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Todos os experimentos com animais são realizadas de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Toledo. 1. A fenotipagem de pIL1-DsRed Mice NOTA: Offspring são gerados por meio de cruzamento ratos pIL1-DsRed heterozigotos com o tipo selvagem camundongos (WT) C57BL6. Três a quatro semanas filhotes velhos são considerados prontos para fenotipagem. Sangramento submandibulares de ratinhos segue um protocolo estabelecido com modificações menores 23. <ol><li> O isolamento de glóbulos brancos do sangue total de rato filhotes de cachorro <ol><li> Adicionar 20 ul de heparina a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adquirir um filhote da gaiola. Grave a etiqueta do filhote de identificação. Não é necessário para anestesiar filhotes antes de recolha de sangue a partir da veia submandibular. </li><li> Segure filhote de cachorro pela nuca do pescoço e perfurou a veia submandibular no thbolsa da bochecha e usando uma lanceta 5 mm. Aplicar uma força suficiente para criar um pequeno furo, de modo que as gotas de sangue exalam do ponto de penetração. Utilize uma agulha nova para cada filhote. </li><li> Recolhe 3 - 5 gotas de sangue por pup num tubo de microcentrífuga contendo heparina. Limpar o local da punção e aplicar pressão para facilitar a hemostasia. </li><li> Coloque cinzento em nova gaiola e observar durante 30 min antes de voltar a gaiola para a instalação para animais. </li><li> Recolha de sangue a partir de ratinhos adultos de um fenótipo conhecido como controlos positivos e negativos. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lise de células vermelhas do sangue a cada um dos tubos, os tubos de vórtice e incubar durante 5 - 10 min em gelo. </li><li> Adiciona-se lentamente 400 - 500 ul de soro de bovino fetal (FBS) por baixo das suspensões de células em cada tubo. Uma interface clara pode ser observado entre a suspensão de células da camada superior e a camada inferior de FBS. </li><li> tubos com tampas de amostras e centrifugar a 1.500 × g por 5 min. </li><li> Repita os passos 1.1.7 - 1.1.9 à peleterap remover as células vermelhas do sangue. Não repita se lise é suficiente pela primeira vez. O sedimento deve ser difícil de discernir, após a centrifugação. </li></ol></li><li> Lipopolissacarídeo (LPS) Estimulação e Cultura <ol><li> Ressuspender as células em 200 ul de completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de citometria de fluxo. </li><li> Adicione LPS solução de trabalho através da mistura de 10 uL de solução de reserva de LPS (1 mg / ml) com 990 ul de meio RPMI 1640 completo. </li><li> Adicionar 20 ul de 10 ug / ml de LPS de solução de trabalho de 200 ul de suspensão de células. </li><li> Tampão tubos frouxamente e incubar as amostras durante 4 horas a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Fluxo de Análise de Citometria <ol><li> Abra o programa de aquisição de dados para citometria de fluxo. Configurar o modelo de aquisição antes de provar aquisição. </li><li> Clique na ferramenta Dot-Plot na paleta ferramenta. Desenhar uma fodispersão rward (FSC) vs dispersão lateral (SSC) enredo. Defina os parâmetros de tensão FSC e SSC a escala linear. </li><li> Selecione os limites inferiores de FSC e SSC permitidos pelo citômetro. Aplicar limiares de 200 e 50 para o FSC e SSC, respectivamente. </li><li> Dentro do FSC vs SSC trama, desenhar um G1 portão que inclui monócitos, granulócitos e células dendríticas, e exclui detritos, células vermelhas do sangue e linfócitos. </li><li> Clique na ferramenta histograma na paleta ferramenta. Desenhar um histograma FL2 (canal de fluorescência vermelha). Usar uma amostra de controlo negativo para definir a linha de base dos sinais de FL2 e uma amostra de controlo positiva para desenhar um portão para incluir todos os eventos positivos DsRed. </li><li> No painel Fluidics Controle do citômetro, defina o modo fluido a &quot;RUN&quot; ea taxa de fluxo para &quot;HI&quot; (cerca de 60 mL / min). Adquirir 10.000 eventos para cada amostra. </li><li> Determinar pup fenótipo através da medição da percentagem de células positivas DsRed da porta G1. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. A indução da inflamação da pele em pIL1-DsRed Mice <ol><li> Anestesiar rato por injecção intraperitoneal (ip) de injecção de um cocktail anestésico contendo 100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg de xilazina, e 1 mg / kg de acepromazina. camundongos devidamente anestesiados não mostram retirada da pata traseira para pitada dedo do pé. </li><li> Aplique o creme de remoção de pêlos à superfície dorsal de ambas as orelhas do rato. Aguarde 30 segundos a 1 min. Limpe a superfície da orelha com algodão molhado em água e deixe secar ao ar. </li><li> Medir a espessura da orelha usando micrômetro e substituir rato em uma gaiola separada. Observar até à recuperação da anestesia (~ 15-30 min). Para resolver a inflamação da pele induzida pelo produto da remoção do cabelo, permitem mouse para descansar por 3 dias antes da experimentação adicional é realizada. </li><li> Prepare a 1,25% (w / v) OX dissolvendo 16,7 mg de OX em 1 ml de acetona e mistura de 750 ul de solução / acetona OX, com 250 ul de azeite. Preparar a solução de veículo através da mistura de 750 mL de acetona com 250 &amp;# 181; l de azeite. </li><li> Re-anestesiar o mouse através de injecção ip de cocktail anestésico (2,1). Medir a espessura da orelha como antes. </li><li> Aplicar 12,5 ul de 1,25% OX em cada lado da orelha direita. Aplicar 12,5 ul de solução veículo de acetona / azeite em cada lado da orelha esquerda. </li><li> Mantenha o mouse separar gaiola companheiros até que esteja totalmente recuperado para prevenir insulto aos seus ouvidos por outros ratos, em seguida, substituir o mouse em sua gaiola original e voltar a instalação de alojamento animal. NOTA: A remoção do cabelo pode resultar em inflamação de pele menor seguindo pela mudança da espessura da orelha. Esta inflamação menor será resolvido 3 dias mais tarde confirmada pela espessura do ouvido normal. Após a aplicação tópica, durante 24 h, tratada orelhas-OX mostram significativa (p &lt;0,01) em comparação inchaço solução de veículo sozinha ouvidos tratados. </li></ol> 3. Rotulagem de neutrófilos no pIL1-DsRed Mice NOTA: Na rotulagem vivo de neutrófilos pela baixa dose de fluorescence-conjugado mAb específicos de neutrófilos segue um protocolo recentemente desenvolvido 19. Injecções retro-orbital, são realizadas de acordo com um protocolo estabelecido com algumas modificações 24. <ol><li> Preparar solução de trabalho de anti-Ly6G mAb por diluição de 10 ul de 0,5 mg / mL de Alexa Fluor 647 conjugado com anti-Ly6G mAb (clone 1A8) em 90 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Transferir 100 ul da solução de trabalho Ly6G anti-mAb (50 ug / ml) para uma seringa de insulina U-100 com agulha de calibre 28. </li><li> Anestesiar um adulto pIL1-DsRed do mouse através de injecção ip do cocktail anestésico descrito anteriormente (2,1). Coloque o abdómen do rato anestesiado para baixo em uma placa de trabalho limpo. </li><li> Aplicar uma pressão descendente suave para a pele e dorsal ventral de um olho mouse para se projetam parcialmente o globo ocular da tomada. </li><li> Cuidadosamente colocar a agulha, o bisel para baixo, segundo um ângulo de aproximadamente 30 ° no canto medial para a retro-orbitalseio. NOTA: O operador pode sentir a pressão, a penetração e resistência aliviada uma vez que as inserções de agulhas dentro do seio. </li><li> Lenta e suavemente injectar 100 ul de Ly6G mAb anti-solução (5 ug de mAb / murganho / injecção) no rato de trabalho. Remover a agulha rapidamente. Uma pequena quantidade de sangramento sugere uma injecção bem sucedida. </li><li> aplicar imediatamente 1,25% OX e solução de veículo para a orelha esquerda do rato e direita. </li><li> Após 8 h, administrar 100 ul de solução preparada de fresco de mAb anti-Ly6G de trabalho (5 ug de mAb / murganho / injecção) através de injecção retro-orbital no mesmo rato. </li><li> Para visualizar os vasos sanguíneos, imediatamente antes de imagem, administrar 100 ul de 30 mg / ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated dextrano (150 kDa) por meio de injecção de retro-orbital. </li></ol> 4. Imagem intravital de neutrófilos Priming em pIL-1-DsRed Mice <ol><li> Anestesiar rato com injeção ip de cocktail anestésico (2,1).0; Aplicar pomada veterinária para os olhos do mouse para evitar a secura sob anestesia para a imagem latente. <ol><li> Prepare 1 ml de meia-dose cocktail anestésico por diluição de 500 uL de mistura de anestésico original com um volume igual de PBS. </li><li> Transferir a metade da dose de cocktail de anestésico a seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 27 de borboleta. </li><li> Insira a agulha de borboleta no abdômen do rato por via intraperitoneal e corrigir a asa de borboleta para o abdômen gravando. </li></ol></li><li> Coloque uma lamela de vidro no centro da fase de imagem. Tape as bordas da lamela para segurá-la no lugar. </li><li> Colocar uma gota de PBS na superfície ventral da orelha de rato, bem como sobre a lamela. </li><li> Posição anestesiados rato com a sua orelha sobre a lamela. Montar a ponta da orelha, com o lado dorsal para baixo, como um sanduíche entre a orelha da lamela e uma lâmina de vidro, também mantida no seu lugar por meio de fita adesiva. </li><li> Ligue um multi-laser de microscópio de fluorescência confocal e todo o relacionado equipment. Desligue as luzes de quarto para minimizar a exposição de luz ambiente. </li><li> Abra o software de aquisição de imagem. Selecionar os canais de laser para detecção de corantes fluorescentes no menu Lista Dye. </li><li> Ajuste o foco na pele da orelha inflamado pela observação de sinais verdes dos vasos sanguíneos e sinais vermelhos das células DsRed + através da ocular. </li><li> Executar uma verificação rápida com velocidade de digitalização de 2 mS / pixel e resolução de 512 × 512 pixels. Selecione um pseudo para cada canal no menu Exibir Live. Ajuste o botão de foco para definir o fim e começar a localização da digitalização. </li><li> Realizar varreduras lentas com velocidade de digitalização de 4-8 ms / pixel e resolução de 800 × 800 ou 1.024 × 1.024 pixels. Ajustar a alta tensão, ganhar, e deslocamento em cada canal para maximizar a intensidade de sinais, evitando saturação (pixels vermelhos). Deve haver apenas alguns pixels vermelhos em cada canal. </li><li> Criar conjuntos de imagens tridimensionais, digitalizando thpele e orelha começando superficialmente no estrato córneo e progredindo para baixo com x, y, os volumes z de 317 uM × 317 uM × 30 mm (objectiva 40x), 635 uM × 635 uM × 30 mm (objectiva 20x), ou 1.270 uM × 1.270 mm × 50 mm (objetiva de 10X) em 2 mm z-passos. NOTA: O estrato córneo é a camada mais externa da epiderme e pode ser facilmente localizado com base no seu sinal de autofluorescência forte. </li><li> Em experimentos com imagens de lapso de tempo, ficha imagens tridimensionais a cada 2 ou 4 min por até 8 horas. </li><li> De forma intermitente, como o rato começa a se recuperar da anestesia, observou baseada na observação de bigodes espasmos, administrar 5 - 10 l de meia dose cocktail anestesia através da agulha borboleta. NOTA: Tenha cuidado com a dose de anestesia - overdose pode causar a morte mouse. Alternativamente, a anestesia por inalação de um frasco pode ser aplicado para o rato para anestesia a curto prazo e umcone de nariz pode ser usado para imagiologia de longo prazo. </li><li> Remover o rato anestesiado do palco quando imaging está completa. Retire a fita e remover a agulha borboleta do abdómen do mouse. Devolver o mouse para uma gaiola separada na unidade de alojamento dos animais. NOTA: Para imagens de curto prazo (&lt;1 hora), os ratos se recuperar totalmente da anestesia rapidamente em 1-3 horas. Para imagiologia de longo prazo (~ 8 horas), os ratos recuperar lentamente, com um período de recuperação típico de 12 - 16 horas. Assim, a administração de água oral é recomendado, pelo menos várias vezes durante o período de recuperação para evitar a desidratação grave. </li><li> Conjuntos de dados de imagem de processo, rastrear células individuais, gerar rotas migratórias, e calcular a direção e velocidade de migração celular usando a imagem do software de análise 25. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems:+instability.">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li><li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+the+experiment.">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li><li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses.">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li><li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy.">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li><li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

O objetivo deste estudo é desenvolver uma tecnologia para monitorar o processo de priming de neutrófilos em animais vivos, que ainda não foi cumprida pelas técnicas atualmente disponíveis. Para atingir este objectivo, três metodologias estabelecidas são realizados: 1) a indução de inflamação da pele em ratinhos repórter DsRed-driven promotor de IL-1p como uma medida da escorva, 2) in vivo rotulagem dos neutrófilos com doses baixas de fluorescência-conjugado anti-Ly6G mAb, e 3) de imagem de microsc...

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes e de curta duração em circulação. Eles são rapidamente recrutadas para os locais de infecção ou lesão, onde servem fagócitos como profissionais através de liberação de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, juntamente com grânulos contendo peptídeos antimicrobianos e proteases 1. Durante o seu recrutamento, os neutrófilos são &quot;preparada&quot; por vários agentes, incluindo os produtos microbianos, quimioatractivos, e citocinas inflamatórias, resultando em funcionalidade de fagócitos marcadamente melhorada após a chegada ao sítio de inflamação 2. Os mecanismos de escorvamento de neutrófilos têm sido extensivamente estudada in vitro 3,4; No entanto, o controlo dinâmico do processo in vivo, não foi possível até à data. Recentemente, tornou-se imagens intravital uma técnica importante para visualizar e quantificar a dinâmica de processos biológicos celulares em organismos vivos. IntraviTal imagem pode ser realizada por meio de microscopia de excitação de um fotão convencional (por exemplo, confocal) ou microscopia multifotônica aproxima 5. Com o tempo, melhorias substanciais foram alcançados nesta técnica que permite maior resolução de imagem, profundidade de imagem melhorada, diminuiu photodamage tecidos e melhorada 6,7 estabilização de imagem. Dada a sua capacidade única para permitir a visualização dinâmica da migração celular e interação ao longo do tempo, microscopia intravital tem sido amplamente aplicada a diversas áreas de estudo em imunologia 8. imagens intravital permite imunologistas para melhor compreender e contextualizar as respostas imunes, tanto a nível celular e molecular em modelos animais vivos. Os recentes avanços na transgênicos, bem como knock-in ratos repórter forneceram ferramentas úteis para o monitoramento dos comportamentos dinâmicos de neutrófilos em animais vivos. Lisozima M promotor-driven proteína verde fluorescente melhorada knock-inratos têm sido amplamente utilizados para caracterizar a motilidade de neutrófilos, monócitos e macrófagos, durante vários processos inflamatórios incluindo extravasamento, infecção bacteriana, e a inflamação estéril 9-15. Além disso, os ratinhos transgénicos que expressam uma energia de ressonância de fluorescência de transferência biossensor citoplasmática foram empregues para estudar as actividades dos neutrófilos mitogénio quinase extracelular regulada e proteína quinase A dentro de intestino inflamado 16. Um modelo murino com elevada especificidade para a expressão de fluorescência em neutrófilos é a knock-in rato Catchup, que produz a recombinase Cre, bem como a proteína fluorescente tdTomato, que por sua vez está acoplado a expressão de antigénio de linfócitos 6G (Ly6G) 17. A visualização de neutrófilos Ly6G deficientes via este modelo tem demonstrado que estas células exercer funcionalidade normal numa variedade de contextos in vivo inflamatórias estéreis ou infecciosas em. camundongos transgênicos expressando o DsRed fluorescente protein gene sob o controlo do rato interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) ter sido utilizada para visualizar os comportamentos motilidade de células produtoras de IL-1 - Acredita-se que os neutrófilos, os monócitos inflamatórios, e macrófagos activados - emergente em pele inflamada 18. In vivo rotulagem pode servir como uma abordagem alternativa para a detecção de comportamentos celulares e moleculares de neutrófilos nos tecidos inflamados. Depois de injecção intravenosa de doses baixas de anticorpo monoclonal marcado por fluorescência anti-Gr-1 (Acm), a cascata de recrutamento de Gr-1 + neutrófilos foi visualizada em lesões da pele do rato infectados com Staphylococcus aureus 19. Administração in vivo de conjugados contendo estreptavidina conjugados 705 pontos quânticos nm e mAb anti-Ly6G biotinilado rotular especificamente neutrófilos circulantes 20. Além disso, a endocitose de tais conjugados em neutrophIL vesículas permite o acompanhamento do transporte de vesículas de alta velocidade em neutrófilos que migram para o interstício. In vivo, marcação com anticorpos de fluorescência conjugada contra a P-selectina Ligando-1 Glicoproteico (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e quimioquina (motivo CXC) do receptor 2 (CXCR2) num modelo inflamatória induzida por TNFa tem elucidado os mecanismos de regulação em jogo durante a inflamação precoce 21. neutrófilos polarizados sobressair urópodos PSGL-1-enriquecida para interagir com CD62L presente em plaquetas activadas, resultando na redistribuição de CD11b e CXCR2, receptores que dirigem a migração de neutrófilos e iniciam a inflamação. IL-1β é um dos genes de assinatura que é elevado em neutrófilos sensibilizados 22. Em ratinhos repórter pIL1-DsRed, DsRed sinais de fluorescência (isto é., A activação do promotor de IL-1β) correlacionam-se positivamente com a IL-1β expressão de ARNm e a produção de proteína IL-1β. &lt;sup&gt; 18 Para monitorar o processo de priming de neutrófilos, um método de microscopia intravital foi desenvolvido envolvendo a indução de inflamação da pele com oxazolona (OX) no modelo do rato pIL1-DsRed seguinte rotulagem in vivo de neutrófilos com Ly6G anti-mAb fluorescência conjugada. Através deste modelo, é possível estudar o comportamento e função de neutrófilos, preparadas em modelos animais de várias doenças e desordens.

<table><tbody><tr><td>Heparin sodium</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Hair-removal cream</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 insulin syringe with 28 G needle</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly infusion set (27 G needle)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea humana e são rapidamente recrutados para sítios inflamatórios. Priming é um evento crítico que aumenta a funcionalidade fagocitária dos neutrófilos. Apesar de extensos estudos têm revelado a existência e importância de priming de neutrófilos durante a infecção e lesões, os meios de visualizar este processo in vivo têm sido indisponíveis. O protocolo fornecido permite o monitoramento do processo dinâmico de neutrófilos priming em animais vivos através da combinação de três métodos: 1) sinal de repórter DsRed - usado como uma medida de priming 2) in vivo rotulagem de neutrófilos - alcançada por injecção de antigénio anti-linfócito de fluorescência conjugada 6G (Ly6G) de anticorpo monoclonal (mAb) e 3) de imagem confocal intravital. Vários passos críticos estão envolvidos neste protocolo: Rato inflamação induzida por oxazolona pele da orelha, sedação adequada de animais, injeções repetidas de Ly6G anti-mAb, e prevenção do desvio de foco durante o exame. Embora não tenham sido observadas algumas limitações, tais como o limite de tempo de imagem contínua (~ 8 horas) em um mouse e o vazamento de isotiocianato-dextrano fluoresceína a partir de vasos sanguíneos no estado inflamatório, este protocolo fornece uma estrutura fundamental para imagiologia intravital de comportamento e função de neutrófilos com iniciador, que pode ser facilmente expandido para análise de outras células do sistema imunológico em modelos de inflamação do rato.

Rastreio dos ratinhos pIL1-DsRed é realizada com base no sinal de fluorescência fenotípica DsRed produzido pelos seus leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. Estimulação por LPS é capaz de induzir a produção de IL-1β em células mielóides, incluindo neutrófilos, monócitos, e células dendríticas 26-28. Assim, os leucócitos isolados foram incubados com LPS durante 4 h antes da análise de citometria de fluxo. Em seguida, é definida para propaga...

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Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K visualizações.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences. This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals. 

Vídeo: Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Imunologia e Infecção

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Biologia

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

Source: Anderson, L. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59015">A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

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