Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. Pesquisa distúrbios do movimento no laboratório tem sido apoiado pela distonia Bachmann-Strauss &amp; Parkinson Foundation, Parkinson United Foundation, Parkinson Disease Association americana, doença de Parkinson Associação de Alabama, a Michael J. Fox Foundation for Research de Parkinson, e um de Iniciação Científica.

Construção expressão Plasmid Dois plasmídeos são necessários: um para o tecido-específicos a expressão do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionáveis. Experimental Plasmid <ol><li> Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, por exemplo, um nervo ou músculo-específicos promotor. Se uma é a de expressar genes múltiplos dentro do mesmo tecido, uma fita cassete promotor plasmídeo no sistema Gateway (Invitrogen) pode ser usado. Esta abordagem permite a inserção de qualquer gene de interesse a jusante do promotor por 4 a clonagem recombinational. Geralmente, 2-5 kb de sequências a montante é suficiente para ter expressão correta e precisa. </li><li> O cDNA do gene de interesse pode ser clonado de duas maneiras: <ol><li> Clonagem convencional, usando enzimas de restrição. </li><li> Para clonagem Gateway, que é amplificado PCR usando primers que contêm o Gateway att seqüência B recombinational. O cDNA amplificado é primeiro recombinados no pDONR201 vetor doador para criar o vetor de entrada e depois transformado em E. coli DH5a tensão. Após a selecção de recombinantes de sucesso e mini-prep isolamento de DNA, o vetor de entrada é recombinados no vetor destino promotor contendo para criar a expressão plasmídeo. Detalhes sobre a clonagem recombinational estão disponíveis a partir de qualquer manual de gateway da Invitrogen ou em Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marcador selecionável Plasmid Exemplos de plasmídeos marcador transgênicos incluem rol-6 ou o uso do promotor de parede muscular do corpo unc-54 para dirigir a expressão da proteína fluorescente. Estes plasmídeos marcador normalmente estão disponíveis dentro da comunidade de pesquisa, mediante solicitação. Microinjeção de C. elegans Preparação <ol><li> Realizar o isolamento do DNA dos dois plasmídeos que estão a ser injetado. Quantificar-los e misturar na proporção de 1:1 de 50 ng / mL cada. </li><li> Prepare almofadas agar: <ol><li> Faça uma solução de 2% agarose em água, calor ou microondas até dissolver. </li><li> Estabelecidos vários 22 x 50 mm na tampa óculos de uma bancada. </li><li> Com uma pipeta Pasteur, colocar uma gota do agarose derretida em uma tampa de vidro e coloque imediatamente uma tampa de vidro, o segundo sobre a queda em um ângulo de 90 com o primeiro. Repita o procedimento para vários copos cobrir outro. O diâmetro do disco achatado de agarose deve ser entre 15-20 mm. </li><li> Após a agarose solidificou (este só tem momentos), retire a tampa de vidro e permitir que a almofada de ar para secar completamente (várias horas durante a noite). </li><li> Armazenar os blocos em uma caixa de vidro da tampa à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Faça carregadores de agulha para a solução de DNA: Carregadores de agulha são criados a partir de 100 l tubos capilares que são aquecidas no meio sobre uma flama aberta e rapidamente puxado para cerca de duas vezes o seu comprimento. As duas metades são agarrados à parte uma vez que o tubo capilar esfria. Estoque 10-20 carregadores agulha para a injecção. Guardar na posição vertical em um rack tubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não empalar-se nos pontos. </li><li> Faça agulhas microinjeção: A agulha é feita a partir de um tubo especial capilar que contém um filamento de vidro interno; este filamento serve como um pavio para a solução de DNA. Essas são puxados em uma máquina de agulha extrator. Nós usamos um Narishige PP-830 com uma configuração extrator de calor de 24,8. Agulhas diversas são puxados em um momento e são armazenadas em uma pequena caixa de plástico. Várias agulhas podem ser facilmente &quot;montado&quot; em uma tira de massa de modelar para armazenamento de longo prazo. </li><li> Ponta da agulha &quot;breakers&quot;: A ponta da agulha microinjeção é puxado tão fina que é realmente fechado para ele final e deve ser quebrado usando cacos de vidro pequena tampa. Estes são preparados por um embrulho 18 x 18 mm de tampa de vidro um papel toalha e gentilmente aplicando pressão até que quebre em vários pedaços. Fragmentos de um tamanho útil é de aproximadamente 3 x 4 mm. </li><li> Crescer tipo selvagem (N2) worms para a fase adulta cedo para injeção usando procedimentos padrão 6. Prepare corretamente cerca de 100 encenou worms / construir injetado. </li></ol> Procedimento <ol><li> Abra a válvula principal em um tanque de hélio que está conectado a um braço e agulha microinjeção titular. Fechar a válvula reguladora para permitir que o gás entrar na linha, trazendo a pressão para 35 psi. Observe que o gás pode ser liberado através de um pedal. </li><li> Inserir uma agulha em um carregador de tubos padrão boca pipeta (encontrado em embalagens de tubos capilares de vidro) e elaborar uma pequena quantidade da mistura de plasmídeo (~ mL 1). </li><li> O carregador de agulha é cuidadosamente colocada na extremidade traseira de uma agulha de injeção e gentilmente inserido todo o caminho até o comprimento dea agulha até sentir resistência. Expulsar a solução de DNA por soprando suavemente, em seguida, retire o carregador. </li><li> Inserir a agulha no braço microinjeção, tendo o cuidado de colocá-lo dentro da junta de borracha pequena interna. </li><li> Coloque um pedaço de agulha quebra de vidro da tampa sobre uma extremidade de um bloco de ágar. Cobrir o shard, bem como toda a superfície do pad agar, com o petróleo halocarbonos. Coloque o bloco de ágar no palco de um microscópio invertido. </li><li> Posição da agulha no centro do campo de visão usando o objetivo de 4X e iluminação de campo claro, mas ainda não diminuí-lo para o óleo. Além disso, a posição da borda interna do caco de vidro no centro da capa, então o foco sobre ele (ainda usando objetivo 4X). Abaixe a agulha no petróleo, trazendo-o no mesmo plano focal como o caco de vidro da tampa. Elevar a ampliação mudar para a objetiva de 40X. Recentrar na borda do fragmento e reposicionar a ponta da agulha, se necessário. </li><li> Para abrir a ponta da agulha de injeção, cutucar gentilmente a agulha contra a borda da tampa de vidro caco, enquanto ao mesmo tempo, a aplicação de um pulso curto de gás através do pedal. A agulha vai ser suficientemente arrombado quando pequenas gotas de líquido escapar da ponta da agulha. Fluxo de líquido em excesso, devido à abertura de uma muito grande não é desejável, uma vez que irá matar os animais. </li><li> Remover o bloco de ágar do palco, levantando a agulha para cima, mas não altere a X ou eixo Y posição. Deslize o estágio de baixo da agulha, retire o bloco de ágar e colocá-lo em um microscópio de dissecação. Transferência de um worm para o bloco, abaixo da superfície do óleo. Se o verme se contorce, gentilmente acariciá-lo até que o bloco de contatos agar. O worm úmido devem aderir ao agarose seca. </li><li> Injeção <ol><li> Colocar rapidamente as costas pad agar para o palco, centrando o worm no campo de visão. </li><li> Abaixe a agulha no mesmo plano de foco como o worm. </li><li> Mudar os filtros para Hoffman Iluminação (um tipo de filtro de contraste). Isso permite que os detalhes morfológicos do verme para se tornar visível. Se Nomarski / DIC óptica estão disponíveis no âmbito invertido que vai funcionar tão bem. Usando a objetiva de 40X, o foco no centro de &quot;granulado&quot; sincicial da gônada worm, abaixo do padrão de &quot;favo de mel&quot; dos núcleos germinativas (escolher qualquer das gônadas é posicionado no lado do worm enfrentar a agulha). </li><li> Afinar a posição da agulha até que a ponta também está em foco (o mesmo plano que o &quot;grão&quot; gônadas). </li><li> Insira cuidadosamente a agulha no centro da gônada e aplicar um breve pulso de pressão de gás para expulsar uma gota ou duas de DNA no braço gonadal. Você deve observar uma onda de propagação de líquido através da gônada distal. Não assuma mais líquido é melhor, desde muito líquido pode fluir para dentro da curva proximal do braço gônadas, o que pode encerrar a produção de oócitos. Se possível, dependendo da posição do worm, injetar o braço gônadas outros da mesma maneira. </li><li> É importante trabalhar rapidamente, enquanto a injeção de um worm, pois ele pode facilmente desidratar. A decisão de injetar o braço gônadas segunda é dependente de como rapidamente você pode re-posicionar a agulha e worm. Todo o processo devem, idealmente, ter menos de 1-2 minutos. </li></ol></li><li> Remova a tampa de vidro do palco e colocá-lo em um escopo de dissecação. Aplicar 1μl de tampão M9 (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, NaCl 85mm, 1mM MgSO 4) diretamente sobre o worm injetado (isso implicaria submergindo a ponta da pipeta abaixo da superfície do óleo halocarbonos). O buffer deve hidratar o worm, que então flutuam na superfície pad agarose. Transferir o worm para um prato regular usando uma picareta worm. A almofada de agarose podem ser reutilizados várias vezes mais até que ela se tornou muito saturado com tampão e os vermes já não aderir. </li></ol> Seleção de transgênicos <ol><li> Worms injetada, a P 0 geração, são transferidos para nova individuais, placas de bactérias semeadas (60 mm) e permissão para reproduzir. Normalmente, os animais injetados são incubados a 20 ° C por 2-3 dias até que os filhotes aparecem. </li><li> A F 1 filhos são observados para a evidência do marcador de transgênicos (como fluorescência) usando um estereomicroscópio fluorescente. Cada operadora, fluorescente F 1, animal clonado é separado em um prato novo (já que a prole de cada F 1 são considerados uma linha distinta). A F 1 hermafroditas têm permissão para se reproduzir. Novamente, isso é normalmente realizada em menos 20 ° C por 2-3 dias até que os filhotes aparecem. </li><li> A geração F 2 é observado para os animais transgênicos também. F 2 animais que herdaram e expressar a matriz transgênicos são considerados uma linha de &quot;estável&quot;. NOTA: No 1 º Fidade pode haver muitos animais transgênicos, mas eles não são estáveis. A maioria dos animais transgênicos F 1 não serão propagadas em F 2 linhas estável. NOTA: Para controlar a variabilidade no número de cópias do gene, gerar um mínimo de três linhas independentes estável por construir injetado. </li><li> Cada linha independente e estável deve ser mantida como uma linha separada de vermes. Cada linha pode ser propagada através da transferência de vários animais transgênicos para um prato novo a cada geração, o que deve ser realizada em um estereomicroscópio fluorescentes se o marcador selecionável é fluorescente. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar-se de: - Injectar directamente no centro da gônada - Não injetar muito líquido - Trabalhar com rapidez para evitar dessecação. Se você tiver problemas com a agulha, tal como ela é quebrada muito grande, o melhor é remake de uma agulha fresco, ao invés de tentar injetar com menos de agulha ideal. A geração de worms transgênico tem muitas aplicações, tais como: - Identificação de genes mutantes, no método chamado de resgate de transf...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

Elegans Caenorhabditis transgênicos podem ser facilmente criados através de microinjeção de uma solução de DNA plasmidial para o 1 gonadal. O DNA plasmidial se reorganizam para formar concatamers extracromossómicos que são herdados de maneira estável, embora não com a mesma eficiência como cromossomos reais 2. Um gene de interesse é co-injetado com um marcador fenotípico óbvio, como rol-6 ou GFP, para permitir a seleção de animais transgênicos sob um microscópio de dissecação. O gene exógeno pode ser expressa de seu promotor nativo para estudos de localização celular. Alternativamente, o transgene pode ser conduzido por um promotor diferentes tecidos específicos para avaliar o papel do produto do gene em que determinada célula ou tecido. Esta técnica eficiente drives expressão do gene em todos os tecidos de C. elegans, exceto para o embrião ou início de linha germinal 3. Criação de animais transgênicos é amplamente utilizado para uma série de paradigmas experimentais. Este vídeo demonstra o processo de microinjeção para gerar vermes transgênicos. Além disso, a seleção e manutenção de transgênicos estável C. elegans é descrita linhas.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection at JoVE.com

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Este vídeo demonstra a técnica de microinjeção no gônadas de C. elegans para criar animais transgênicos.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

52.7K visualizações.  University of Alabama. Este vídeo demonstra a técnica de microinjeção no gônadas de C. elegans para criar animais transgênicos.

Vídeo: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Geração de Transgênicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinjeção de embriões

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Methods Article

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção