Agradecemos os membros do laboratório de Miller para a discussão e leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de novo investigador do Centro de Choque Nathan de Excelência em Biologia Básica do Envelhecimento a DLM e pelo National Institutes of Health prêmio R00 AG030550 a DLM.

1. Construção das Câmaras Ambientais <ol><li> Selecione o menor volume razoável de câmara necessário para o alcance de seu projeto. Câmara deve ser feita de gás (O 2) de material impermeável. Pratos Pyrex de cristalização, caixas Anaeropack, ou grandes fundido acrílicos-caixas (Ellard Instrumentation), podem ser usados. Descobrimos que 50 placas de 9 mm, podem caber em um prato 100 x 50 KIMEX cristalização. Placas de vidro pode ser usado como tampas para pratos de cristalização Pyrex. </li><li> Perfurar um furo na câmara seleccionado e se encaixam com um macho de plástico Luer para encaixe da mangueira farpa (Cole Parmer). Acessórios podem ser asseguradas por encaixe de tubulação ou com epóxi. Instalar um acessório semelhante no lado oposto do recipiente para permitir que o gás flua para dentro e para fora da câmara. Se possível, compensar furos para aumentar a mistura turbulenta. </li><li> Obter os tanques de gás comprimido com definidas O 2 concentrações (equilibrada com N 2) que são certificados padrão para ó co 2ntent ou, para as condições anóxicas, puro N 2 (&lt;10 ppm O 2). Use-automáticas mudar mais de reguladores para estudos de longo prazo para evitar perturbar os níveis de oxigênio nas câmaras. </li><li> Resposta à hipoxia organismal foi mostrado para ser temperatura 15 dependente. Ao colocar a câmara numa incubadora, a diferentes temperaturas pode ser mantida. Temperaturas dentro de uma incubadora pode ser irregular e, como tal, é prudente fazer uso de um registador de dados de temperatura para medir constantemente a temperatura no interior da câmara. </li></ol> 2. Ligar o gás para a Câmara Ambiental <ol><li> Para todas as conexões, use um oitavo de polegada de diâmetro exterior tubo conectado por meio de conectores o snap ou acessórios de compressão. Tubos devem ser impermeável e não reactivo com O 2, tais como etileno propileno fluorado (FEP) ou nylon (Cole Parmer). Para um diagrama esquemático da instalação completa, ver Figura 1. </li><li> Conecte o comprensados ​​tanques de gás para um dispositivo de controlo de fluxo, tais como um controlador de fluxo de massa (Sierra Instruments) ou rotâmetro (Aalborg). Assegurar que a pressão a montante do tanque está dentro do alcance do dispositivo de fluxo e as mangueiras farpa. Dois estágios reguladores são geralmente usadas, com a segunda etapa definida como a pressão desejada [Veja a seção três para selecionar a taxa de fluxo adequado] </li><li> O gás hidrato por borbulhamento através de água destilada utilizando uma garrafa de lavagem de gás com o cilindro poroso, em seguida, directa em um dos acessórios na câmara ambiental, deixando o encaixe segundo aberto para gases de escape (ver Figura 1). Para estudos de curto prazo, a hidratação de gás protege contra dessecação placa, mas a monitorização de humidade pode ser necessário para estudos de longo prazo. </li><li> Dow Corning graxa vácuo pode ser utilizado para vedar a câmara. Pesos de lugar sobre a tampa da câmara de assegurar uma vedação hermética. Para confirmar uma vedação firme e fluxo adequado, mantenha uma pequena piscina de água na palma da ynossa mão enluvada para o apetrechamento da câmara e verifique se há bolhas. </li></ol> 3. Seleção de Vazão <ol><li> Assumindo perfeita mistura, existe a troca gasosa de 90% da atmosfera gasosa cada vez que o volume da câmara é substituído (Lei de Fick). Por exemplo, em uma câmara de cc 100 com um caudal de 100 cc / min, o ar casa original na câmara de irá ser substituído com 90% do seu gás desejado depois de 1 minuto, e vai assintoticamente aproximar troca completa em 90% a cada minuto depois disso. </li><li> Maiores taxas de fluxo e recipientes menores vai chegar a sua concentração de oxigênio desejado mais rapidamente. Para 100 x 50 KIMEX recipientes (400 cc), uma taxa de fluxo de 120 cc / min atingirá troca 99,9% em 10 minutos (3 trocas). Esta taxa de fluxo é adequado para a maioria das condições de oxigénio. Para o nosso conhecimento, não houve uma investigação sistemática de como a taxa de variação da concentração de O 2 influencia a resposta em C. elegans. </li></ol><ol><li> Worms expostas a condições hipóxicas comumente escapar a superfície de placas de agar. Para evitar isso, colocar um anel de ácido palmítico (10 mg / ml em etanol) em torno da borda das placas. O ácido palmítico irá sair da solução como se evapora etanol, formando uma barreira física. Barreiras de ácido palmítico não afetar a taxa de postura de ovos, a fecundidade ou longevidade em C. elegans 16,17. Buraqueira não ocorre mais freqüentemente em condições de hipóxia, de modo adicionais medidas preventivas não são geralmente necessários. </li><li><ol><li> Gerar populações sincronizadas pelo branqueamento adultos grávidas em uma pequena gota de solução de lixívia alcalina em unseeded nematóides de crescimento da mídia (NGM) placas 18. Em contraste com protocolos padrão de lote-grande de hipoclorito de branqueamento, escolher 1-100 animais em uma gota de solução de lixívia na superfície de uma placa NGM, então permitir que a solução de lixívia para absorver na placa <sup&gt; 18. Após pelo menos 12 horas, transferir as larvas L1 sincronizado para placas semeadas com vivos OP50 bactérias. Alternativamente, pode-se permitir aos adultos fêmeas grávidas a pôr ovos na placa durante 2-3 horas para gerar um grupo de vermes que irá desenvolver síncrona ou escolher L4 larvas de uma população mista. </li><li> Evite expor embriões clareados à hipóxia, pois isso pode reduzir a viabilidade 13. Para recolher os embriões jovens (2-4 células), adultos fêmeas grávidas pode ser cortado em um pequeno volume de água com uma lâmina de barbear e embriões movido para placas por pipeta boca por exposição subsequente à hipoxia. </li></ol></li><li> Selar placas na câmara ambiental. Os animais de controlo deve ser mantido em normóxia (casa de ar), à mesma temperatura como vermes tratados. Não existe nenhuma diferença entre as amostras deixadas observável na casa de ar e as mantidas em uma câmara idêntica com casa de ar que flui sobre eles. Iniciar o fluxo de gás e manter uma exposição durante o tempo desejado. Para assegurar a uniformidade na rampa, certifique-se desubstituir a água no frasco de lavagem de gás antes da exposição. </li><li> Para a sobrevivência de embriões de ensaio, permitem que os vermes para desenvolver durante 48 h após o retorno ao ar ambiente, altura em que eles devem ser quarta fase larvas / dia um adultos. Pontuação para a sobrevivência, a censura quaisquer vermes que não podem ser contabilizados. </li><li> Para visualizar os animais expostos à hipoxia, mover vermes para uma gota de M9 sobre uma lamela 22 mm 2, e inverter para uma almofada de agarose a 2% em M9 18. Se o levamisole, necessário (25 mM) ou azida de sódio (10 mM) pode ser usado como anestésico. A azida de sódio e levamisole podem confundir algumas observações devido à toxicidade e deve ser judiciosamente usado 19. </li></ol> 5. Colheita rápida de hipoxemia expostas Worms (Exemplo: preparação de amostras para HIF-1 Análise ocidental) Muitos induzida por hipóxia efeitos são rapidamente revertidos após o retorno ao ar ambiente, incluindo a retomada de produção de ovos, 12 de fosforilação de epítopos de mitosena embriogénese 13 e degradação da proteína HIF-1 9,20. Isolamento rápido de animais expostos à hipoxia é necessária para se obter efeitos reprodutíveis nestas condições. Com esta configuração, os animais podem ser colhidos e congelados em azoto líquido em menos de dois minutos. Enquanto câmaras de hipóxia Porta-luvas para permitir a manipulação de amostras em condições anóxicas, o seu custo e praticidade para outras condições de anoxia limitar a sua utilidade. <ol><li> Crescer Bristol N2 vermes em 4 10 cm crescimento elevado (HG) placas até que a maioria dos vermes são adultos fêmeas grávidas 18. Lavar vermes para um tubo cónico de 15 mL contendo uma solução 01:05 de lixívia alcalina e incubar com rotação, até que os vermes começam a dissolver-se, não mais de 5 minutos 9. Lave os vermes três vezes com M9, girando para baixo a 1500 xg entre cada lavagem sem frenagem. </li><li> Embriões placa branqueada para 8 150 placas NGM mm e permitam desenvolver a L4 larvas (~ 48 horas para Bristol N2 a 22 ° C).Mover as placas para as câmaras ambientais e expor a hipóxica (1000 ppm, 5000 ppm) e (N2) anóxicas condições durante 4 horas. Os tempos de exposição variam de acordo com desenho experimental. Embora a exposição à hipoxia tem um efeito imediato sobre a taxa de postura de ovos, dois embriões de células morrem após 16-18 horas de exposição 12. Com esta configuração câmara de hipoxia, o limite inferior de exposição é limitada pela taxa de câmbio atmosfera necessária para atingir o equilíbrio. </li><li> Rótulo um tubo de microcentrífuga 1,5 mL e um tubo de 15 mL cónica para cada amostra experimental. Worms expostos à hipoxia são mais propensos a aderir aos lados do tubo, durante a colheita. Para evitar isto, o local de 100 uL de sulfato de sódio a 1% de dodecil (SDS) em cada tubo 15 mL cónico. Se SDS inibe aplicações a jusante, albumina de soro bovino (BSA) pode ser usado para evitar a aderência. O uso rotineiro de SDS ou BSA não parecem ter uma diferença aparente. Adicionar 50 ul de proteína 2x carregamento corante (4% de SDS, 10% 2-mercaptoetanol e umUm traço de azul de bromofenol em glicerol 30% (w / v)) para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tenha um Dewar de nitrogênio líquido pronto. </li><li> Horário das etapas após remover os vermes de hipóxia e registro. Remover a tampa para a câmara de hipóxico, tomar uma placa de amostra, e feche a câmara. Use água destilada para lavar os vermes para um filtro de nylon e, em seguida, derramar para dentro do tubo 15 mL cónico. Gire os vermes para baixo em uma centrífuga de mesa a 1500 xg durante 15-20 segundos com freio. </li><li> Use um vácuo para remover a maior parte do sobrenadante do tubo, deixando o verme pelete intacto. </li><li> Usando uma pipeta, mover o verme pellet em 50 uL para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Selar o tubo e imerso em nitrogênio líquido. </li><li> Repita até que todas as amostras terem sido isolado. Siga estes procedimentos para casa amostras de controle de ar para a consistência. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C. </li></ol> 6. Os resultados representativos Efeitos organismal de hipóxia pode ser vistoexaminando a viabilidade para a vida adulta de C. elegans (Figura 2). Embriões estabelecidas por tipo selvagem Bristol (N2) e hif-1 (ia04) mutantes de deleção são todos sobrevivem em casa com ar de O 2 concentrações (210.000 ppm O 2). N 2 vermes são capazes de se adaptar e sobreviver até a idade adulta em 5.000 ppm O 2, enquanto HIF-1 embriões não são viáveis. Isto mostra que HIF-1 é essencial para a adaptação a alteração dos níveis de oxigénio disponível no ambiente de 10. Nem N2 nem HIF-1 animais podem sobreviver a exposição a 1000 ppm O 2. A visualização verme directamente em hipoxia é viável com a utilização de um âmbito de dissecação e recipiente transparente (Figura 3). Por directamente colocando a câmara de hipóxia sobre o âmbito de dissecação, não há necessidade de remover os vermes de hipóxia para observar as reacções dos organismos. O âmbito pode ser equipado com illumation fluorescência (como na Figura 3 </strong&gt;), ampliando ainda mais os tipos de observações em hipóxia que são possíveis. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Figura 1. Exemplo de direcção da câmara. Hipoxia do fluxo de gás é indicado por setas. O gás é armazenado em tanques de gás comprimido com definidas O 2 concentrações (1) e um regulador de dois estágios está ligado (2). Gás entra no fundo do tubo de fluxo (3), que sai do topo, à taxa de fluxo correcta. Gás flui então para o balão de bolha (4), hidratar o gás (garantir a ligação correcta do balão bolha observando bolhas). Gás hidratado em seguida, passa para a câmara de hipóxia na válvula de entrada (5), expondo as amostras a hipoxia. O gás finalmente aberturas para dentro da sala através de um orifício de escape perfurados na câmara. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Figura 2. Viabilidade de embriões expostos a 1.000 ppm O 2, 5.000 ppm S <sub&gt; 2 e normóxia (~ 210.000 ppm O 2). Os embriões foram expostas a cada condições de oxigénio como embriões por 24 horas em câmaras de oxigénio de fluxo contínuo. Worms foram transferidas para condições normóxicas, deixou-se desenvolver até à idade adulta, durante 48 horas, e depois marcou para a viabilidade até à idade adulta. n&gt; 50, N = 5. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Figura 3. Visualização de C. elegans em hipóxia com microscopia. Worms estão expostos a hipóxia usando os métodos descritos. A câmara transparente ambiental (construído com um prato de cristalização pirex e placa de vidro) é colocado diretamente no palco de um escopo de dissecação. Dois pontos de vista são apresentados, incluindo um fluxo de gás de todo o conjunto para cima, o outro apenas com a câmara no palco microscópio.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este método apresenta uma estratégia para a construção de um ambiente hipóxico que permite a ambientes com concentrações precisas de oxigénio possa ser mantida no laboratório. Estas câmaras fornecer um método simples para expor os organismos específicos para baixas concentrações de O 2 e monitorização das saídas moleculares e fisiológicas. A câmara ambiental descrito é montado pelo laboratório, em vez de adquirida comercialmente e podem assim ser alterado para se adequar às necessidades ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tubulação (FEP e PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE) &#39;R-3603 </td></tr><tr><td> Acessórios de compressão </td><td> Sistemas de Seattle dos Fluidos </td><td> 06363-58 (M. acoplador 1/16 &quot;) 06363-62 (F. acoplador 1/16 &quot;) 06363-60 (M. acoplador 1/8 &quot;) 06363-61 (F. acoplador 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Tubo de fluxo </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010073 (3 saídas) PMR1-013520 (1 saída) </td></tr><tr><td> Controlador de fluxo de massa </td><td> Sierra Instruments </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Trak inteligente 2) </td></tr><tr><td> Tanque de gás comprimido </td><td> Airgas </td><td> Feito à ordem &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Plástico Luer macho para acessórios espigão </td><td> Cole Parmer </td><td> 45505-41 (série 500 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Elenco caixas de acrílico </td><td> Ellard Instrumentação </td><td> Feito sob encomenda </td></tr><tr><td> Acessórios para tubos (latão ou aço inoxidável) </td><td> Sistemas de Seattle dos Fluidos </td><td> B-402-1 (1/4 porca &quot;) B-200-3 (1/8 &quot;tee união) B-400-set (1/4 de virolas) B-QM2 B1-200 (QM QC Body) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;conn macho) </td></tr><tr><td> Dow Corning graxa para vácuo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> Caixa AnaeroPack </td><td> Misubishi Gas Chemical Company </td><td> R684004 (0,4 litro) R685025 (2,5 litro) R685070 (7,0 litro) </td></tr><tr><td> Pyrex frasco de lavagem de gás </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> O ácido palmítico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> Cabra anti-ratinho de peroxidase de rábano-IgG </td><td> Southern Biotechnology Associates </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal Oeste Substrato Chemiluminsecent Pico </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 pratos de vidro de cristalização </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on c. elegans

O oxigênio é essencial para todos os metazoários para sobreviver, com uma exceção conhecida 1. Diminuição da disponibilidade de O 2 (hipóxia) podem surgir durante estados de desenvolvimento da doença, normal ou mudanças nas condições ambientais 2-5. Compreender as vias de sinalização celular que estão envolvidos na resposta à hipóxia poderia fornecer uma nova visão sobre estratégias de tratamento para diversas patologias humanas, por acidente vascular cerebral ao câncer. Este objectivo tem sido impedida, pelo menos em parte, por dificuldades técnicas associadas com a exposição hipóxico controlada em organismos modelo geneticamente passíveis. Os Caenorhabditis elegans nematóide é idealmente adequada como organismo modelo para o estudo da resposta hipóxica, como é fácil de cultura e manipular geneticamente. Além disso, é possível estudar a resposta celular a específicos hipóxicas O 2 concentrações sem efeitos de confusão desde C. elegans obter O 2 (e outros gases) por difusão, em oposição a um sistema respiratório facilitada 6. Factores conhecidos para ser envolvido na resposta à hipoxia são conservados em C. elegans. A resposta à hipoxia real depende da concentração específica de O 2 que está disponível. Em C. elegans, a exposição a moderada hipóxia elicia uma resposta de transcrição mediada em grande parte por hif-1, os altamente conservadas hipóxia induzível-factor de transcrição 6-9. C embriões. elegans requerem hif-1 para sobreviver em 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . A hipóxia é um termo geral para &quot;menos de O normal 2&quot;. Normóxia (normal O 2) pode também ser difícil de definir. Nós geralmente consideram ar ambiente, que é 210.000 ppm O 2 estar normóxia. No entanto, tem sido mostrado que a C. elegans tem uma preferência comportamental para O 2 concentrações de 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. Em larvae e adultos, HIF-1 atua para evitar hipóxia induzida por diapausa em 5.000 ppm O 2 12. No entanto, hif-1 não desempenha um papel na resposta a concentrações mais baixas de O 2 (anoxia, definição operacional &lt;10 ppm O 2) 13. Em anoxia, C. elegans entra em um estado reversível de animação suspensa em que toda a atividade microscopicamente observável deixa 10. O fato de que diferentes respostas fisiológicas ocorrem em diferentes condições ressalta a importância de ter o controle experimental sobre a concentração hipóxica de O 2. Aqui, apresentamos um método para a construção e implementação de câmaras ambientais que produzem confiáveis ​​e reprodutíveis condições de hipóxia, com concentrações definidas de O 2. O método de fluxo contínuo assegura equilíbrio rápido da câmara, e aumenta a estabilidade do sistema. Além disso, a transparência eaacessibilidade das câmaras permitem a visualização direta de animais expostos à hipóxia. Nós ainda demonstrar um método eficaz de colheita C. elegans amostras rapidamente após a exposição à hipoxia, o que é necessário observar que muitas das alterações rapidamente-invertidas que ocorrem em 10,14 hipóxia. Este método proporciona uma fundação de base que pode ser facilmente modificado para as necessidades individuais de cada laboratório, incluindo sistemas de modelos diferentes e uma variedade de gases.

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Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Este artigo detalha como usar contínuo fluxo de câmaras de hipóxia para gerar atmosferas com concentrações definidas de O<sub&gt; 2</sub&gt; Para entender as respostas biológicas à diminuição da O<sub&gt; 2</sub&gt;. Este sistema é fácil de configurar e manter, e flexível o suficiente para atender uma ampla gama de O<sub&gt; 2</sub&gt; Concentrações e sistemas modelo

Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

creating-defined-gaseous-environments-to-study-effects-hypoxia-on-c

Research

JoVE Journal

Biology

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

12.0K visualizações.  University of Washington. Este artigo detalha como usar contínuo fluxo de câmaras de hipóxia para gerar atmosferas com concentrações definidas de O 2 Para entender as respostas biológicas à diminuição da O 2. Este sistema é fácil de configurar e manter, e flexível o suficiente para atender uma ampla gama de O 2 Concentrações e sistemas modelo

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...