para a câmara de imagem e colocar o nariz sob o isoflurano nariz-cone localizado lá. O mouse deve ser supina. Fixe cada pé para o palco com fita. </li><li> Entrada as configurações apropriadas para o software IVIS para tomar tanto uma imagem de luz branca fotográfico e uma imagem da atividade bioluminescente. O tempo de exposição deve ser de 10 segundos. Obter a imagem. </li><li> Uma vez que as imagens tenham sido adquiridos, permitem o mouse para se recuperar e, em seguida, colocá-la de volta na gaiola com seus filhotes e monitorar periodicamente. </li><li> A fotográfico e luminescentesas imagens são sobrepostas e automaticamente apresentada no ecrã, como na Figura 2. Analisar as imagens adquiridas, colocando região de interesse ou &quot;ROI&quot; círculos de igual tamanho em cada lado do abdômen inferior do mouse (um sobre a glândula PBS-injetado e um sobre a glândula LPS-injetados). Defina a leitura para fótons. Um número deve ser exibido indica a luminescência detectada dentro de cada ROI (ver Figura 2B). Utilize este número em análise estatística. </li><li> Para exibir a imagem ideal, ajustar ainda mais o limiar do sinal exibido. Isso não vai alterar a luminescência total de Leitura, mas irá permitir que você remova sinal de fundo e visualizar as diferenças entre o controle e LPS-tratados glândula. Diminuir a quantidade de luminescência mostrado até a glândula PBS-injetada é livre de sinal de fundo. Isso deve deixar o sinal aumentado na glândula LPS-tratado ainda aparente na imagem, como pode ser visto na Figura 2. </li><li> AdditionaAnálise l, incluindo os ensaios de proteína e ARN, pode ser preenchido com tecido mamário recolhida da fêmea post-mortem 6. </li></ol> 5. Resultados representativos Para se obter resultados interpretáveis ​​destes métodos, LPS (ou PBS) devem ser infundido apenas para as condutas mamárias, deixando o tecido adjacente intacta. A injecção no tecido subcutâneo envolvente do bocal irá resultar em inflamação devido a uma lesão em vez da infecção simulada. Injecção de corante azul de tripano diluído em PBS é útil quando a aprendizagem da técnica. Figura 3A mostra uma glândula com sucesso injectado infundidos com 100 ul de azul de tripano em PBS. Como se mostra, apenas a árvore ductal deve ser cheio com a solução injectada, e não deve haver nenhuma bolus no local da injecção. A &quot;bolus&quot;, neste contexto, é uma acumulação de líquido injectado no bocal ou no tecido que envolve o bocal sem infusão para a árvore ductal. Este é shprópria na Figura 3B. Por favor note que as injecções de prática mostrado na Figura 3 foram completadas em uma fêmea no dia 21 da lactação. Durante o pico de lactação (dias 8-10, a fase em que é injectado por LPS utilizando o protocolo de corrente), o leite é abundante, e é difícil de visualizar as condutas e determinar se a injecção ter sido concluída correctamente. Portanto, os pontos depois do tempo em lactação são melhores para injeções de prática. Injeção bem sucedida de LPS nos resultados mamárias dutos em aumento de NF-kB atividade dentro da glândula. Isso deve ser evidente no rato repórter sobre IVIS de imagem, e a glândula LPS injectada deve ter substancialmente a actividade de luciferase mais elevada (medido por contagem de fotões) que a glândula PBS-injectado, conforme mostrado na Figura 2 (em média, a glândula LPS lê 200% do sinal de controlo de PBS). Um aumento estatisticamente significativo da luminescência nas glândulas LPS-tratadas como amostraared ao controle contralateral foi feito através da realização de um grupo de 4 ratos 4. Um estudo adicional também utilizados para injeção mamária intraductal de qualquer E. coli ou LPS em transgênicos repórter NF-kB. Semelhante ao nosso próprio trabalho, esses autores viu um aumento significativo na atividade de repórter hr 6 depois E. coli injeção 2. Por favor note, devido à atividade de NF-kB constitutivo no cérebro e outros órgãos abdominais, as cabeças e abdômen de ratos nosso repórter mostram consistentemente um sinal quando fotografada, mesmo na linha de base antes de qualquer manipulação. Assim, este sinal deverá ser ignorado no que diz respeito a esta experiência. Um sinal evidente deve permanecer dentro da glândula mamaria LPS injectada após a leitura de imagem é ajustado para minimizar a luminescência fundo na glândula PBS. Figura 2 mostra as imagens com o fundo reduzido. Injeção mal sucedida da glândula vontademais provável resultado em dano ao mamilo. Isto fará com que assinalou, a inflamação da pele-nível que será evidente em cima da imagem latente. Este tipo de sinal de ferimento será muito forte e confinado à área do bocal em que o dano tenha ocorrido, não emana toda a glândula, como pode ser visto depois de uma injecção de LPS de sucesso para as condutas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática de Procedimento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Figura 2. Os resultados representativos de IVIS bioluminescente de imagem. (A) Adquirida imagem com fundo reduzido, revelando o aumento da atividade da luciferase na glândula LPS-injetados. (B) imagem de uma região com juros de quantificações acrescentou. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3 injecção Practice:.. Glândula mamária injectados com corante via injecção intraductal Para testar a exactidão do fornecimento através do bocal, um ratinho no dia 21 da lactação foram injectados com 100 uL de corante azul de tripano diluído em PBS. Após o sacrifício, a glândula foi exposto para visualização. (A) a injecção de sucesso e (B) em bolus de corante no mamilo.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui nós utilizamos um rato transgênico repórter NF-kB e uma técnica de injeção otimizado à mastite modelo, inflamação do tecido da mama mais comumente causada por infecção bacteriana. O passo mais importante neste processo é a injeção intraductal si. Na prática, é normalmente aparente se a injecção intraductal tem sido bem sucedida. A injecção dos agentes (LPS ou PBS) deve sentir-se fluido e não deve haver pouca ou nenhuma resistência, como a seringa é esvaziado. A ar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Lipopolissacárido de Escherichia coli (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> sorotipo 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 46-013 CM- </td><td></td></tr><tr><td> 31 seringa de insulina Calibre </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Agulha curta </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando escopo </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell isoflurano, USP </td><td> MINRAD INC para Rx Elite </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 sistema de imagem &lt;/ Td&gt; <td> Caliper (anteriormente Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de injecção de luciferina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-luciferina Firefly, monohidrato de sal de sódio (Substrato luciferina) </td><td> Química e Biologia Biosynth </td><td> L-8240 </td><td> Diluir a 10 mg / ml </td></tr></tbody></table>

intraductal injection of lps as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an nf-&kappa;b reporter transgenic

Os modelos animais de doenças humanas são necessárias a fim de estudar rigorosamente as fases de progressão da doença e os mecanismos associados, e, finalmente, como modelos pré-clínicos para testar intervenções. Nestes métodos, é descrita uma técnica na qual os lipopolissacáridos (LPS) é injectado na glândula mamaria de rato lactante através do bocal, de forma eficaz a mastite modelagem, ou a inflamação, da glândula. Isto resulta de infecção simulados em maior fator nuclear kappa B (NF-kB) de sinalização, como visualizado através de imagem de bioluminescência de um rato repórter NF-kB luciferase 1. Nosso objetivo final no desenvolvimento desses métodos foi estudar a inflamação associada com mastite na glândula lactantes, que muitas vezes inclui vermelhidão, inchaço, e infiltração de células imunes 2,3. Por isso, estavam completamente cientes de que a incisão ou a qualquer tipo de ferimento da pele, do mamilo ou da glândula de modo a introduzir os LPS poderianão ser utilizado nos nossos métodos desde que a abordagem provavelmente confundir a leitura de inflamação. Nós também desejou um método simples e direto que não exige feitos especialmente desenhados à mão pipetas ou o uso de micromanipuladores para manter essas ferramentas especializadas no lugar. Assim, determinou-se a utilizar uma seringa de insulina comercialmente disponíveis e para injectar o agente dentro do ducto mamário de um mamilo intacta. Este método foi bem sucedida e permitiu-nos estudar a inflamação associada com a injecção de LPS, sem quaisquer efeitos adicionais sobrepostos pelo processo de injecção. Além disso, este método também utilizado um NF-kB luciferase repórter transgénico do rato e bioluminescentes tecnologia de imagem para mostrar visualmente e quantitativamente aumentar a sinalização de NF-kB na glândula LPS injectada 4. Estes métodos são de interesse para pesquisadores de várias disciplinas que desejam doença modelo dentro da glândula mamária em lactação, em última análise, a técnicaaqui descrita pode ser utilizada para a injecção de um certo número de substâncias, e não está limitado a apenas a LPS.

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Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&amp;kappa;B Reporter Transgenic

Aqui descrito é uma técnica na qual lipopolissacárido é injectado na glândula mamaria de rato lactante através do bocal para simular a mastite, uma condição geralmente causada por infecção bacteriana. Resultados lipopolissacarídeos injeção em maior fator nuclear kappa B (NF-kB) de sinalização, visualizado através de imagem de bioluminescência de um rato repórter NF-kB luciferase.

Injeção intraductal de LPS como um modelo do rato de Mastite: Sinalização visualizada através de uma NF-kB Reporter transgênico

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

intraductal-injection-lps-as-mouse-model-mastitis-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

19.1K visualizações.  Vanderbilt University Medical Center. Aqui descrito é uma técnica na qual lipopolissacárido é injectado na glândula mamaria de rato lactante através do bocal para simular a mastite, uma condição geralmente causada por infecção bacteriana. Resultados lipopolissacarídeos injeção em maior fator nuclear kappa B (NF-kB) de sinalização, visualizado através de imagem de bioluminescência de um rato repórter NF-kB luciferase.

Vídeo: Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

Injeção do mouse parede da bexiga

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Medicina

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Desenvolvimento de um modelo de rato baseada alfa-sinucleína para a doença de Parkinson por meio de injecção estereotáxica de um vector viral recombinante adeno-associado

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Induzida por punção neovascularização de Iris como um modelo do rato da Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Ácido oleico-injeção nos suínos como um modelo para a síndrome respiratória aguda

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Precision-Cut Liver Slices como um modelo ex vivo de biologia hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Um modelo de rato para pancreatite crônica através da infusão TNBS do ducto biliar

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...