Este sistema de bicamada lipídica suportado por nanobar pode ser usado para estudar o papel da curvatura da membrana na regulação da dinâmica e distribuição de proteínas e lipídios durante as atividades celulares. Esta técnica oferece alta sub-raiz e ruim na geração de curvatura da membrana, formando uma bicamada lipídica contínua em erros de nanobar patente com curvatura de membrana predefinida por nanofabricação de alta resolução. Para começar, coloque o nano chip em um copo de 10 mililitros com o lado do padrão voltado para cima.
Adicione cuidadosamente um mililitro de ácido sulfúrico a 98% ao copo e certifique-se de que o ácido cubra totalmente a parte frontal e traseira do chip. Gire lentamente o copo e adicione 200 microlitros de peróxido de hidrogênio a 30% gota a gota até que todo o copo fique quente. Certifique-se de que o ácido sulfúrico e o peróxido de hidrogênio estejam bem misturados para formar a solução de piranha para a remoção de moléculas orgânicas do nanochip.
Coloque o copo em um recipiente de vidro secundário e mantenha o nano chip imerso na solução de piranha durante a noite para limpar bem as impurezas. Retire o copo e pipete cuidadosamente a solução de piranha para um recipiente de resíduos ácidos. Carregue cinco mililitros de água deionizada no copo para diluir o ácido residual e descartá-lo nos resíduos ácidos.
Repita esta etapa cinco vezes. Pegue o chip com uma pinça e lave com um fluxo contínuo de água deionizada para remover completamente o ácido residual. Seque o cavaco com gás nitrogênio a 99,9% para formação de SLB.
Sonicate a mistura lipídica por 30 minutos. Congele a mistura lipídica em nitrogênio líquido por 20 segundos e depois descongele a 42 graus Celsius por dois minutos em banho-maria. Repita os ciclos de congelamento/descongelamento 30 vezes.
Depois disso, a mistura lipídica parece um líquido claro. Passe a mistura lipídica através da mini extrusora e extrudir para frente e para trás 20 vezes. Recolha os SUVs da seringa do outro lado para reduzir a contaminação com partículas maiores ou material estranho e transfira-os para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Retire cuidadosamente o nanochip limpo da água deionizada com um par de pinças e seque com gás nitrogênio a 99,9%. Realize a limpeza da superfície do nanochip com tratamento a plasma de ar por uma hora. Monte o nano chip em uma câmara PDMS.
Comece colocando o chip em uma superfície limpa com o padrão voltado para cima. Cubra suavemente o PDMS médio com o chip e certifique-se de que todo o padrão esteja exposto à área central da grande abertura oval no PDMS médio. Cubra o PDMS superior com o PDMS médio e mantenha seus dois pequenos orifícios dentro da região do grande orifício oval do PDMS médio.
Em seguida, a câmara PDMS é montada. Carregue os SUVs no canal PDMS a partir de um dos dois pequenos orifícios no PDMS superior com uma pipeta e incube por 15 minutos à temperatura ambiente para formar o SLB. Pipete suavemente o tampão PBS para o canal PDMS de um lado do pequeno orifício e remova os resíduos com um cotonete do outro orifício para lavar os SUVs não ligados.
Em seguida, adquira o SLB formado no nano chip. Configure a microscopia confocal de varredura a laser usando uma objetiva de óleo de 100 x. Abra o software Zen para selecionar a potência do laser de excitação que pode excitar a fluorescência do lipídio e da proteína.
Escolha Modo de aquisição. Em seguida, clique em Smart Setup, seguido por Texas Red. Ajuste o foco com o botão de foco para localizar as nano barras no chip até que as bordas da nanobarra estejam afiadas sob o canal lipídico.
Defina os parâmetros de varredura para obter uma imagem de controle do canal lipídico antes de adicionar proteína. Realizar o ensaio FRAP por branqueamento com bicamada lipídica marcada fluorescente em uma única área de nanobar aleatória. Marque as caixas de seleção Regiões do experimento e branqueamento.
Desenhe uma área circular de cinco micrômetros de diâmetro, que pode incluir toda a nanobarra no centro, e adicione às regiões do experimento. Parâmetros de imagem TimeLapse de entrada. Escolha Série temporal.
Em seguida, clique em Duração. Selecione 100 ciclos e intervalo igual a dois segundos. Parâmetros de branqueamento de entrada.
Marque as caixas de seleção a laser que executam o FRAP e altere a energia para 100%Clique em Iniciar Experimento para o experimento FRAP. Carregar a solução proteica no canal PDMS e incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente para permitir a ligação da proteína no SLB. Reoriente as nanobarras e defina os parâmetros de varredura para tirar imagens de canais lipídicos e proteicos para detecção de detecção de curvatura de proteínas.
Selecione Regiões do Experimento e conduza o ensaio FRAP em ambos os canais lipídicos e proteicos, e realize imagens TimeLapse para caracterizar a mobilidade da proteína de detecção de curvatura. Ambos mostram maior acúmulo na extremidade de nanobarras individuais revestidas de SLB com 300 nanômetros de largura. Aqui o SLB contém 10%PS para melhorar eletrostaticamente a ligação às proteínas.
Ambas as proteínas têm uma maior relação extremo-centro do que os lipídios, que é em torno de um. Ao comparar o IDR FBP17 e o F-Bar, a maior relação extremo-centro do IDR FBP17 indica uma detecção de curvatura mais forte do que a F-Bar. Todas as três proteínas apresentaram acúmulo preferencial nos sítios de membrana curva da extremidade da nanobarra quando a curvatura diminuiu abaixo de 400 nanômetros de diâmetro.
Entre esses três domínios proteicos, o IDR FBP17 fornece a maior nano barra e densidade, indicando sua maior capacidade de detecção de curvatura, enquanto o F-Bar mostra o menor valor. A curva de ligação às proteínas pode ser plotada aumentando gradualmente a concentração de proteínas, o que mostra que o IDR FBP17 tem uma forte capacidade de detecção de curvatura cooperativa. Em comparação com a rápida recuperação de sinais lipídicos em nanobares, a F-Bar não pode se recuperar dentro de dois minutos, sugerindo sua mobilidade de membrana significativamente diminuída e dinâmica de associação nos locais de membrana curva.
Surpreendentemente, diferente do comportamento da F-Bar, os sinais IDR FBP17 mostraram recuperação óbvia dentro do mesmo período de tempo, indicando a natureza dinâmica do IDR FBP17 acumulado nas membranas curvas. No entanto, depois de lavar o IDR FBP17 não ligado na solução, a mesma recuperação no canal IDR FBP17 não pôde ser observada como antes. A qualidade do SLB é muito importante quando se estuda a interação entre membrana curva e proteína.
Portanto, o teste FRAP é necessário em nosso experimento para validar a mobilidade da membrana. Este sistema ajudará os pesquisadores a estudar vários parâmetros que afetam a interação da proteína com a membrana curva, como os domínios de detecção de curvatura e a composição lipídica, bem como a realizar estudos dinâmicos sobre a membrana curva, como comportamentos de separação facial.
