Este protocolo permitiu responder a uma pergunta importante no campo da metástase do câncer. Incluindo, como as células tumorais colonizam o pulmão? Como as células tumorais permanecem dormentes?
E o que os induz a sair da dormência e eventualmente formar metástase. A principal vantagem deste protocolo é que o processo metastático dinâmico pode ser diretamente estudado in vivo, em tempo real, em um verdadeiro microambiente. Este método pode fornecer informações sobre várias doenças pulmonares, mas é particularmente útil para entender o comportamento que as células tumorais individuais disseminam para o pulmão, um local comum de metástase.
Para começar, use uma sutura de seda 2-0 para amarrar um nó na base de um cateter de 22 bitolas, deixando caudas de 2 polegadas de comprimento. Uma vez que o rato esteja completamente anestesiado, mova o mouse para a mesa de operação, entuba o mouse e, em seguida, fixe o cateter de intubação amarrando a sutura de seda 2-0 em torno do focinho do rato. Conecte o ventilador ao cateter de intubação.
Usando fita de papel, fixe a frente cranialmente e os membros traseiros caudalmente ao estágio cirúrgico aquecido. Coloque uma fita de papel ao longo do comprimento das costas do mouse para maximizar a exposição ao campo cirúrgico. Levante a pele com as fórceps e faça uma incisão circular de aproximadamente 10 mm a cerca de 7 mm à esquerda para o esterno e cerca de 7 mm superior à margem subcostal.
Extireta o tecido mole sobrevoando as costelas. Eleve a sexta e a sétima costela usando fórceps. Use uma única lâmina da tesoura de micro dissecação sem corte com o lado arredondado em direção ao pulmão para perfurar cuidadosamente o músculo intercostal entre a sexta e a sétima costela para entrar no espaço intratorácico.
Descarretou delicadamente o recipiente de ar comprimido no defeito para colapsar o pulmão e separar o pulmão da parede torácica. Dispare o ar comprimido em rajadas curtas para evitar lesões pulmonares iatrogênicas. Coloque o soco da biópsia sobre a ferramenta de corte e manoque cuidadosamente a base da ferramenta de corte através da incisão intercostal.
Oriente a base da ferramenta de corte paralelamente à parede do peito e faça um orifício circular de 5 mm através da caixa torácica. Usando uma sutura de seda 5-O, coloque um ponto de corda da bolsa, aproximadamente 1 mm do orifício, circunferencialmente. Em seguida, posicione a moldura da janela na parede do peito com as bordas do defeito circular capturado dentro do sulco das janelas.
Amarre firmemente a sutura de seda 5-O para travar com segurança a janela implantada. Aplique um fluxo constante e suave de ar comprimido por cerca de 10 a 20 segundos para secar o pulmão. Use os fórceps para segurar a estrutura da janela pela borda externa e levantar suavemente para garantir a separação do pulmão da superfície inferior da estrutura da janela.
Dispense uma fina camada de adesivo de cianoacrilato ao longo da superfície inferior do quadro óptico da janela. Pressione suavemente, mas firmemente, a estrutura óptica da janela no tecido pulmonar por 10 a 20 segundos para fixação. Dispense uma gota de 5 mm de adesivo em um deslizamento de tampa retangular.
Use a ferramenta de coleta de vácuo para pegar um deslizamento de cobertura de 5 mm. Mergulhe a superfície inferior da tampa deslize para dentro do adesivo e, em seguida, raspe o adesivo em excesso três vezes contra o lado da tampa retangular para fazer uma camada muito fina de adesivo no deslizamento da tampa. Posicione cuidadosamente o deslizamento da tampa em um ângulo dentro do recesso no centro da estrutura óptica da janela, logo acima do tecido pulmonar.
Fixar brevemente o ventilador para gerar pressão positiva, hiper inflando o pulmão. Oriente a tampa deslize paralelamente ao tecido pulmonar, usando o movimento rotativo para criar deposição direta entre a superfície pulmonar e a superfície inferior do deslizamento da tampa. Mantenha a pressão suave por aproximadamente 25 segundos para definir o adesivo de cianoacrilato.
Separe o deslizamento da tampa da ferramenta de captação de vácuo com fórceps. Crie um ponto de corda da bolsa, circunferencialmente, a menos de 1 mm da borda cortada da incisão da pele usando sutura de seda 5-O. Coloque qualquer excesso de pele sob a borda externa da moldura da janela antes de amarrar a janela firmemente com nós de bloqueio.
Dispense uma pequena quantidade de adesivo na interface de vidro metálico para garantir uma vedação hermética entre o deslizamento da tampa e a moldura da janela. Coloque a agulha estéril em uma seringa de insulina de 1 ml. Insira a agulha abaixo do processo xifoide, avançando em direção ao ombro esquerdo, entrando na cavidade torácica através do diafragma.
Puxe suavemente a seringa para remover qualquer ar residual da cavidade torácica. A imagem intravital multifotona de uma única região pulmonar mostrou que o microvascular poderia ser realocado ao longo de três dias consecutivos. O ponto de ramificação definível de um único navio foi identificado a cada dia consecutivo.
Os eritrócitos não rotulados criaram sombras quando fluíam em vasos maiores. O ângulo dos pontos do ramo em relação ao vaso pode ser usado para calcular as taxas de fluxo de eritrócitos. A velocidade do eritrócito também foi quantificada injetando no camundongo microesferas fluorescentes e seus comprimentos de pista foram medidos divididos pelo tempo de aquisição do quadro.
As microesferas estacionárias e fluídas eram distinguíveis. O destino das células tumorais disseminadas foi rastreado com imagens em série ao longo de vários dias, usando a janela para imagens de alta resolução do pulmão. A célula tumoral chegou e se alojou na vasculatura pulmonar no primeiro dia.
No entanto, a célula não foi detectada na vasculatura pulmonar no segundo e terceiro dias, indicando recirculação ou extravasação. Os passos culminantes da progressão metastática no pulmão foram visualizados a partir da chegada da célula tumoral, extravasão de células tumorais no parenchyma pulmonar e proliferação para formar macro metástase. Tome cuidado para evitar traumas no pulmão durante a colocação da estrutura óptica da janela.
O pulmão é propenso a sangramento, o que mais tarde impedirá a adesão ao deslizamento durante a colocação. Outros métodos que podem ser realizados após este procedimento incluem a microscopia intravital, que quando empregada com uma abordagem modificada da microcartografia, permite a relocalização precisa de áreas de interesse para imagens repetidas. Este protocolo permitiu a visualização do pulmão na investigação de uma questão-chave sobre o mecanismo da metástase.
Este estudo tem o potencial de reconstruir um novo tratamento para pacientes com câncer.
