Agradecemos Ciências da Vida e da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Queen para financiar este trabalho. Assim, agradecemos o laboratório Chin-Sang para fornecer os reagentes necessários, equipamentos e suporte técnico. Agradecemos também QGEM 2011, especialmente Tony Ele, por sua contribuição para a discussão.

1. Preparação / lavar os Worms <ol><li> Sincronizar vermes adultos jovens 11. </li><li> Pipetar 2 ml da Basal S em uma placa de 5 cm de Chemotaxis encenado vermes que só limpou o gramado do OP50 E. coli. Incline a placa conforme necessário para garantir que os vermes são lavados da superfície da placa para o buffer. </li><li> Pipete 1 mL de solução de Basal verme-S para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar durante 10 segundos usando um PicoFuge em 6600 rpm. </li><li> Aspirar o Basal S, deixando a pelota de vermes não perturbadas. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de S basal ao tubo de microcentrífuga, invertido várias vezes para lavar os vermes. </li><li> Repita os passos 1.4 a 1.6 mais três vezes. </li><li> Centrifugue durante 10 segundos a quinta vez, desta vez aspirando o sobrenadante para um volume final de ca. 100 ul. </li><li> Pipeta 2 ul dos vermes numa placa NGM para garantir que há entre 50 e 250 vermes em cada amostra de 2 ul. Ajustara concentração de vermes no basal S conforme necessário por ressuspensão dos vermes em um volume maior ou menor de S basal. </li><li> Usar os vermes no ensaio imediatamente após a lavagem dos vermes para até 1 hora. </li></ol> 2. Preparar as placas de teste <ol><li> Marcando o lado de baixo de uma placa de 5 cm, dividir o prato em quatro quadrantes iguais. Pode ser utilizado ou ágar Quimiotaxia NGM. Um mínimo de três ensaios são necessários por estirpe genética a ser testado. </li><li> Marque um círculo com um raio de 0,5 centímetros em torno da origem (figura 1). </li><li> Marcar um ponto em cada quadrante com qualquer um &quot;T&quot; para &quot;Test&quot; ou &quot;C&quot; para &quot;Control&quot;, garantindo que os sites estão equidistantes da origem e outro. Os pontos devem ser pelo menos 2 cm de distância da origem. Marcar o canto superior esquerdo e inferior direito quadrantes como quadrantes teste e no canto superior direito e inferior esquerdo quadrantes como controles (Figura 1). </li></ol> 3. A execução do ensaio </p&gt; <ol><li> Misturar a solução de ensaio através da combinação de volumes iguais de o composto de teste e 0,5 M azida (um anestésico usado para prender os vermes ao atingir um quadrante). Misturar a solução de controlo, combinando o solvente utilizado para diluir o composto de teste, com 0,5 M de azida. </li><li> Pipeta 2 ul da solução de verme (preparado em 1.8) a partir da pelota para a origem (onde as duas linhas se cruzam). </li><li> Imediatamente depois, pipeta 2 mL da solução de ensaio para os dois locais de &quot;T&quot;. Da mesma forma, pipetar a mesma quantidade da solução de controlo para os dois locais de &quot;C&quot;. </li><li> Uma vez que os vermes e odorante gotas foram absorvidas no agar, substituir as tampas e inverter as placas. </li><li> Após 60 min, coloque os vermes numa incubadora de 4 ° C. Apenas remover uma placa da incubadora, quando pode ser contado. Partindo vermes, à temperatura ambiente, pode permitir a mobilização de novo. </li><li> Anote o número de vermes em cada quadrante que cruzou completamente a circ interiorle. </li><li> Repita os passos 3.2 a 3.6, utilizando a solução de controlo em ambos os quadrantes de ensaio e de controlo. Isto servirá como a placa de controlo. Três dessas placas devem ser feitas e correr para servir como um controle adequado. </li></ol> 4. Interpretando os Scores / determinação do índice de quimiotaxia <ol><li> Calcular o índice de quimiotaxia usando a Equação 1. Isso vai render um índice quimiotático entre -1,0 e 1,0. </li></ol> (1) Quimiotaxia Index = (# Worms em ambos os quadrantes do teste - # Worms em ambos os quadrantes Controle) / (N º total de gols Worms) Uma pontuação de 1,0 indica atracção máxima em direcção ao alvo e representa 100% dos vermes que chegam nos quadrantes contendo o alvo química. Um índice de -1,0 evidência de repulsão máxima. Métodos de ensaio semelhantes foram já empregues 3 (Tabela 1). <ol start="2"><li> Indicar a média Chemotaxis Index (CI) e erro padrão da média (SEM). Realizar o t-teste de Student comparando os dados a partir das placas de ensaio e de controlo. </li></ol>

<ol>
	<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li><li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+preference+in+C.+elegans.">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+chemotaxis+responses:+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans.">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis.">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (1895).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Quimiotaxia, embora controladas por um conjunto complexo de mecanismos neuronais e celulares, pode ser facilmente e objectivamente quantificada usando ensaios de quimiotaxia. Para obter os melhores resultados a partir dos ensaios, devem ser tomadas determinadas etapas críticas. Em primeiro lugar, encenando os vermes é essencial para dar resultados experimentais consistentes. Worms em diferentes fases da vida se comportam de forma diferente 13; vermes estágio tão misturada pode distorcer os resultados expe...

Ward desenvolvido pela primeira vez o ensaio de quimiotaxia em 1973 5, e desde então tem tido aplicações de longo alcance. Neurobiology é um campo que beneficiou de utilizar uma variedade de ensaios de quimiotaxia. Adaptação olfativo, uma simples forma de aprendizagem e memória, foi demonstrada em C. elegans usando ensaios de quimiotaxia 6. Eles também têm sido usados ​​para mostrar que a C. elegans pode desenvolver-etanol tolerância resultado demonstra que não só a plasticidade comportamental dos vermes, mas que também mostra que os vermes podem ser muito útil no estudo da dependência do álcool em humanos 3. Os ensaios têm mesmo sido desenvolvidos para demonstrar a capacidade de C. elegans para armazenar curto e memória de longo prazo, mostrando que as associações são feitas pelos vermes entre chemoattractants e Alimentação (OP50) 7. Além disso, dada a extensa informação actualmente disponível sobre o C. elegans do genoma, o chemotaxiO comportamento de C. elegans foi alterada várias vezes através da indução de mutações de 1,8. Isto permite muitas possibilidades interessantes de engenharia, tais como o desenvolvimento de C. elegans como uma ferramenta de biorremediação. Assim, uma vez que o desenvolvimento inicial do ensaio de quimiotaxia, em 1973, tem sido frequentemente alterado e utilizado para elucidar mistérios numa variedade de áreas. Alguns ensaios teve como objetivo descobrir a rota específica tomada pelos vermes em direção a um alvo. O ensaio protótipo deste tipo foi desenvolvido por Ala 5. Três vermes foram colocados em agar derretido, durante 15 min. Os seus movimentos foram rastreados pelo cunho eles deixados como explorada a partir da periferia da placa superior de um gradiente de um atraente no centro da placa. Todos os vermes na placa foram presos utilizando clorofórmio no final de cada ensaio. Um descendente deste método de um único sem-fim colocado no meio da placa com o atractivo e a um controlet distâncias iguais e opostas a partir da origem 2. Pierce-Shimomura et al. desenvolvido um ensaio para observar a natureza exacta do movimento envolvidos na quimiotaxia 9. Vermes individuais foram colocados em placas de Petri de 9 centímetros, quer contendo uma concentração uniforme do atraidor ou um gradiente de forma radial, que culminou com a fonte do atraidor. Um programa de computador que reconhece o worm foi usado para registrar o comportamento observado. Uma câmara de vídeo acoplada a um microscópio trabalhadas em conjunto com a fase de ajustar a placa de Petri automaticamente como o ensaio correu para assegurar o verme permaneceu no campo de visão. A partir daí, a informação mais detalhada foi descoberto em relação à causa de pirueta indicadas por C. elegans. Outros ensaios, mais semelhantes ao descrito aqui, testou a resposta de uma grande população de vermes para compostos de teste. Dois quadrantes ensaios de quimiotaxia foramutilizada para explorar as funções que vários receptores, neurónios, e as moléculas de transdução de sinal quando reproduzido C. elegans foi exposto a vários compostos 1. Entre 20-50 vermes lavados foram colocados perto do centro da placa com um atraente e um controle nas extremidades polares, juntamente com o anestésico, azida de sódio (NaN3). Após 60 min, um índice quimiotáctico com valores a partir de -1,0 a +1,0 foi gerado com base na diferença entre o número de vermes foram afixadas no atractivo ou o controlo. Um índice quimiotáctico semelhante foi usada no ensaio relatado neste artigo, embora o ensaio anterior falhou para avaliar rigorosamente vermes não-móveis. Este ensaio foi posteriormente aplicada a testar os efeitos de ablação neuronal em quimiotaxia. Outra variação do ensaio acima mencionado foi realizada 100-200 vermes onde foram colocados no centro de uma placa contendo quatro quadrantes 3. Quadrantes adjacentes ou o teste, ou contidocontrolar a substância. Tal como nos ensaios anteriores, os vermes foram imobilizadas por acção de azida de sódio, antes de serem marcados. Um método semelhante é descrito aqui como uma forma de avaliar a resposta de C. elegans para vários compostos. No entanto, o método abaixo tem a vantagem de apenas avaliar vermes que passaram uma distância limite que separa móvel de vermes imóveis. Outros ensaios incorporaram diretrizes semelhantes para ignorar vermes imóveis. Frøkjær-Jensen et ai. desenvolvido um ensaio versátil que pode ser usado para testar os compostos solúveis tanto voláteis e água 10. A placa de Petri foi dividida em quatro quadrantes. Os quadrantes superior e inferior não contêm solventes. O quadrante esquerdo continha água, eo direito continha o atrativo. Ao testar odorantes voláteis, o analito foi colocado sobre a tampa da cápsula, ao longo do quadrante correcto, enquanto que os compostos solúveis em água, foram colocadas directamente no agar. Os métodos actualmente existentes para avaliar a resposta quimiotáctica de C. elegans estão constantemente a ser refinado para optimizar a sua facilidade de uso, a eficiência e precisão. Assim, enquanto que o ensaio aqui descrito tem a capacidade de avaliar um maior número de vermes (máximo rendimento:. Vermes 250 / hora por placa, um pouco maior do que a taxa de transferência demonstrada por Lee et al, 3), a força real deste método é o sucinta culminar de muitos dos atributos dos ensaios anteriores (Tabela 1).

<table><tbody><tr><td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter.] Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Microscopes</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Sodium Azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol/Distilled Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans chemotaxis assay

Muitos organismos usam a quimiotaxia para buscar fontes de alimentos, evitar substâncias nocivas, e encontrar companheiros. Caenorhabditis elegans tem comportamento quimiotaxia impressionante. A premissa subjacente testar a resposta dos vermes a um odorante é colocá-los em uma área e observar o movimento evocada em resposta a um odorante. Mesmo com os diversos ensaios disponíveis, optimizando verme localização inicial em relação a ambas as áreas de teste e de controlo, enquanto minimiza a interacção de vermes com o outro, mantendo ao mesmo tempo uma amostra significativa, continua a ser um trabalho em progresso 1-10. O método descrito aqui pretende abordar estas questões através da modificação do ensaio desenvolvido por Bargmann et al. 1. A placa de Petri é dividido em quatro quadrantes, dois quadrantes opostos marcados &quot;teste&quot; e dois são designados como &quot;Controle&quot;. Anestésico é colocado em todos os testes e os locais de controlo. Os vermes são colocados no centro da placa com uma circle marcados em torno da origem para assegurar que os vermes não-móveis serão ignorados. Utilizando um sistema de quatro quadrantes, em vez de um ou 2 dois elimina uma polarização no movimento dos vermes, como eles são equidistantes a partir de amostras de ensaio e de controlo, independentemente de que lado da origem começaram. Isso contorna o problema de vermes sendo forçados a viajar através de um conjunto de outros vermes para responder a um odorante, o que pode atrasar vermes ou forçá-los a tomar um caminho mais tortuoso, produzindo uma interpretação errada do seu caminho pretendido. Este método também apresenta vantagens práticas por ter um tamanho de amostra maior e permitindo que o pesquisador para executar o ensaio autônoma e marcar os vermes uma vez que o tempo estipulado expirou.

Comparando-se o tipo selvagem (N2) C. elegans para o ODR-10 (KY10) mutante. Usamos diacetil, um conhecido C. elegans quimioatractor, para comparar os vermes de tipo selvagem para o de um mutante que carece do receptor para diacetil 1,12. Por tipo selvagem (N2), o índice quimiotáctico vermes era de 0,100 ± 0,066 para o etanol, e 0,839 ± 0,031-0,5% de diacetil. Como esperado, diacetil provoca uma resposta significativa quimioatratante de vermes d...

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C. elegans Chemotaxis Assay

Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; É descrito. Um índice quimiotáctico (Cl) foi utilizada como uma forma de avaliar precisamente a resposta de minhocas, para determinados objectivos, e servir como uma plataforma de comparação entre estirpes e os compostos de interesse.

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Research

JoVE Journal

Biology

45.6K visualizações.  Queen's University. Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica de Caenorhabditis elegans É descrito. Um índice quimiotáctico (Cl) foi utilizada como uma forma de avaliar precisamente a resposta de minhocas, para determinados objectivos, e servir como uma plataforma de comparação entre estirpes e os compostos de interesse.

Vídeo: C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Neurociência

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Bioengenharia

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

<meta charset="utf8"></head><body>Extração e quantificação de respostas voláteis de feromônios sexuais em C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: examinando a influência volátil do feromônio sexual no comportamento masculino de C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

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Biologia

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Aprendizagem associativa aversiva e formação de memória emparelhando dois produtos químicos em Caenorhabditis elegans

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This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C. elegans Ensaio de sobrevivência: um teste de toxicidade de curto prazo

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

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