A construção de membranas lipídicas de bicamadas descritas neste protocolo pode ser usada para obter informações cruciais sobre interações de membranas com agentes farmacêuticos, toxicantes ambientais e até mesmo compostos biológicos. Essas técnicas podem ser usadas para fabricar membranas de complexidade líquida variada, e para avaliar a permeabilidade composta, absorção e incorporação dentro de membranas. Para começar, adicione o volume apropriado de solução de caldo lipíduo em uma vile de vidro limpo para obter uma concentração vesícula final de 2,5 miligramas por mililitro após a reidratação.
Remova o clorofórmio da solução lipídica, usando um fluxo de gás nitrogênio. Para garantir a remoção completa do clorofórmio, conecte o filme lipíduo seco ao vácuo por pelo menos quatro horas. Reidratar o filme lipídico seco com um volume necessário de tampão de cloreto de sódio Tris para produzir a concentração final de vesícula de 2,5 miligramas por mililitro, e vórtice por aproximadamente 15 a 30 segundos.
Transfira a suspensão da vesícula para um recipiente com gelo seco até congelar por aproximadamente 30 minutos. Depois que a amostra estiver completamente congelada, descongele a suspensão em um banho de água de 30 a 40 graus Celsius. Vórtice a suspensão vesícula descongelada.
Para fazer um mililitro ou menos de vesículas, obtenha uma mini extrusora. Pré-molhar um suporte de filtro com água ultra pura e, em seguida, coloque-o sobre a superfície de suporte da membrana dentro do anel O. Repita para o segundo suporte interno da membrana.
Posicione um suporte interno de membrana na carcaça externa extrusora. Coloque uma membrana de policarbonato de 100 nanômetros sobre o suporte interno da membrana diretamente sobre o suporte do filtro. Posicione o segundo suporte interno de membrana na carcaça externa extrusora com o anel O e o lado de suporte do filtro voltado para a membrana de policarbonato.
Coloque o politetrafluoroetileno no nó do retentor e enrosque-o com a carcaça externa da extrusora. Corte a extrusora no bloco de aquecimento. Coloque a suspensão da vesícula lipídica em uma das seringas e posicione a seringa no bloco de calor extrusor, inserindo a agulha totalmente em uma extremidade da extrusora.
Insira a segunda seringa vazia no lado oposto e bloqueie ambas as seringas usando os grampos de braço no bloco de calor. Empurre lentamente a suspensão vesícula para a seringa vazia e depois volte para a seringa original. Repita mais 20 vezes para um total de 21 passagens através da membrana de policarbonato.
Transfira as vesículas lipídicas para um vidro limpo vil para armazenamento. Para extruir de cinco a 50 mililitros de vesículas, monte a grande extrusora colocando o suporte de tela de furo grande, disco centralado, discos de drenagem e membrana de policarbonato no espaço no suporte inferior extrusor. Conecte os suportes superiores e inferiores da extrusora usando os quatro parafusos e aperte.
Coloque a unidade de extrusão no cilindro de amostra esfregando-a na parte inferior e apertando com uma chave inglesa para fixar. Encha o cilindro de amostra com água ultrauso e extrude a água através da unidade de extrusora antes de adicionar a amostra ao cilindro de amostra. Adicione a suspensão da vesícula lipídica no cilindro de amostra e enrosque a parte superior fechada.
Aumente lentamente a pressão até que a amostra comece a escorrer da unidade de extrusora a uma taxa de aproximadamente duas a três gotas por segundo em uma vile de vidro limpo. Uma vez que toda a amostra tenha sido extrudada, desligue a fonte de nitrogênio e solte a pressão no cilindro de amostra abrindo a válvula de alívio de pressão lentamente. Despeje as vesículas lipídicas de volta no cilindro de amostra e repita o passo anterior mais nove vezes para um total de 10 extrusões.
Carregue a suspensão da vesícula em cuvette apropriada e insira no instrumento de dispersão de luz dinâmica, insira os detalhes da amostra e realize a medição usando o software associado. Coloque a célula zeta na câmara de amostra, garantindo que os eletrodos estejam em contato e feche a tampa do suporte da amostra. No software associado, insira os detalhes da amostra e colete medições.
Insira o sensor de cristal de quartzo codificado por sílica no módulo de fluxo, garantindo que a forma T no cristal se alinhe com a forma T no módulo e enrosque o módulo de fluxo fechado. Em instrumentos com múltiplas câmaras, bicamadas adicionais podem ser formadas em paralelo. Conecte a entrada e a tubulação de saída ao módulo de fluxo e à bomba.
Coloque a tubulação nos protetores de retenção e feche a tampa do sistema de analisador. Coloque um recipiente de lixo na saída da bomba para coletar soluções gastas. Para realizar a limpeza, ligue primeiro a bomba e defina a velocidade de fluxo para 400 microliters por minuto.
Insira a tubulação de entrada em água ultra pura e flua de 5 a 10 mililitros através do módulo. Mude a tubulação para SDS e flua de 5 a 10 mililitros através do módulo. Mude a tubulação de volta para água ultra pura e flua de 10 a 20 mililitros através do módulo.
Finalmente, flua ar através do módulo até que nenhuma solução restante seja coletada. Remova o sensor do módulo de fluxo e enxágue o sensor com água ultra pura. Dirija o sensor e o módulo de fluxo com um fluxo de gás nitrogênio, certificando-se de que o eletrodo permanece sempre livre de qualquer líquido.
Em uma capa de fumaça química, insira o sensor de cristal revestido de sílica em um instrumento de limpeza ultravioleta ou ozônio. Ligue o instrumento e deixe o tratamento por pelo menos dois minutos. Remova os sensores cuidadosamente e devolva-os para o módulo de fluxo.
Ligue o instrumento analisador para conectar o software associado e defina a temperatura ao valor desejado para formar o bicamadorão lipídeco de suporte. Deixe a temperatura estabilizar para a entrada desejada. Configure a medição e encontre todas as frequências de ressonância do sensor e dissipação para sobretons três, cinco, sete, nove, 11 e 13 antes de iniciar a medição.
Permita que o cloreto de sódio Tris flua através do módulo por cinco a 10 minutos, garantindo que a frequência de base mude ou Delta F e mude de dissipação ou valores Delta D em líquido permaneçam estáveis. Pare a bomba, remova a tubulação de entrada da solução de cloreto de sódio Tris e insira-a cuidadosamente na solução de vesícula lipídica. Backflow por cinco segundos para remover quaisquer bolhas de ar da tubulação de entrada e, em seguida, continuar o fluxo para a frente.
Reinicie a medição no software para zerar a linha de base. Fluxo de vesículas lipídicas até que a formação de bicamadas seja observada em tempo real no software de aquisição de dados. Em seguida, repita esta etapa para alterar a tubulação de entrada de vesículas lipídicas de volta para o tampão de cloreto de sódio Tris.
Adicione cinco microliters da solução lipídica ao compartimento do doador, que é uma placa de filtro polivinida de polivinida porosa 96 bem multi-tela com tamanho de poros de 0,45 micrometro. Submerse imediatamente a placa do filtro no compartimento do receptor, que é uma placa receptora de transporte contendo 300 microliters de soro fisco tamponado fosfato. Adicione 200 microliters de soro fisiológico tamponado de fosfato ao compartimento do doador de transporte.
Siga os passos anteriores de parar a bomba e alterar a tubulação de entrada para solução de vesícula lipídica e observar a formação de bicamadas, em seguida, altere a tubulação de entrada para a solução de peptídeo alfa helicoidal ou AH. Introduza a solução no módulo de fluxo até que a mudança de frequência e a mudança de dissipação sejam observadas a partir da nova adição da solução. Pare a bomba e deixe o peptídeo AH incubar com as vesículas por 10 minutos.
Mude a tubulação de entrada em cloreto de sódio Tris, e inicie o fluxo para remover o peptídeo AH das vesículas rompidas, levando à formação bem sucedida de um bicamado lipídico. Primeiro, flua o solvente da molécula, depois, troque a tubulação de entrada para a solução contendo a molécula de interesse e fluxo por pelo menos cinco minutos. Se desejar, pare o fluxo e deixe que o líquido que contenha a molécula desejada incubar com a bicamadas.
Mude a tubulação de entrada de volta para o solvente de molécula sozinho. Flua por pelo menos cinco minutos, depois troque a tubulação de entrada em cloreto de sódio Tris e flua por pelo menos cinco minutos. No software, pare a medição, salve o arquivo e pare a bomba.
Imediatamente seguindo as etapas anteriores para uma bicamada suspensa uni-lipídica ou para uma bicamada suspensa multi-lipídica, remova o PBS do compartimento da placa do filtro do doador e substitua por 200 microlitradores da solução de teste. Submerse imediatamente em uma nova placa receptora de transporte com 300 microliters de PBS. Após a incubação com balanço suave por duas horas a 25 graus Celsius, recolham 150 microliters da solução dos compartimentos doador e aceitador.
Meça a concentração da molécula em ambas as amostras usando um método apropriado baseado nas propriedades desta molécula. Tamanho, polidispersidade e potencial zeta de vesículas de PC de ovo uni-lipídida, e duas composições de vesículas multifídidas foram comparadas. A distribuição de tamanho das vesículas do PC do ovo e vesículas multi lipídicas eram quase idênticas.
Tanto o ovo quanto o PC multi-lipídas foram carregados negativamente, enquanto duas vesículas multi-lipídicas foram carregadas positivamente. As vesículas do PC do ovo uni-lipídida foram prontamente absorvidas à superfície, como mostra a diminuição da mudança de frequência, e aumento da mudança de dissipação, seguida de ruptura espontânea. Vesículas multi-lipídicas absorvidas à superfície, mas requerem a adição de peptídeo AH para romper as vesículas, resultando em formação de bicamadas lipídicas.
Com bicamadas lipídicas suportadas, a mudança de frequência e a mudança de dissipação podem ser analisadas antes e depois da introdução de um composto de juros. Por exemplo, foram investigadas interações de DEHP e toxicante ambiental com uni apoiada e multicamadas por camadas. Níveis semelhantes de absorção de DEHP foram observados para ambos os tipos de bicamadas lipídicas.
No entanto, foram observadas diferenças na mudança de dissipação entre as bicamadas com uma maior mudança de dissipação observada para a bicamada de PC de ovo em comparação com a multi-lipídica uma bicamada. Pouca permeação foi observada tanto para bicamadas uni-e-lipídicas. Após este procedimento, uma variedade de bicamadas lipídicas de imitação de células pode ser desenvolvida para permitir a triagem livre de células de interações moleculares com compostos que vão de fármacos a tóxicos ambientais.
