Este trabalho foi financiado pelo Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. LAM foi apoiada pela sinalização e regulação celular do Instituto Nacional de Saúde treinamento de subvenção (T32 GM008759) eo NIH Ruth L. Kirschstein Fellow Pré-Doutorado (CA165349-01). Gostaríamos de agradecer ao Prof Michael Stowell (CU Boulder), Prof Douglas Rees e Prof Rob Phillips (Caltech) para os seus valiosos comentários.

1. Preparação de lipossomas <ol><li> Recuperar a 20 mL frasco de vidro com tampa de teflon. </li><li> Limpar todo o material de vidro e seringas com clorofórmio antes de usar para evitar a contaminação. </li><li> Transferir 100 uL de clorofórmio grau de reagente para o frasco de vidro usando uma seringa de vidro de 250 uL estanque ao ar. </li><li> Adicionar 30 ul de metanol de grau reagente para o frasco de vidro mesmo usando uma seringa de vidro de 100 uL estanque ao ar. </li><li> Para preparar um 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatidilcolina (POPC): fosfatidiletanolamina (POPE): solução lipídica colesterol, transferir 216 uL de 10 mg / POPC mL, 42 uL de 10 uL mg / mL POPE e 20, de 11 mg / mL As soluções de colesterol em CHCI3 para o frasco de vidro de 20 ml. </li><li> Evapora-se os solventes orgânicos, utilizando-lento fluxo de árgon ou de azoto gasoso até uma película fina de lípidos é observado no fundo do frasco. </li><li> Colocar o frasco de vidro não nivelada num exsicador de vácuo durante pelo menos 30 minutos para remover o solvente residual. </li><li> Transfer 2 mL de tampão, previamente passados ​​através de um filtro de 0,2 micron, para o frasco de vidro para hidratar os lípidos. </li><li> Incubar a mistura a 4 ° C durante a noite e utilizar dentro de 48 horas. </li></ol> 2. Congelar e descongelar-: Para tamanhos de lipossomas 30 - 100 nm Apenas <ol><li> Congelar suspensão de lipossomas em azoto líquido durante 15 segundos. </li><li> Descongelar suspensão de lipossomas utilizando um bloco de aquecimento a 42 ° C de temperatura para ~ 3 minutos. </li><li> Repetir os passos 2.1 e 2.2 para um total de 5 ciclos. </li></ol> 3. Extrusão Siga as instruções corretamente Avestin para montar a extrusora LF-50 Liposofast, usando o contorno instrumento em seu livro-guia. <ol><li> Colocar o suporte de tela grande furo (com furos circulares) na base de suporte do filtro, seguido pelo prato circular sinterizado (sem buracos), um disco de drenagem (25 mm de diâmetro), e uma membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro). </li><li> Coloque o pequeno, pretoO-ring no topo da membrana para fixá-lo para a base de suporte do filtro. </li><li> Fixe a extrusora superior filtro apertando 4 parafusos nos 4 furos correspondentes. </li><li> Montar a unidade de filtro para o extrusor por baixo do tambor da extrusora grande. Adicionar a solução de lipossomas para o tambor do cilindro. Coloque o seguinte no topo do barril de extrusão na ordem: circular grande O-ring, tampão estreito, circular grande O-ring, tampão circular. </li><li> Fixe o regulador de gás ao topo barril da extrusora e fechar todas as válvulas para evitar fugas de ar, incluindo a válvula de alívio de pressão. Coloque um frasco de vidro de 20 mL ou 50 mL Erlenmeyer sob a unidade de filtro extrusora. Uma válvula de segurança está ligado ao regulador e irá libertar se a pressão excede 600 psi. Ligue o gás de azoto e abrir a válvula de gás ligada à extrusora. </li><li> Aumente a pressão de nitrogênio a 25 psi para 400 nm lipossomas, 125 psi para 100 nm, lipossomas e psi 400-500 para 30 nm lipossomas. </li><li> Assista ao susp lipossomasension como se ejecta para dentro do recipiente enquanto está a ser empurrado pelo azoto. Mantenha o fluxo de nitrogênio até deixar de observar qualquer líquido que passa através do filtro de extrusora para dentro do frasco de vidro. </li></ol> 4. Dinâmica de espalhamento de luz Analysis (DLS) <ol><li> Preparar 50 uL de uma solução 20 mM de lipossomas. </li><li> Ligue o fonte de alimentação e da fonte de luz. </li><li> Abra o software DynaPro. </li><li> Defina o software para o modelo de algoritmo MS / X para detectar lipossomas de 30 nm e 100 nm e MS800 modelo algoritmo para detectar&gt; 100 nm lipossomas. </li><li> Conecte-se ao hardware. </li><li> Pipete 14 da amostra de lipossomas na cuvete de quartzo e de inserção no suporte de célula. </li><li> Pressione o botão start. </li><li> Pressione parar após ~ 20 - 30 aquisições. </li><li> Analisar os picos médios de diâmetro de lipossomas gravados no histograma. </li></ol> 5. Análise de nanopartículas Tracking (NTA) <ol><li> Prepara-se uma uL 500, 0,1 mM de lipossomassolução. </li><li> Lavar o compartimento da amostra com água e etanol. </li><li> Seque o compartimento de amostra com uma toalha de papel que não solte fiapos. </li><li> Ligar a fonte de energia laser e do computador. </li><li> Entregar 300 uL de solução 0,1 mM de lipossomas para o compartimento da amostra. </li><li> Abra o controle da temperatura e da nanopartícula software Análise Tracking. </li><li> Pressione Capturar botão para ligar o laser. </li><li> Use os ajustamentos horizontais e verticais para mover o estágio e ajustar a focagem do microscópio. </li><li> Ajustar a temperatura desejada (20 ° C) e tempo de gravação (pelo menos 30 segundos). </li><li> Pressione o botão Record para tirar várias molduras das partículas de lipossomas para um período de tempo especificado. Analisar os picos correspondentes aos diâmetros de lipossomas no histograma em que controla o movimento de cada partícula. </li></ol> 6. Os resultados representativos Um esquema que define o método de extrusão é pressentia na Figura 1. Para obter resultados óptimos, a preparação de lipossomas com diâmetros de 30 nm requer uma elevada pressão de ~ 500 psi e diâmetros de 100 nm requer uma pressão de 125 psi para alcançar uma taxa rápida de filtro. Para diâmetros de 400 nm, uma baixa pressão de 25 psi ~ é recomendado para alcançar uma taxa mais lenta de filtro, que permite que as vesículas para alongar e formar lipossomas maiores, homogéneos. Realizamos uma série de experimentos para determinar a pressão ideal para a produção consistentes tamanhos micro-sub vesícula. Nós variou a pressão, bem como o número de extrusão passa através de filtros de policarbonato com poros de dimensão 30, 100, e 400 nm e descobriu pressão adequada para cada tamanho desejado. Por 30 poros nm, a pressão abaixo de 500 psi irá reduzir a taxa de fluxo, causando alongamento e tamanhos de vesículas, assim, de maiores dimensões. Para 100 nm poros, um fluxo constante foi realizada em 125 psi. Para 400 nm poros, de baixa pressão (25 psi) permite que as vesículas para alongar em maior vesícula sizes. Um fluxo de filtração lenta gota a gota, é ideal para criar maior sub-micron vesículas 13. Realizou-DLS para determinar os tamanhos de lipossomas extrudida através de três tamanhos de diâmetros diferentes, ou seja, 30, 100 e 400 nm. DLS é um método estabelecido que recolhe a luz dispersa para determinar o diâmetro da partícula. Nós, os extrudados lipossomas hidratados de 2 mm através de uma membrana de policarbonato 30 nm a 500 psi com 5 passa através do poro do filtro; uma membrana de policarbonato de 100 nm a 125 psi com 5 passa através do poro do filtro e uma membrana de policarbonato de 400 nm a 25 psi com 2 passa através do poro do filtro. Os diâmetros dos lipossomas e medidos por DLS para 30, 100 e 400 nm tamanhos de poros foram de 66 ± 28, 138 ± 18 e 360 ± 25 nm (Figura 2). Uma suspensão de 50 pérolas de poliestireno nm foi utilizado como um padrão de calibração, como mostrado na Figura 2, onde se registado um diâmetro de 47 ± 16 nm. O polydispe por centorsity mostra que não há sobreposição dentro de tamanhos de lipossomas. É típico de observar diâmetros superiores a 30 nm quando se utiliza DLS análise devido ao viés conhecido este instrumento tem para partículas maiores de 12. Intensidades de dispersão da luz de partículas grandes e pequenas são recolhidos simultaneamente a partir de um método de detecção e, portanto, mais difícil de resolver os lipossomas em suspensão 12. Apesar desta limitação instrumental, a curva de calibração descreve uma correlação quase linear. NTA é uma nova tecnologia que mede o tamanho de cada partícula a partir de observações directas de difusão em um meio líquido, independente do índice de refracção das partículas ou densidade. Esta técnica de alta resolução pode ser usado para completar a medição de lipossomas com DLS. A NTA registada diâmetros de 95 ± 48 e 356 ± 51 nm, duas 100 nm e 400 nm soluções de poliestireno foram utilizados para a calibração. Soluções lipídicas de 30 nm e 100 nm foram observados ter uma mais comp<html> diâmetro arável em relação aos DLS como mostrado na Figura 3, produzindo tamanhos médios de 29 ± 14, 95 ± 17 e 359 ± 73 nm. A NTA pode ser uma técnica de caracterização mais geral para quantificar as partículas microscópicas, desde a sua sensibilidade lhe permite medir as partículas de 50 - 1000 nm. A curva de calibração mostra uma correlação linear entre os poros da membrana de policarbonato, versus o diâmetro NTA gravada. <table border="1"><tbody><tr><td> Tamanhos lipossomas </td><td> Limiar de detecção </td><td> Tamanho da Partícula esperado mínima (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Parâmetros NanoSight. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Gráfico de fluxo do método de extrusão, que descreve como a pressão eo fluxo de azoto controla a homogeneidade de diferentes diâmetros de lipossomas. Após a hidratação lipossoma, vesículas unilamelares de diferentes tamanhos são extrudidas através de diferentes policarbonato poros da membrana de filtro em diferentes pressões. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Figura 2. Dinâmicos espalhamento de luz (DLS) dados que descrevem os tamanhos de lipossomas quantitativos seguintes extrusão. (A) Os gráficos de barras são mostrados para descrever os diâmetros das três amostras de lipossomas. Um padrão de calibração de 50 nm de poliestireno (PS) pérolas foi utilizado como uma referência. Os diâmetros médios de lipossomas são indicados acima da barra para cada amostra. O eixo x descreve os tamanhos dos poros dos quais as soluções foram extrudida através de. O eixo y descreve o diâmetro gravado por DLS. Embora os 30 nm e 100 nm de registo tamanhosed valores superiores do que os seus tamanhos de poros, enquanto o tamanho maior nm 400 gravado um tamanho ligeiramente menor, a curva de calibração (b) mostra uma correlação quase linear, em que o eixo x expressa os tamanhos dos poros da membrana de policarbonato, eo eixo y descreve o gravado diâmetro lipossoma por DLS. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Figura 3. Nanopartículas de Rastreamento de Análise (NTA) dados que descrevem os tamanhos de lipossomas após a extrusão. (A) Os gráficos de barras representam o diâmetro de cada amostra de lipossoma. O eixo x descreve os tamanhos dos poros dos quais as soluções foram extrudida através de. O eixo y descreve o diâmetro de tamanho gravado pelo NTA. Os diâmetros médios de lipossomas são rotulados por cima de cada amostra. (B) A curva de calibração NTA mostra uma correlação mais linear do que a curva de calibração DLS entre os tamanhos dos poros da membrana de filtro versus o diâmetro gravada. O eixo x descreve os tamanhos dos poros da membrana de policarbonato. O eixo y descreve o diâmetro gravada lipossoma por NTA. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Figura 4. Negativas mancha de transmissão de electrões de microscopia (TEM) mostrando imagens cada tamanho de lipossoma (500 uM), seguido por extrusão. Grelhas de carbono Formvar malha foram negativamente descarregada antes da coloração da amostra, onde acetato de uranilo 1% em água foi utilizado para corar as amostras antes da secagem e de imagem em 34.000 ampliação ×. Tamanhos 30, 100, e 400 nm são claramente distintas umas das outras. A ampliação foi definida a 25.000 ×. A barra de escala representa 0,5 micron. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Figura 5. Uma experiência de tempo-curso foi realizado com três tamanhos de lipossomas. Dispersão dinâmica de luz (DLS) foi medido para cada solução de lipossoma de extrusão imediatamente a seguir. Todas as soluções de lipossomas foram armazenados em 4 °C durante a noite. Seus diâmetros foram registados pelos DLS após uma incubação durante a noite. Pouca ou nenhuma alteração foi observada após um período de incubação de 16 horas.

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	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando o Avestin Liposofast Extrusor LF-50, foi demonstrado como pequeno porte, lipossomas sintéticos são preparados através de um sistema de pressão controlada. É importante notar que as vesículas multilamelares formam-se espontaneamente após a hidratação de lipossomas, que pode levar à produção de nanopartículas menores. Estas pequenas vesículas multilamelares inevitavelmente fluir através do maior tamanho dos poros da membrana de policarbonato, causando heterogeneidade em soluções de vesículas unila...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> Os estabilizadores 95% </td></tr><tr><td> Metanol de grau elevado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179.337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Extrusora LF-50 Liposofast </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipídios </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Os poros de policarbonato </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td> 25 mm de diâmetro </td></tr><tr><td> Escorra discos PE </td><td> Avestin, Inc. </td><td> 230600 </td><td> 25 mm de diâmetro </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Os lipossomas são vesículas preparadas artificialmente constituídos por fosfolípidos naturais e sintéticos que são amplamente utilizados como uma membrana celular imitando plataforma para estudar proteína-proteína e proteína-lípido interacções 3, o monitor de entrega de drogas 4,5, e de encapsulamento 4. Fosfolípidos naturalmente criar bicamadas lipídicas curvos, distinguindo-se a partir de uma micela. 6 Os lipossomas são tradicionalmente classificados por tamanho e número de bicamadas, ou seja, grandes vesículas unilamelares (LUV), pequenas vesículas unilamelares (SUVs) e vesículas multilamelares (MLV) 7. Em particular, a preparação de lipossomas homogéneos de vários tamanhos é importante para o estudo de curvatura da membrana que desempenha um papel vital na sinalização celular, endo e exocitose, a fusão da membrana, e tráfico proteína 8. Vários grupos analisar como as proteínas são usadas para modular processos que envolvem a curvatura da membrana e, assim, preparar lipossomas de diâmetros &lt;100 - 400nm para estudar seu comportamento em funções celulares 3. Outros concentram-se em lipossoma-droga de encapsulação, estudando os lipossomas como veículos para transportar e distribuir uma droga de interesse 9. Encapsulação do fármaco pode ser conseguida como relatado durante a formação do lipossoma 9. O nosso passo de extrusão não deve afectar o fármaco encapsulado por duas razões, ou seja, o encapsulamento da droga (1) deve ser alcançado antes de este passo e (2) lipossomas devem manter a sua estabilidade natural biofísica, de forma segura realização da droga no núcleo aquoso. Estes objetivos da pesquisa sugerem ainda a necessidade de um método otimizado para projetar estáveis ​​vesículas mícron sub-lipídicos. No entanto, as actuais tecnologias de preparação de lipossomas (sonicação 10, congelamento-descongelamento e-10, sedimentação) não permitem a preparação de lipossomas com a superfície altamente curvo (isto é, &lt;diâmetro de 100 nm) com elevada consistência e eficácia 10,5, o que limita a biofísica estudos de um EMERGIcampo ng de detecção de curvatura da membrana. Aqui, nós apresentamos um método de preparação sólida para uma variedade de lipossomas biologicamente relevantes. Extrusão manual, utilizando gás-apertados seringas e membranas de policarbonato 10,5 é uma prática comum, mas heterogeneidade é frequentemente observado quando se utiliza tamanhos de poro inferior a 100 nm devido à devido à variabilidade de pressão manual aplicada. Foram utilizados um aparelho de extrusão de pressão constante controlada para preparar lipossomas sintéticos cujos diâmetros variam entre 30 e 400 nm. Dispersão dinâmica de luz (DLS) 10, 11 e microscopia de electrões análise de nanopartículas de seguimento (NTA) 12 foram utilizados para quantificar os tamanhos de lipossomas, tal como descrito no nosso protocolo, com poliestireno comercial (PS) pérolas utilizadas como um padrão de calibração. Uma correlação linear perto foi observada entre os tamanhos dos poros e trabalhadores dos lipossomas determinados experimentalmente, indicando alta fidelidade da nossa preparação pressão controlada lipossoma conhecihod. Além disso, mostrámos que este método de preparação de vesículas de lípidos é geralmente aplicável, independente de vários tamanhos de lipossomas. Por fim, também têm demonstrado em um estudo curso de tempo que estes lipossomas preparados foram estáveis ​​durante até 16 horas. Um representante de tamanho nano protocolo de preparação de lipossomas é demonstrado abaixo.

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Este protocolo descreve um método de extrusão para a preparação de vesículas lipídicas de sub-micron tamanhos com um elevado grau de homogeneidade. Este método utiliza um sistema de pressão controlada, com taxas de azoto controlados de fluxo para a preparação de lipossomas. A preparação de lípidos<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Extrusão de lipossomas, e caracterização do tamanho será aqui contidas.

Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K visualizações.  University of Colorado Boulder. Este protocolo descreve um método de extrusão para a preparação de vesículas lipídicas de sub-micron tamanhos com um elevado grau de homogeneidade. Este método utiliza um sistema de pressão controlada, com taxas de azoto controlados de fluxo para a preparação de lipossomas. A preparação de lípidos 1,2, Extrusão de lipossomas, e caracterização do tamanho será aqui contidas.

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengenharia

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication pelo Solvent-assistida Lipid bicamada (SALB) Método

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

Extrusão de filme de<em&gt; Abyssinica Crambe</em&gt; / Glúten de trigo Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...