Este trabalho foi financiado pela Max Planck Society, o alemão Cancer Research Center, da Universidade de Tübingen, eo Bundesministerium für Bildung und Forschung (conceder nenhum. 0.312.040). Agradecemos Eduard Hermann por nos ajudar a automatizar a análise dos dados curva de força e Dr. Jakob Suckale para a leitura cuidadosa deste manuscrito.

1. Preparação de Bicamadas Lipídicas suportados (SLB) 11,12,21 <ol><li> Preparação de mistura de lípidos e de Vesículas multilamelares Suspensões <ol><li> Preparar os seguintes tampões de antemão. <ol><li> Preparar tampão PBS a concentrações de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM de KH 2 PO 4, 8 mM de Na 2 HPO 4, e 137 mM de NaCl, pH 7,2. </li><li> Prepare SLB (suportado bicamada lipídica) em concentrações de tampão de 150 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, pH 7,4. </li><li> Prepara-se uma solução de 1 M de CaCl2. </li></ol></li><li> Dissolve-se os seguintes lípidos em clorofórmio a uma concentração desejada: por exemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / mL e colesterol (Chol) a 10 mg / ml. </li><li> Aqui 18,38 ul de DOPC, 17,10 mL de SM e 11,30 mL de Chol para fazer uma solução com 1 mg de lipidos totais na proporção de 2: 2: 1 de DOPC: razão molar Chol: SM. Variar os volumes em conformidade com base no concentrations dos lipídios preparadas em 1.1.2. No entanto, manter a proporção molar de 2: 2: 1 de DOPC: SM: Chol, como alterar a relação molar irá alterar as características de fase da membrana 25. </li><li> Misture a solução completamente por agitação em vórtex. Adicionar um corante fluorescente lipídica a 0,05% molar, se alguém deseja visualizar a bicamada por um microscópio de fluorescência. Nota: A família de dialkylcarbocyanines de cadeia longa, como o fez, DII e DiO abrangem uma ampla gama de comprimentos de onda e pode ser preferencialmente utilizadas para etiquetar membranas lipídicas. Alternativamente, lípidos marcados com fluorescência, assim como a rodamina-fosfatidiletanolamina ou BODIPY-colesterol pode ser utilizado. Em qualquer caso, a concentração do corante deve ser optimizado de acordo com a configuração de microscopia, mantendo em mente que as altas concentrações do fluoróforo ligado ao lípido pode alterar o comportamento de lípido 19. </li><li> Seque o clorofórmio utilizando gás N2 (ou qualquer gás inerte disponíveis, tais como Ar e He). </li><li> Além disso seco tele lípido mistura sob vácuo durante pelo menos 1 h. Nota: Se armazenar esta mistura de lípidos, purgar o ar com o gás inerte (N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C. Alíquota excesso de lípidos-em-clorofórmio em pequenos frascos castanhos. Secá-las de uma maneira semelhante como a mistura de lípidos, deslocar o ar com o gás inerte (N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C. </li><li> Dissolve-se os lípidos secos em tampão PBS até uma concentração de 10 mg / ml. </li><li> Vortex-se a mistura vigorosamente durante cerca de 20 segundos a 1 min para obter uma suspensão turva, contendo vesículas multilamelares. Certifique-se de que não há a filmes lipídicos adira às paredes do frasco. </li><li> Distribuir esta suspensão em alíquotas de 10 ul (1 mg de lípido torna alíquotas de 10). </li><li> Armazenar a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Preparação de Vesículas Unilamelares Nota: Os vários tamanhos de vesículas unilamelares podem ser preparadas utilizando o método de sonicação ou o método de extrusão. Sonication usa sound energia para agitar a mistura e separar as camadas da suspensão multilamelar. Isto é indicado por limpar da suspensão turva. Extrusão obriga as vesículas multilamelares de passar através de um filtro de membrana com um tamanho de poro definido. <ol><li> Método de sonicação <ol><li> Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB. </li><li> Transferir a mistura em pequenos (2 ml) frascos de vidro tapados e selar com Parafilm. </li><li> Sonicar a mistura à temperatura ambiente num banho de ultra-sons durante 10 min ou até se tornar clara, para se obter pequenas vesículas unilamelares (SUVs, abaixo de 50 nm de diâmetro). </li></ol></li><li> Método de extrusão <ol><li> Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB. </li><li> Transferir a suspensão para um tubo criogénico. </li><li> Congelar a suspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico por alguns segundos em azoto líquido. </li><li> Descongele osuspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico num banho de água à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante alguns minutos. Repetir os passos de congelamento e descongelamento, pelo menos, 10 vezes. </li><li> A fim de extrusão da suspensão de lípido, utilizar uma membrana de policarbonato com 200 nm de tamanho de poro (outros tamanhos dos poros estão disponíveis como, 100 nm ou 400 nm) e um dispositivo de extrusão comercial 26. Nota: Actualmente, existem dois dispositivos de extrusão comercialmente disponíveis: um extrusor manual está disponível para pequenos volumes (200 uL para alguns mL). Neste caso, a amostra é submetida a extrusão através da membrana, empurrando manualmente a suspensão e para trás entre duas seringas. Dependendo do fabricante, alíquotas de lípidos teriam de ser combinadas para atingir o volume mínimo do conjunto acima. Para volumes maiores (até 50 ml) dispositivos mais sofisticados são utilizados em que a suspensão é forçada através da membrana de policarbonato utilizando gás comprimido. Condições de set-up e extrusão pode mudar de acordo com o model. Consulte as instruções do fabricante antes de usar. Este protocolo refere-se ao extrusor manual para pequenos volumes. </li><li> Equilibrar a extrusora em água por passagem da água através da extrusora. Imergir a membrana na água. </li><li> Colocar a membrana entre os dois pistões, montar o dispositivo e equilibrar em tampão, fazendo passar o tampão através da extrusora, a partir de uma seringa para a outra. Este passo permite adicionalmente ensaios de leakiness do sistema. Se ele vazamentos, desmontar e remontar-lo novamente alterando a membrana. </li><li> Tome a suspensão lipídica usando uma seringa da extrusora (&quot;lado sujo &#39;). </li><li> Introduzir a seringa que contém a suspensão de lípido em uma câmara e a seringa vazia na câmara oposta. </li><li> Empurre a seringa em uma extremidade. Filtrar a solução através da membrana e para dentro da seringa oposta. Este é o passo 1 r. </li><li> Passá-lo através da membrana para um total de 31 vezes taisque a solução acaba na seringa adversária (&#39;lado limpo&#39;). Nota: Verifique a membrana após a extrusão. Se ele foi quebrado, então o processo de extrusão não foi bem sucedida e necessita de ser repetida. </li><li> Esvaziar a seringa num pequeno tubo. As grandes vesículas unilamelares (LUV) são estáveis ​​durante 1-2 dias se mantida a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de Mica e Lamelas <ol><li> Lavar lamelas primeiro em água e depois em etanol. Ar seco. </li><li> Tome discos de mica e descolar a camada exterior usando fita adesiva. </li><li> Coloque o disco de mica sobre a lamela. Colas ópticas transparentes são ideais para que se possa verificar as camadas duplas com um microscópio de fluorescência. </li><li> Anexar cilindros de plástico (2,5 cm de diâmetro externo, diâmetro interno 2 cm, e 0,5 cm de altura), utilizando óptica cola / graxa. Certifique-se de que tudo está selado e que não há fugas. Use graxa quando querendo voltar a utilizar os cilindros como eles podem ser facilmente retirado do the lamela e lavados. As dimensões dos cilindros de plástico depender do tamanho do suporte do braço de suporte de AFM e devem ser ajustados em conformidade. </li></ol></li><li> Deposição de Unilamelares vesículas em suporte sólido <ol><li> Pipetar toda a solução de lipossomas directamente sobre a mica. Adicionar mais tampão SLB para chegar a um volume de 300 ml. </li><li> Adicionar 0,9 ml de solução 1 M de cloreto de cálcio para alcançar uma concentração final de 3 mM de Ca 2+. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 2 minutos e depois a 65 ° C durante pelo menos 10 min. Sempre cobrir as bicamadas com tampão. O contato com as bolhas de ar e ar irá destruí-lo. Durante a incubação, adicionar mais tampão, se necessário, especialmente se a incubação a temperaturas mais elevadas. Nota: As temperaturas de incubação variam de acordo com as misturas de lípidos e as fases necessárias. É necessário um período de incubação de pelo menos 10 minutos para formar bicamadas suportados, mas pode ser mais longo, dependendo da temperatura e composição. </li><li> Lavagema bicamada com quente (65 ° C) Tampão de SLB 15-20 vezes para remover o cálcio e vesículas não fundidas. Tome cuidado extra durante as etapas de lavagem para manter a bicamada sob tampão e pipeta suavemente a solução de lavagem para evitar a destruição da camada dupla. </li><li> Bilayers legal suportados à temperatura ambiente antes medições AFM. Isto é necessário para formar as diferentes fases da membrana, bem como minimizar o desvio térmico no instrumento. </li></ol></li></ol> 2. Microscopia de Força Atômica Medidas 11,12 <ol><li> Imagem Nota: Execute projeção de imagem atômica no modo de contato ou o modo de tocar. Imagem suportado bilayers em solução; Não deixe que a solução para evaporar completamente, pois isso irá destruir as camadas duplas. Como era de se estar trabalhando com tampão, observe as precauções de segurança para garantir que qualquer parte AFM está protegido contra derramamento de líquidos. <ol><li> Selecione um cantilever macio (abaixo de 0,2 N / m constante da mola é aconselhável) e montá-lo para tele AFM. A escolha da rigidez cantilever é mais crítico para a espectroscopia de força (e isso será discutido mais tarde). </li><li> Monte a amostra no palco AFM e certifique-se que todos os módulos vibração de isolamento estão ligados. Aguarde pelo menos 15 minutos para equilibrar e reduzir a dispersão térmica do sistema. Dependendo da AFM set-up, especificações de ajuste e de imagem podem variar. Consulte o manual do fabricante. </li><li> Aproxime-se da amostra com a ponta do AFM até que o contato. </li><li> Desde bicamadas lipídicas são geralmente 4 nm de altura, utilize o Z-gama do instrumento que lhe dará a mais alta resolução z (por exemplo, 1,5 mm). </li><li> Selecione uma região para a imagem. Para obter uma visão geral da bicamada lipídica, uma 50 mm x 50 mm ou 25 mm x 25 mm região será um bom ponto de partida para a imagem. Se aparecer pequenos recursos, imagem uma lata em áreas menores (10 mm x 10 mm, ou 2 mm x 2 mm). A escolha de uma área de imagem depende também da r trabalhandoange do scanner piezoeléctrico. Por favor, consultar o manual do instrumento para isso. </li><li> Como camadas duplas são muito frágeis, ajustar o ponto da ponta do AFM conjunto durante a imagem para manter a força no mínimo e corrigir deriva térmica, mantendo contato com a amostra. No modo de contato, minimizar o set point. No modo de tocar, maximizar o set point. </li><li> Processar imagens por encaixando cada linha de digitalização para funções polinomiais de nivelamento. Executa a remoção linha para verificações que perdem contato com a membrana usando o software proprietário da empresa de fabricação de AFM. </li></ol></li><li> Força Spectroscopy <ol><li> Calibrar o cantilever seguindo as instruções de acordo com o protocolo do fabricante. A calibragem permite a conversão do sinal eléctrico dos fotodiodos de força (Figura 1B). <ol><li> Calibrar a sensibilidade da ponta para medir a deflexão de movimento piezo-z (em unidades de comprimento) em vez do sinal eléctrico em volts. <br /&gt; Nota: AFM detecta mudanças na deformação do cantilever usando um laser reflectida na parte traseira do braço de suporte. O laser atinge um fotodíodo que pode detectar a posição espacial do ponto de laser. Uma mudança na deflexão do braço de suporte, uma vez que se dobra quando em contacto com a amostra é detectada por este fotodíodo como &quot;de deflexão vertical&quot;, e isto é nas unidades de tensão. Uma vez que o braço de suporte é movido pelo piezo-z, a deflexão vertical está relacionado com o movimento na z-piezo. A relação entre a deflexão vertical e z movimento é chamado de sensibilidade e converte a tensão de distância. </li><li> Calcula-se a constante de mola cantilever usando o método de frequência de ruído térmico, geralmente incorporados no software AFM. Neste método, traçar a amplitude de vibração de ruído em relação à frequência de oscilação, a criação de uma trama densidade espectral de potência. Este gráfico irá mostrar um pico em torno da freqüência de ressonância. A freqüência em que o i amplitudeé a maior é a freqüência de ressonância. Ajustar uma função Lorentzian em torno do pico para calcular automaticamente a constante de mola pelo software. Alguns recursos úteis para a teoria do método de ruído térmico são dadas nas referências 27-30. </li></ol></li><li> Depois de imagiologia uma área da bicamada, seleccionar uma região x 5 mm 5 mm na bicamada para realizar espectroscopia de força. </li><li> Configure o AFM para que ele leva curvas de força em uma grade de que a região de 16 x 16. Isso resulta em 256 curvas força por região. O espaço entre dois pontos vizinhos deve ser suficiente para evitar que a área de membrana sendo sondado por um ponto coincidiria com o próximo ponto. Isto é dependente do raio da ponta. Uma distância de 100 nm entre dois pontos seria ideal. Divide x 5 uM a região 5 um de 16 x 16 em grade. Dependendo do tamanho da fase, pode-se seleccionar uma região mais pequena ou maior, e, em seguida, ajustar o tamanho da grelha em conformidade. </li><li> Definir deslocamento z piezo-a400 nm. Isso determina o alcance máximo do movimento do z-piezo. Ele deve ser suficientemente grande para garantir que o braço de suporte está totalmente retraída a partir da amostra entre as medições. </li><li> Definir velocidade de aproximação de 800 nm / seg e retrair a velocidade para 200 nm / seg. Utilize uma velocidade de aproximação entre 400 a 6000 nm / seg dependendo da composição da bicamada lipídica e da fase a ser estudado 6,16. </li><li> Depois de configurar todos os parâmetros, adquirir curvas força, pressionando o botão &quot;run&quot; do software AFM. </li><li> Salvar curvas de força como força vs. curvas de altura (uma medida do movimento z-piezo). Isso não leva em conta a curvatura do cantilever quando em contacto com a amostra. Durante a etapa de processamento de dados, o software permite a correção da AFM para cantilever dobrar para obter força vs. curvas de separação ponta-amostra (Figura 1C), o que dará valores adequados para a espessura da camada dupla. Os valores de correcção são geralmente incorporados na calibradoção, que são guardadas com cada curva de força. Calcular separação ponta-amostra subtraindo a deflexão vertical do movimento piezo a um determinado ponto. Nota: O pico na curva da força de aproximação (o valor da força vai para baixo, mesmo se o movimento cantilever ainda está no ciclo de abordagem) é a força de ruptura da membrana, enquanto que a diferença entre a posição do pico e a posição do ponto em que a força começa a levantar-se de novo fornece a espessura da membrana. </li><li> Adquirir, pelo menos, 500 curvas de força para cada condição para obter boas estatísticas. Traçar um histograma dos valores usando programas como origem ou MatLab, e se encaixam os histogramas para uma distribuição de Gauss para obter o pico e largura da distribuição. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

SLBS compostos de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram formadas em mica após adsorção vesícula e ruptura induzida por cloreto de cálcio. Esta composição de lípido separado em L e L o d fases. A fase L o é enriquecida em esf ingomielina e colesterol e é menos fluido / mais viscoso (Figura 1A) do que a fase L d 11. A separação de fase a partir de L o G d manifesta como estruturas circulares elevados acima da circundante (Figur...

Microscopia de força atómica (AFM) gera uma imagem de uma superfície de varrimento através de uma área da amostra, utilizando um braço de suporte com uma ponta muito afiada 1. O movimento do braço de suporte investiga a topologia de superfície da amostra. AFM tem sido amplamente aplicado para moléculas biológicas - incluindo proteínas, DNA e membranas, devido à sua versatilidade na análise de amostras fixadas no ar ou estado quase nativo em líquido 2-5. Para além da sua capacidade de imagiologia de alta resolução em escala nanométrica, o cantilever AFM actua como uma mola para sondar forças de interacção (adesão e repulsão) e as propriedades mecânicas da amostra 5,6. Isto é conhecido como espectroscopia de força. Neste modo, a sonda se aproxima primeiro da amostra e exerce uma força sobre ele, em seguida, é retraído até que perde o contacto com a amostra (Figura 1A). As curvas geradas mostram força em função da distância do braço de suporte, tanto para a aplicaçãobarata e retração. Várias propriedades, incluindo o módulo de elasticidade para medir a rigidez de um material, e as forças de adesão pode ser derivada. Bicamadas lipídicas suportados são membranas biológicas modelo que encontram-se no topo de um suporte sólido - geralmente mica, vidro de borosilicato, de sílica fundida, ou oxidado silício 7. Elas são preparadas utilizando várias técnicas, como a deposição de vesículas, método Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. Imagiologia AFM foi utilizado para seguir a formação destas camadas duplas suportados 10, e sondar diferentes estruturas formadas por membranas de diferentes composições 11-15. Execução de espectroscopia vigor em apoiadas resultados bicamadas em um pico na curva de abordagem. Este pico indica a força necessária para perfurar a camada dupla, e é chamada força de avanço. A espessura da bicamada pode também ser medido usando a curva de força 6. A força típica avanço de bilayersintervalo entre 1-50 nN 6. Estas propriedades dependem embalagem lípido (fase líquida ou gel) e da estrutura (comprimento da cadeia acilo e grau de insaturação) e alterado pelos agentes activos de membrana 16. A teoria por trás da ruptura foi explicada 17 e outros parâmetros experimentais, tais como maciez cantilever, raio de ponta e velocidade de aproximação também afetam a força de avanço 15,16,18. Espectroscopia de força foi usado para analisar as propriedades de diferentes fases lipídicas 11,19, dependente da composição alterações 12,20, bem como os efeitos de outras biomoléculas, tais como péptidos, sobre a estabilidade da membrana 21. A orientação plana de bicamadas suportados é vantajoso para a combinação de AFM com outros métodos tais como ressonância 22 e microscopia de fluorescência de plasma de superfície 11,19 para caracterizar melhor a estrutura e as propriedades das membranas. Este proto vídeo detalhadacol destina-se a preparar bicamadas lipídicas suportados usando deposição de vesículas e analisá-los com a AFM e espectroscopia de força. Enquanto vesículas de diferentes tamanhos podem ser utilizados para preparar bicamadas, este protocolo concentra-se em pequenos e grandes vesículas unilamelares. Bilayers suportados que separam em fase líquida ordenou (L o) e (L d) fases líquidas desordenados foram caracterizados 11,15. A membrana é composta de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM), e colesterol (Chol) a 2: 2: 1. Esta composição modelos as jangadas lipídicas, que são propostas para se comportar como plataformas importantes para o tráfico de proteína e de triagem, sinalização celular e outros processos celulares 23,24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>700000P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), 88%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), &#62;99%</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 24x60 mm, 1mm thickness</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>2355036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica blocks</td>
			<td>NSC Mica Exports Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&#160; Always handle mica with gloves or tweezers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch and Die Set</td>
			<td>Precision Brand Products, Inc</td>
			<td>40105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA 88</td>
			<td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Equipment Grease</td>
			<td>Borer Chemie AG</td>
			<td>Glisseal N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome Extruder</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>LiposoFast-Basic</td>
			<td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Bandelin Sonorex Digitec</td>
			<td>DT-31</td>
			<td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Nitride AFM Cantilever&#160;</td>
			<td>Bruker AFM Probes</td>
			<td>DNP-10</td>
			<td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>JPK</td>
			<td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Bicamadas lipídicas constituídas suportados de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram fotografadas em AFM (Figura 2 CA). Devido à composição de lípido, foram observados SM / Chol-rico e L o DOPC-ricas fases G d. O perfil de altura a partir da imagem AFM pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da membrana. Ao olhar para o perfil de altura, a espessura da bicamada pode ser medido na presença de defeitos na membrana (Figura 2B), ou a diferença de alt...

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.5K visualizações.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Vídeo: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Bioengenharia

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...