Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lubor Borsig (Instituto de Fisiologia da Universidade de Zurique) para o seu conselho sobre a técnica de perfusão pulmonar. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Krebsliga da Zurich Kanton, o L. Walter e Wolf Johanna Foundation, Zurique, a Lydia Hochstrasser Foundation, Zurique, o Swiss National Science Foundation, SNF, Suíça, Schweizerischer Verein Balgrist, e da Universidade de Zurique.

1. Perfusão Pulmonar In situ e Fixação <ol><li> Anestesiar ratos por injecção ip de 150 ul ~ fosfato salino tamponado (PBS) contendo 112,5 mg / kg (peso corporal) de cetamina, xilazina 16,5 mg / kg e 15 mg / kg de acepromazina (ou por um outro anestésico contendo analgésicos adequados). </li><li> Quando os reflexos do mouse já não são observadas, corrigi-lo na mesa de operação de volta para baixo e molhar a pele com etanol 70% para os cabelos lisos para baixo. </li><li> Abrir a pele do abdómen até ao pescoço e puxá-la para os lados ou removê-lo. </li><li> Abra o peritônio eo tórax de um amplo tamanho. Impedir rupturas de grandes vasos (por exemplo, a veia jugular) para evitar a redução da eficiência da perfusão subsequente. </li><li> Cortar a veia cava caudal abaixo do fígado. </li><li> Usar uma seringa de 20 ml equipado com um 21G - agulha 24G para injectar lentamente 10-15 ml de PBS para dentro do ventrículo direito do coração a bater até que o pulmão é completamente branco eo coração pára de bater (assistolia). </li><li> Beliscar fora dos vasos sanguíneos acima do fígado e do diafragma, com uma pinça vascular. </li><li> Use uma seringa de 10 ml equipado com um 21G - agulha 24G para injectar ~ 2 ml de paraformaldeído a 3% (PFA) em PBS para o ventrículo direito. </li><li> Descobrir a traqueia fora do tórax. Usar a mesma seringa para injectar ~ 3 ml de 3% de PFA em PBS cranial (do lado de fora do tórax) na traqueia até o pulmão é insuflado. Imediatamente após a remoção da agulha, belisque da cauda traqueia de punção com uma pinça vascular e aguardar durante 10 minutos para permitir a fixação. </li><li> Transecão os vasos sanguíneos acima do grampo vascular, remover o grampo e injectar ~ 2 ml de PBS para o ventrículo direito para remover o excesso de PFA. </li><li> Punção as partes inferiores de todos os lobos pulmonares com uma agulha, retirar a pinça vascular na traqueia e injectar 3-5 ml de uma solução de PolyFreeze incorporação médio / PBS 1:1 para o caudal da traqueia da primeira punção até o PFA no pulmãolóbulos é substituída pela solução. </li><li> Retire cuidadosamente o pulmão puxando o coração com uma pinça e atravessa em ligamentos do tecido conjuntivo, vasos sanguíneos e da traquéia. Manter o coração ligado para os pulmões. </li><li> Dependendo de como proceder com a análise do tecido pulmonar continuar com os protocolos descritos nas secções 2 ou 3. Se você quer fazer ambas as análises, remover um lobo do pulmão e proceder conforme descrito em 3. Processar os restantes lóbulos ligados ao coração, tal como descrito no ponto 2. </li></ol> 2. Visualização de lacZ-marcadas células tumorais metastáticas em lobos pulmonares inteiras <ol><li> Coloque o pulmão num copo de plástico com tampa de fecho estanque e fixá-lo com formaldeído a 2% em PBS à temperatura ambiente durante 30-60 min. </li><li> Remover solução fixadora e lavam cuidadosamente 3 vezes com PBS. </li><li> Adicionar pelo menos 10 ml preparada de fresco de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal), a coloração da solução (solução stock X-Gal [40 mg / ml emDimetilformamida] 01:40 diluído em solução de coloração básico, pH 7,1 (Tabela 1), proteger da luz). </li><li> Colocar um pedaço de gaze na parte superior do pulmão de natação para mantê-la completamente na solução e colocar a tampa apenas frouxamente sobre o pote para permitir a troca de ar. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 3-5 hr protegido da luz. </li><li> Remover X-Gal solução, lavar uma vez com PBS para remover a solução de X-Gal residual (opcional) e adicionar PFA a 4%. </li></ol> 3. Visualização de lacZ-tagged células tumorais metastáticas em criocortes Pulmonares <ol><li> Prefill um molde de encaixe marcado a 1/3 com meio não diluído PolyFreeze incorporação. Coloque o lobo em cima e encher-se com a incorporação médio até que o lobo está completamente coberto. Tente evitar bolhas. </li><li> Incubar os pulmões incorporados a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Em seguida, congelar os pulmões incorporados lentamente em uma mistura de gelo seco e isopentano e armazenar a -80 ° C. </li><li> Corte 7-10 mM crioseções em um criostato e montá-los em lâminas de microscópio SuperFrostPlus. </li><li> Incubar as secções imediatamente com X-Gal solução de coloração a 37 ° C durante 24 horas numa câmara húmida. </li><li> Enxaguar as lâminas em PBS 2 vezes durante 5 min e, em seguida, brevemente em água destilada. </li><li> Counter-mancha de vermelho rápido nuclear por 10-30 segundos, lavar em água destilada e montar as lâminas com Carac-Monte. </li></ol> 4. Resultados representativos Asai et al. Relatada no artigo original sobre o derivado Dunn-modelo de rato LM8 OS que os tumores sc primárias derivadas das células parentais de Dunn, diferentes dos derivados da linha de células altamente metastáticas LM8 sub, não formam espontaneamente metástases pulmonares em detectáveis ratinhos C3H singénicos 14. Com as técnicas aqui relatadas, que de novo inquérito a formação de metástases nas Dunn/LM8 modelos do rato do SO. Nós aproveitou estável lacZ transduzidas Dunn e LM8 celulars e de um protocolo para a in-situ de perfusão pulmonar e fixação em ratinhos. Imagens representativas de pulmões perfundidos e não perfundido de ratos injectados subcutaneamente com lacZ-transduzidas e não transduzidas de controlo Dunn e LM8 células são mostradas na Figura 1. Nos ratinhos injectados com células de controlo Dunn, metástases macroscópicas e microscópicas permaneceu indetectável no pulmão não-perfundidos e perfundido (Figura 1A, i-iv). Mas, curiosamente, em ratinhos injectados com células de Dunn-lacZ, X-gal revelou coloração azul micrometastático focos de células individuais ou grupos de células pequenas (&lt;0,1 mm), na superfície do não-perfundidos pulmões (Figura 1A, vi). In- perfusão in situ e fixação dos pulmões melhorou a detecção de micrometástases Dunn-lacZ (Figura 1A, viii). No entanto, a excrescência focos macroscópico não foi observado (Figura 1A, v, vii). &lt;/ P&gt; Nos ratinhos injectados com células de controlo LM8, translúcidas, dificilmente detectável macrometastatic focos maiores do que 0,1 mm de diâmetro foram reconhecidos em não-perfundidos pulmões (Figura 1B, i). Perfusão do pulmão (Figura 1B, iii) não melhorou a detecção de focos. No entanto, em ratinhos injectados com LM8-lacZ várias células X-Gal azul manchado macro-(Figura 1B, v) e micrometástases (Figura 1B, vi) foram detectados na superfície do não-perfundidos órgãos. Além disso, a perfusão dos pulmões melhorou a detectabilidade de macro-e micrometástases (Figura 1B, vii - viii). Consequentemente, as micro-e macrometástases tornou visível a uma densidade mais elevada e um número maior, principalmente devido à transparência do tecido perfundido de focos em que por baixo da superfície de órgãos tornou-se também visível. Um h adicionalanálise istological usando criocortes de tecido pulmonar confirmou a detectabilidade melhorada de metástases pulmonares em ratinhos injectados com lacZ-transduzidas Dunn e LM8 células. Nos ratinhos com tumores primários derivados de Dunn-lacZ ou LM8-lacZ células, ao contrário dos camundongos com tumores primários das células de controlo respectivos, micrometástases ou mesmo única célula focos foram reconhecidos em secções de pulmão (Figura 2). Além disso, também foram macrometástases mais claramente visíveis em ratinhos injectados com células LM8-lacZ do que em animais injectados com o controlo LM8 células (Figura 2C e D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figura 1. Detecção de metástases espontâneas de não transduzidas (i-iv) e lacZ transduzidas (v-viii) Dunn (A) e LM8 (B) células não perfundido (i, ii, v, vi) e perfundida (iii, iv, vii, viii) nos pulmões de ratinhos C3H. Metástases em representante X-Gal-staINED pulmões inteiros (V, VII, em A e B) e respectivo close-ups (VI, VIII em A e B) aparecem em azul. Macrometastatic focos (&gt; 0,1 mm) nos órgãos de ratos injetados com os não-etiquetados LM8 células (i-iv em B) são indicados por asteriscos. Áreas mostradas em close-ups são representativos para os pulmões inteiros. Barras de escala indicam um milímetro em imagens de pulmões inteiros e 0,1 mm de close-ups. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figura 2. Detecção de Dunn e LM8 micrometástases em criocortes de pulmão. Secções de tecido de pulmão outubro embedded foram incubadas em X-Gal solução de coloração a 37 ° C durante 24 horas numa câmara húmida e, em seguida, contrastadas com vermelho nuclear rápido. As setas apontam para os focos micrometastático reconhecido em secções de pulmão de ratos injectados com Dunn-lacZ (B), ou células LM8-lacZ (D). Micrometastases permaneceu indetectável em secções de pulmão de ratos injectados com não transduzidas Dunn (A) ou LM8 células (C). Barras de escala indicam 0,1 mm.

<ol>
	<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li><li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+inhibitors+and+cancer:+trials+and+tribulations.">Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations.</a> Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).</li><li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+cancer:+a+review.">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li><li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals.">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).</li><li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models.">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li><li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry.">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li><li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li><li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+lacZ+gene:+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies.">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li><li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model.">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment.">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li><li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity.">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li><li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+and+cancer+revisited:+mechanistic+connections+involving+platelets,+P-selectin,+carcinoma+mucins,+and+tumor+metastasis.">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn/LM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis.">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li><li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+(LM8)+with+high+metastatic+potential+to+the+lung.">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity.">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li><li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma.">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os resultados aqui apresentados no modelo Dunn/LM8 OS rato demonstram o poder do método recentemente estabelecido que combina a coloração com X-Gal-lacZ de células tumorais marcadas com a perfusão in situ / fixação do tecido pulmonar. Esta combinação das duas técnicas permite uma detecção de alta sensibilidade de lesões micrometastáticas para baixo para o nível da célula individual e também melhora a visualização das macrometástases sobre a superfície do pulmão (Figura 1), bem como nas secções de pulmão (Figura 2). Embora a coloração com X-Gal permite também a detecção de (micro) metástases em outros órgãos, in-situ de perfusão / fixação melhora a detecção de focos metastáticos nos tecidos do pulmão que não sejam apenas ligeiramente por causa da cor natural do sangue e do tecido relacionada desses 13 órgãos. Mesmo se a perfusão é dirigida a um outro órgão, por exemplo, o fígado, a remoção do sangue só parcialmente melhorar a aposta contrasteween coloração com X-Gal e a cor natural do órgão. No entanto, o método é aplicável a qualquer tipo de lacZ-tagged células tumorais, irá melhorar drasticamente a detectabilidade de metástase pulmonar até ao nível de uma única célula dormente micrometástases e permite uma quantificação fácil e fiável de macro e micrometástases. Uma limitação deste método e todas as outras técnicas que são baseados em genes repórter, incluindo as proteínas de luciferase e de fluorescência, é a estabilidade da expressão do transgene. Como se mostra na Figura 2d, nem todas as células tumorais dentro do macrometastatic focos estão manchadas azul, indicando uma ausência de actividade de beta-galactosidase. Isso pode ser devido a necrose, mas é mais provavelmente devido a uma perda da expressão do transgene. Observou-se que a Dunn e LM8 células são muito eficazes na regulação negativa de lacZ e outros transgenes mesmo sob selecção contínua para a expressão. Nós, portanto, ligado em estudos recentes para o K12 murinoe K7M2 e os humanos HOS, 143B e SAOS-2 linhas de células de osteosarcoma, as quais todas mantidas expressão de lacZ estável in vitro, bem como in vivo, até 100% ao longo do tempo. Uma vez que a expressão de lacZ-estável é garantido, esta técnica pode ser aplicada em estudos com genes manipulados células tumorais, por exemplo, para investigar mecanicamente o processo de colonização do tecido 13, assim como para o desenvolvimento e teste de novas terapias visando a erradicação das lesões metastáticas 15 , 16. Além disso, pode servir como uma referência para a melhoria das atuais técnicas de imagem radiológica, tais como PET, (micro) TC e RM, usados ​​para a detecção precoce de lesões metastáticas. Em um estudo recente de PET (não publicado) com marcadores diferentes verificou-se a no pulmão detectado vivo metástases in vivo subsequentemente ex com o protocolo descrito. Em um estudo em curso com um novo animal pequeno micro-CT (SkyScan) estamos tão longe able para detectar metástases pulmonares in vivo para um tamanho de 0,5 mm para baixo e ex vivo a 0,3 mm, mas pretende-se uma resolução de 0,1 mm. Interessantemente, isto é o limite de tamanho, que definimos distinguir macro-de micrometástases com o método combinado de perfusão in situ e a coloração X-Gal. Esta sublinha uma vez mais a sensibilidade ea utilidade desta técnica fácil e de baixo custo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamina) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Xilazina (xilazina) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazina) </td><td> FATRO SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Bulldog Tipo Serrefine grampo vascular </td><td> Belas Science Tools </td><td> 18051-35 </td><td> mm, curvo 35 </td></tr><tr><td> Copo de plástico com tampa </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml com tampas de copos </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal); pó </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> dissolver em N, N-di-metilformamida e 40 mg / ml, loja de luz-protegido à temperatura de -20 ° C </td></tr><tr><td> Solução corante básico, equilibrada a pH 7,1, armazenadas light-protegida, a 4 ° C para max. 1 mês </td><td> por si mesmo </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 mL / L 1 M de MgCl2, 2 ml / L 10% de NP40, 1 ml / L de sódio a 10%-Desoxicolato </td></tr><tr><td> Meio de incorporação PolyFreeze </td><td> Polysciences; distribuidor suíço: Brunschwig </td><td> 19.636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Incorporação molde </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 criostato </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lâminas SuperFrost </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast-Vermelho - solução de sulfato de alumínio </td><td> Divisão Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Carac-Monte </td><td> Thermo Electron, distribuidor suíço: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes e Equipamentos.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Metástase é a principal causa de morte na maioria dos tipos de câncer e, consequentemente, um foco principal na pesquisa do câncer. No entanto, a detecção de micrometástases de imagiologia radiológica e o sucesso na sua erradicação terapêutico permanecer limitado. Enquanto modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a pesquisa do câncer 1, o monitoramento / visualização de micrometástases continua a ser um desafio e avaliação imprecisa de metástase em estudos pré-clínicos potencialmente leva a resultados desapontadores em ensaios clínicos 2. Consequentemente, existe um grande interesse em refinar os métodos para finalmente permitir a detecção reprodutível e fiável de metástases para baixo para o nível de célula única em tecido normal. O foco principal é, por conseguinte, sobre técnicas que permitem a detecção de células tumorais in vivo, como a micro-tomografia computorizada (micro-CT), tomografia de emissão de positrões (PET), a bioluminescência ou imagens de fluorescência &lt;sup&gt; 3,4. Estamos actualmente a optimização destas técnicas para a monitorização in vivo do crescimento do tumor primário e as metástases em modelos de osteosarcoma diferentes. Algumas destas técnicas podem também ser usados ​​para análise ex vivo de metástase lado métodos clássicos como qPCR 5, 6 ou FACS diferentes tipos de coloração histológica. Como um padrão de referência, estabelecemos no presente estudo a transfecção ou transdução estável de células tumorais com o gene lacZ que codifica a enzima bacteriana β-galactosidase que metaboliza o substrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D -galactopiranosido (X-Gal) com um corante azul índigo insolúvel 7 e permite que altamente sensível e selectivo coloração histoquímica azul de células tumorais em tecido de rato ex vivo até ao nível da célula individual, como mostrado aqui. Esta é uma ferramenta de baixo custo e não equipamento intensivo, o que permite a validação preciso da metástase 8 em estudos de avaliação de um novoterapias ticancer 9-11. Um fator limitante de X-gal de coloração é o baixo contraste, por exemplo, relacionadas com o sangue de coloração vermelho tecidos bem vascularizada. No tecido pulmonar, este problema pode ser resolvido por perfusão in situ de pulmão, uma técnica que foi recentemente estabelecido pela Borsig et al. Perfundidos 12 que os pulmões dos ratos, sob anestesia para eliminá-las do sangue, e para fixar e inserir-los in situ sob inflação através da traquéia. Este método evita também o colapso do pulmão e, assim, mantém a morfologia funcional alvéolos pulmonares, o que melhora a qualidade do tecido para análise histológica. No presente estudo, nós descrevemos um novo protocolo, que tira vantagem de uma combinação de X-gal de coloração lacZ células tumorais que expressam e in-situ de perfusão e de fixação do tecido pulmonar. Este protocolo permite refinado de alta sensibilidade de detecção de simples células metastáticas no pulmão e permitiu-nos em um estudo recente para detect &quot;adormecidas&quot; micrometástases pulmonares em um modelo de rato 13, que foi originalmente descrito como sendo não-metastáticos 14.

Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão pulmonar e fixação e coloração com X-Gal de<em&gt; LacZ</em&gt; Marcado com células tumorais.

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K visualizações.  Balgrist University Hospital, Zurich. O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos combinado In-situ Perfusão pulmonar e fixação e coloração com X-Gal de LacZ Marcado com células tumorais.

Vídeo: Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Medicina

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Método de Isolado<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these strategies is to examine their effects on heart function. There are several techniques to measure in vivo cardiac mechanics (e.g., echocardiography, pressure/volume relations, etc.). Compared to echocardiography, real-time left ventricular (LV) pressure/volume analysis via catheterization is more precise and insightful in assessing LV function. Additionally, LV pressure/volume analysis provides the ability to instantaneously record changes during manipulations of contractility (e.g., &#946;-adrenergic stimulation) and pathological insults (e.g., ischemia/reperfusion injury). In addition to the maximum (+dP/dt) and minimum (-dP/dt) rate of pressure change in the LV, an accurate assessment of LV function via several load-independent indexes (e.g., end systolic pressure volume relationship and preload recruitable stroke work) can be attained. Heart rate has a significant effect on LV contractility such that an increase in the heart rate is the primary mechanism to increase cardiac output (i.e., Bowditch effect). Thus, when comparing hemodynamics between experimental groups, it is necessary to have similar heart rates. Furthermore, a hallmark of many cardiomyopathy models is a decrease in contractile reserve (i.e., decreased Bowditch effect). Consequently, vital information can be obtained by determining the effects of increasing heart rate on contractility. Our and others data has demonstrated that the neuronal nitric oxide synthase (NOS1) knockout mouse has decreased contractility. Here we describe the procedure of measuring LV pressure/volume with increasing heart rates using the NOS1 knockout mouse model.

This article describes the measurement of murine left ventricular function via pressure/volume analysis at different heart rates.

O cateterismo cardíaco em camundongos para medir o volume Pressão do relacionamento: Investigando o efeito Bowditch

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Abrir traqueostomia ácido gástrico aspiração Modelo murino de lesão pulmonar aguda Resultados em Maximal aguda não-letal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Geração de culturas de tecido de pulmão humano de 3D (3D-CTIs) para modelagem de doença

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo