Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde através de um catalisador Co-infecções e co-morbidades subvenção. Eritrócitos humanos foram fornecidos pelo Centro Hospitalar de l&#39;Université Laval banco de sangue.

Nota: Experimentos com HIV-1 e Plasmodium falciparum deve ser realizada no próprio nível de biossegurança para laboratórios (BSL2 de parasitas, e BSL3 para HIV-1 e co-infecções) e as precauções especiais devem ser tomados ao usar potencialmente infectados sangue humano. 1. As células mononucleares do sangue periférico Purificação (PBMC) (baseado em 8 e 9) <ol><li> Começar com sangue humano fresco a partir de dadores saudáveis ​​(500 ml) tratados com anticoagulantes (heparina, citrato, citrato ácido dextrose ou citrato de fosfato de dextrose). Use-endotoxina livres reagentes quando purificação e isolamento de PBMC e em todo o resto do protocolo. </li><li> Desinfectar o saco de sangue, incluindo o tubo, com etanol a 70%, cortar o tubo e transferir cuidadosamente o sangue para um balão T150. </li><li> Prepare 16 tubos com 15 ml de meio Linfócitos Separação (Ficoll) por 50 tubo ml (certifique-se que Ficoll atingiu a temperatura ambiente).Cuidadosamente ml camada 30 de sangue fresco em cima. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 20 ° C com intervalos de folga. </li><li> Durante a centrifugação, preparar 8 x tubos de 50 ml cónicos com 25 ml de solução à temperatura ambiente Salina Equilibrada de Hank (HBSS) por tubo. </li><li> Transferir cuidadosamente o anel de célula turvo na interface (contém PBMC) para o tubo de 50 ml contendo o HBSS (anéis de piscina 2 celulares por tubo). Completar volumes de até 50 ml com HBSS. </li><li> Centrifugar a 150 xg durante 15 min a 20 ° C com quebras na. </li><li> Durante a centrifugação do anel célula nublado, recolher a camada superior amarela a partir do passo Ficoll, o pool de plasma para encher um tubo cónico de 50 ml. Inactivar o complemento no plasma por meio de aquecimento do tubo de 50 ml a 56 ° C durante 30 min e girar 10 min a 1.800 x g. Manter o sobrenadante (contém plasma autólogo diluída que pode ser utilizado como suplemento de meio em passos posteriores). </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante e resuspend o pellet celular a partir do passo 1.7 em 25 ml de HBSS e piscina 2 pelotas por 50 ml de tubo. Girar a 300 xg durante 8 minutos a 20 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante cuidadosamente e ressuspender as pelotas em 10 ml de HBSS e piscina em um tubo de 50 ml. </li><li> Tome uma alíquota, executar trypan exclusão azul para avaliar a mortalidade e, em seguida, contar PBMC. </li><li> Volume completo a 50 ml com HBSS e min de centrifugação 10 a 300 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI 1640 a 5x10 6 células / ml (pode-se obter cerca de 400-500 x 10 6 PBMC de 500 ml de sangue). </li></ol> 2. Monócitos-macrófagos derivados de Diferenciação (MDM) (baseado em 8 e 9) <ol><li> Semente de aproximadamente 1,25 x 10 8 PBMC em 15 pratos cm com RPMI 1640 (25 ml prato /). </li><li> Deixe células aderir durante 1-2 horas a 37 ° C com 5% de atmosfera de CO2. </li><li> Transferência não aderidas células num balão de novo e lavar a placa com 15 ml de endotoxina livre de PBS duas vezes (5min, 300 xg). As células aderentes são monócitos isolados. </li><li> Para permitir que os monócitos isolados de fresco para se diferenciarem em MDM, adicionar 20 ml de meio RPMI 1640 suplementado com 5% de plasma autólogo (do passo 1.8). Adicionar o factor Colony humana recombinante Macrófago Estimulante (M-CSF, 25 ng / ml) e penicilina / estreptomicina solução (PS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar durante 2 dias, troca de meio e incubar 2-3 dias adicionais a 37 ° C em 5% de CO 2 atmosfera. </li><li> Remover meio velho e lave com endotoxina livre PBS vez, adicione o PBS suavemente e aspirar imediatamente. Para separar MDM totalmente diferenciados, tratar as células com ~ 7 ml Accutase (Accutase, uma mistura comercialmente disponível de proteases e da actividade colagenolítica que permitem a separação de células a partir do prato de plástico) para 15-20 min a 37 ° C em um 5% de CO 2 atmosfera, balançar suavemente no meio-tempo. </li><li> Adicionar 3-5 ml de plasma autólogo (do passo 1,8) em cada placa (para ajudar a proteger as células, enquantoraspagem). </li><li> Raspe células certificando-se que o meio abrange as células em todos os tempos e de transferência / piscina em um tubo de 50 ml. </li><li> Lavar pratos com endotoxina livre de PBS para recuperar tantas células quanto possível. </li><li> Girar 5 min a 200 xg, elimine o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5 ml de MDM meio de cultura (RPMI 1640 suplementado com 10% de complemento de soro fetal de bovino inactivado (OIF), PS, HEPES 25 mM) e contagem de células (MDM produzir geralmente 2-8% de PBMC total). Nota: uma alíquota de MDM podem ser tomadas este passo para avaliar a pureza população de células por citometria de fluxo, geralmente 99% do obtido MDM expressa CD14. </li><li> Semente 1x10 5 MDM em 600 uL de meio de cultura MDM por poço em placas de 24 poços. </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2 antes de infecções. </li></ol> 3. Produção e determinação quantitativa de HIV-1 reservas virais <ol><li> Produzir stocks virais utilizando transfecção com fosfato de cálcio em células HEK293T seguinprotocolo a asa da Fortin et al. 10. </li><li> A fim de obter os vírus de ciclo único contendo o gene repórter da luciferase de codificação, células co-transfectar HEK293T quer com ug de 20 NL4.3 Luc + Env - R + e 10 ug de pHCMV-G, ou 15 ug de NL4.3 Luc + Env - R + e 15 mg de pJRFL env. Use 30 mg de NL4.3 Luc + Env - R + para gerar controle glicoproteína deficiente vírus. Para o vírus replicativa totalmente, utilize 30 ug de NL4.3Bal env. Os vectores pHCMV-G e pJRFL env codifica as glicoproteínas do envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) e de um CXCR5-trópico HIV-1 (diferente do que NL4.3Bal env), respectivamente. Informação adicional sobre os plasmídeos podem ser obtidos a partir de 8. Os plasmídeos podem ser obtidos através do AIDS Research NIH e Programa de Referência (NIAID, NIH). </li><li> Quantificar todas as reservas virais usando ELISA para a proteína HIV-1 p24 da cápside 11, E verificar o seu potencial infeccioso antes de usar. Nós avaliar a infectividade dos estoques de vírus nossos através da utilização de células TZM-bl indicador 12. </li></ol> 4. Cultura de parasitas Plasmodium falciparum (Baseado em 13) 4,1 cultura geral e manutenção de parasitas <ol><li> Manter P. falciparum 3D7 assexuadas parasitas fase em eritrócitos humanos (o grupo sanguíneo O +) em um hematócrito de 4% em meio RPMI 1640 (tamponado com HEPES 25 mM e 25 mM de NaHCO 3) suplementado com 0,5% (w / v) Albumax II, 25 ug / ml de gentamicina e 370μM Hipoxantina a 37 ° C em uma mistura gasosa de oxigénio de 1% / dióxido de carbono a 5% em azoto. </li><li> Parasitemia pode ser monitorizado através de um esfregaço fino da cultura e da coloração com uma solução Giemsa a 15%. </li><li> Sempre manter uma não infectadas células vermelhas do sangue (uRBC) prato de cultura, nas mesmas condições como parasitas para usar como um controlo. Para obter Parasit fase tardiaes (trofozoítos / esquizontes primeiros), sincronizar os parasitas, como segue: </li></ol> 4,2 sincronização Parasite <ol><li> Na manhã seguinte, colher a cultura parasita, min de centrifugação a 300 xg 5 e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5 volumes de células embaladas com 5% (w / v) de D-sorbitol e incubar 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Gire 5 min a 300 x g, elimine o sobrenadante, ressuspender o pellet em 30 ml meio de cultura e colocar de volta na incubadora. </li><li> Cerca de 8 horas mais tarde, as etapas de repetição 4.2.1 a 4.2.3, a fim de obter parasitas firmemente sincronizados. Parasitas fase tardia (trofozoítos / esquizontes precoces) pode então ser colhida na manhã seguinte para realizar a experiência. Antes da purificação, realização da coloração Giemsa para confirmar fase do ciclo de vida. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum infectados glóbulos vermelhos (iRBC) purificação <ol><li> Esterilizar o separador VarioMacs (stand e imã) com etanol 70% e prendas que sob a capa biológica. </li><li> Fixe a torneira de três vias para CS parte inferior da coluna. </li><li> Cortar o final do protector de plástico da agulha com o cortador Miltenyi especial e fixar a agulha para o fundo torneira. </li><li> Bloquear a coluna no ímã com cuidado. </li><li> Remover todas as bolhas de ar na coluna por injecção lentamente 10 ml de MDM meio de cultura com a seringa kit fechado aparafusado no lado esquerdo da torneira. </li><li> Lavar a coluna com 20 ~ meio de cultura ml MDM. </li><li> Colheita RBC da placa de cultura, lavar uma vez com 10 ml médio MDM (300 xg, 5 min) e ressuspender o pellet em 12 RBC meio de cultura MDM ml. Lentamente, adicionar à coluna e permitir o fluxo de suspensão através de (apenas infectadas células vermelhas do sangue contendo parasitas no trofozoíto ou estágio esquizonte irá ser retido pelo campo magnético devido à presença de cristais de hemozoin). </li><li> Lavar uma vez com 20 ml de meio e parar o fluxo de líquido quando ele atinge o disco branco no topo da coluna. </li><li>Remover a coluna do íman e iRBC eluir em um tubo limpo estéril com 12 ml de MDM meio de cultura. </li><li> Alíquota Smear um do iRBC recuperado e realizar Giemsa coloração para confirmar etapa do ciclo de vida. </li><li> Contar iRBC recuperado usando um hemocitómetro (isolado RBC são iRBC 100%). </li><li> As células da pelota (300 xg, 5 min), elimine o sobrenadante e tratar as células com 500 uL AB frescos + soro humano (passo opsonisation 14). </li><li> Incubar durante 30 min a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> Lavar uma vez com 10 ml de MDM meio de cultura (300 x g, 5 min), e ressuspender iRBC a concentração desejada. Geralmente, um 10% de parasitemia 15 prato de cultura centímetros aproximadamente dá ~ 0,5-1x10 8 iRBC firmemente sincronizado. </li></ol> 5. Exposição do MDM para Plasmodium falciparum <ol><li> Para expor o MDM para uRBC ou iRBC, as células devem ser ressuspensas em meio de cultura MDM a fim de obter uma proporção de uRBC / iRBC: MDM de 75:1. Em anteriormentepreparadas placas de 24 poços contendo MDM, adicionar volume de suspensão adequado RBC a cada poço. Realizar todos os experimentos em triplicata. </li><li> Incubar co-culturas durante 4 horas a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> Lavar as células com 600 ul de PBS isento de endotoxina-3 vezes, adicionar o PBS suavemente e aspirar imediatamente. </li><li> Para lisar o RBC restante, lavar os poços por adição de 200 ul de água gelada estéril para 20 seg e aspirado. </li><li> Adicionar 600 uL meio de cultura MDM e incubar 24 hr a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2. </li></ol> 6. A infecção de MDM com um replicativa totalmente HIV-1 <ol><li> A fim de avaliar o efeito de P. falciparum em replicação do HIV-1 em MDM, adicionar, de acordo com o esquema delineado na Figura 1A, 10 ng de p24 (em 300 ul de MDM media) de vírus NL4.3Bal env nos poços adequados; adicionar apenas com meio de MDM em poços de controlo . </li><li> Incubar 2 horas a 37 ° C em um 5% De CO 2 atmosfera. </li><li> Lavar as células com PBS isento de endotoxina-3 vezes, adicionar o PBS suavemente e aspirar imediatamente. Adicionar 600 ul de meio MDM fresco por poço. </li><li> Incubar a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> No dia 3, 6, 9 e 12 após o início da infecção viral, a colheita 200 uL de cada sobrenadante, a adição de 200 ul de meio fresco MDM em seguida. Manter os sobrenadantes colhidos a -20 ° C para a quantificação dos principais HIV-1 de proteína da cápside p24 por ELISA após Fortin et al. 10. </li></ol> 7. Infecção do MDM com único luciferase Encoding Ciclo Virus <ol><li> A fim de determinar o impacto do parasita em HIV-1 a expressão do gene em MDM, adicionar, de acordo com o esquema delineado na Figura 1B, 10 ng de p24 (em 300 ul de meio de MDM) de qualquer NL4.3 Luc + Env - R + ( VSV-G), NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) ou NL4.3 Luc +Env - R + vírus nos poços correspondentes. </li><li> Incubar 2 horas a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> Lavar as células com 600 ul de PBS isento de endotoxina-3 vezes, adicionar o PBS suavemente e aspirar imediatamente. Adicionar 600 ul de meio MDM fresco por poço. </li><li> Incubar a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> Remover a infecção hr médio 72 seguinte e adicionar 200 ul de tampão de lise 1X (fornecido com o kit de ensaio de luciferase). Permitir que as células lisar à temperatura ambiente com agitação suave. Armazenar a -20 ° C. </li><li> Descongelar a placa e transferir 40 ul do lisado para uma placa de luminómetro de 96 poços; adicionar 100 uL de substrato de luciferase (fornecido com o kit de ensaio de luciferase) e medir a actividade (luciferase do pirilampo) luciferase num luminómetro seguindo as instruções do fabricante. </li></ol> 8. Os resultados representativos Usando nosso modelo de co-infecção, mostramos que exposure de P. falciparum a MDM diminui a sua susceptibilidade à infecção HIV-1. Com efeito, uma diminuição significativa (p &lt;0,05; 2 ANOVA, dia 12) na libertação de partículas virais, tal como medido por HIV-1 de proteína da cápside p24 no sobrenadante, é observada em MDM pré-tratados com parasitas (Figura 2A). Esta observação é confirmada em células infectadas por vírus que codificam um gene repórter da luciferase. MDM infecção com vírus tais albergando quer exógena de VSV-G ou de HIV-1 conduz a glicoproteínas significativamente a produção de luciferase (p &lt;0,05, teste t de Student-) menos em células expostas a P. falciparum (Figura 2B). É de notar que VSV-G-pseudotyped vírus produziu muito maior actividade de luciferase que os seus homólogos JRFLenv, isto devido à maior eficiência de infecção de VSV-G partículas pseudotyped 15. Dado que a exposição ao parasita impactos MDM ambos os tipos de vírus, isso sugere que ele influencia em alguma etapa ex gene viralpressão (Figura 2B). É também importante mencionar que a viabilidade celular não foi afectada pela exposição a MDM iRBC (dados não mostrados), indicando que a inibição observada é específica e não devido a mortalidade das células. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> Figura 1. A) O regime de Placa para a infecção com um vírus MDM replicativa totalmente Mock:. Células não infectadas. uRBC: células expostas a não infectadas células vermelhas do sangue. iRBC: células expostas ao Plasmodium falciparum infectadas células vermelhas do sangue. Bal: células infectadas com NL4.3Bal env Bal / uRBC:. Células expostas ao uRBC e infectados com NL4.3Bal env Bal / iRBC:.. Células expostas ao iRBC e infectados com NL4.3Bal env B) O regime de Placa para a infecção com o MDM único ciclo do vírus luciferase codificação de Mock:. células não infectadas. uRBC: células expostas a não infectadas células vermelhas do sangue. iRBC: células expostas a Plasmodium falciparum-infected células vermelhas do sangue. Δenv: células infectadas com NL4.3 Luc + Env - R + JRFL:. Células infectadas com NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). VSV-G: células infectadas com NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G) Δenv / uRBC:.. células expostas a uRBC e infectados com NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC: células expostas a iRBC e infectados com NL4.3 Luc + Env - R + JRFL / uRBC: células expostas ao uRBC e infectados com NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: células expostas ao iRBC e infectados com NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: células expostas a uRBC e infectados com NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G): vsv-g/iRBC. células expostas a iRBC e infectados com NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; Figura 2. . A) Efeito do Plasmodium falciparum em HIV-1 de produção virai no MDM MDM foram expostos a uRBC ou iRBC a uma razão de 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) durante 4 horas e lavou-se extensivamente. As células foram infectadas com 10 ng de p24 NL4.3Bal env durante 2 horas. Produção virai foi monitorada por ELISA para o HIV-1 p24 em células livres sobrenadante em pontos de tempo diferentes após a infecção virai inicial. Uma experiência representativa é mostrado B) Efeito do Plasmodium falciparum em HIV-1 de transcrição virais no MDM MDM foram infectadas com uRBC ou iRBC a uma razão de 75:1 (uRBC / iRBC:.. MDM). As células foram então infectadas com 10 ng de p24 do vírus de um único ciclo (ou NL4.3 Luc + Env - R +, NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) ou NL4.3 Luc + Env - R + (VSV- g)). A expressão da luciferase foi avaliada em células lisados ​​72 hr após a infecção pelo vírus inicial. Um experimento representativo é mostrado.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network.">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos ilustrado aqui duas abordagens diferentes para analisar o impacto do parasita da malária no HIV-1 ciclo viral, ou seja, por meio da análise, quer a expressão do gene virai ou a produção de progenitura do vírus e replicação em macrófagos derivados de monócitos. Abordagens semelhantes têm sido utilizados para a outra HIV-1-parasita co-infecções 16. No entanto, estes novos dados são um passo em frente na investigação da malária-HIV-1 co-infecções. . Na verdade, Diou et al 8 estudaram o efeito da hemozoin, parasitas não vivos, sobre o HIV-1 de replicação; de acordo com nossos resultados, eles observaram que hemozoin era por si só suficiente para inibir a produção viral por MDM, e não MDM. Usando o esquema descrito experimental, observou-se que P. falciparum exerce um efeito claro prejudicial sobre o ciclo replicativo do HIV-1 em macrófagos: uma inibição significativa da produção virai é observada em macrófagos pré-expostos a parasitas (Figure 2A) e um impacto específico do parasita na transcrição viral é ilustrado na Figura 2B. No entanto, não podemos deixar de fora quaisquer efeitos adicionais do parasita na entrada viral ou fusão (decapsidation), ou sobre pós-integração de mecanismos, tais como a síntese de proteínas ou montagem de partículas virais e brotação. Além disso, é possível que um impacto diferente sobre a replicação do HIV-1 seria obtida se o parasita foram adicionados quer ao mesmo tempo ou infecção MDM seguinte com o vírus. O nosso modelo in vitro de co-infecção fornece uma ferramenta poderosa para realizar investigações detalhadas de HIV-1 / p interacções falciparum na célula hospedeira. Por exemplo, a combinação desta disposição experimental com outras técnicas tais como quantitativa PCR em tempo real, o que pode ter como alvo e quantificar os passos específicos em retrotranscription viral e integração do genoma virai no genoma da célula hospedeira, são bastante viável e deve produzir INSI maisghts dos mecanismos envolvidos na co-infecções. Além disso, os ensaios específicos para avaliar os passos iniciais do ciclo viral (viral de fusão, decapsidation quantificação de entrada,) pode ser aplicado a este protocolo básico para analisar ainda mais o efeito sobre a replicação virai. Estas modificações mostram como flexível este protocolo é relativo HIV-1 quantificação e detecção: de facto, mesmo padrão ensaios de quantificação do HIV-1 usando transcriptase reversa marcado com trítio nucleótidos pode conseguir substituir o ELISA para o HIV-1 p24. Além MDM, esperamos nosso sistema para ser adaptável a outros tipos de células relevantes para o HIV-1-malária interacções, tais como monócitos e células dendríticas. O fato de que o MDM são células aderentes facilita a sua manipulação, permitindo fácil lavagem de iRBC que não tenham sido tomadas, ou que estão em contato com a MDM, sem eliminar os macrófagos. Essa vantagem não se aplica às células dendríticas e monócitos, que são cultivadas em suspensão, dificultando a siparação de iRBC uRBC e livre com essas células e atualmente estamos abordando este problema. O nosso sistema poderia também ser útil para estudar as interacções mais complexas, tais como os efeitos de Plasmodium-expostas derivados de monócitos células no ciclo de HIV-1 viral em outras células imunitárias, tais como CD4-células T positivas em co-cultura experimentos. Finalmente, o nosso protocolo poderia ser adequado para experimentos olhando para o efeito de P. iRBCs falciparum sobre o HIV-1 reativação em PBMC de HIV-1 indivíduos infectados. Declaração de ética Human PBMC foram obtidas do sangue de doadores saudáveis, em conformidade com as diretrizes do Comitê de Bioética do Centro Hospitalar de l&#39;Université Laval Centro de Pesquisa. O consentimento escrito foi obtido de todos os doadores de sangue.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicélula </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotoxina livre </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> Inactivado pelo calor a 56 ° C durante 30 min </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> Dissolvido em meio RPMI 1640, esterilizada por filtração </td></tr><tr><td> Meio de separação de linfócitos </td><td> Multicélula </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Brancos placas luminómetro </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS Macs separação columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> Separador VarioMacs </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina solução </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Raspador de células (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1830 </td><td></td></tr><tr><td> De 24 poços de cultura placas da célula </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 milímetros prato de cultura </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> GenScript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> De soro humano AB + </td><td> Vale Biomédica </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> De NaHCO3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de ensaio de luciferase </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> Glóbulos vermelhos humanos </td><td></td><td></td><td> Obtido purificada a partir de banco de sangue CHUL. </td></tr></tbody></table>

an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells

Plasmodium falciparum, o agente causador da forma mais letal de malária, e vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) estão entre os problemas de saúde mais importantes a nível mundial, sendo responsável por um total de 4 milhões de mortes anualmente 1. Devido às suas extensas sobreposição nas regiões em desenvolvimento, especialmente da África Subsariana, co-infecções com malária e HIV-1 são comuns, mas a interação entre as duas doenças é mal compreendido. Relatórios epidemiológicos sugerem que a infecção por malária transientemente aumenta a replicação do HIV-1 e aumenta a carga de HIV-1 viral em indivíduos co-infectados 2,3. Porque este viremia permanece elevada durante várias semanas após o tratamento com anti-maláricos, este fenómeno pode ter um impacto na progressão da doença e de transmissão. Os mecanismos imunológicos celulares por trás dessas observações foram estudadas apenas mal. Os poucos estudos in vitro Investigção de impacto da malária em HIV-1 demonstraram que a exposição a antigénios solúveis malária pode aumentar infecção HIV-1 e reactivação em células imunes. No entanto, estes estudos utilizaram extratos de células inteiras de P. falciparum esquizonte parasitas palco e células mononucleares do sangue periférico (PBMC), tornando-o difícil de decifrar qual componente da malária (s) foi responsável pelos efeitos observados e que as células hospedeiras alvo eram 4,5. Um trabalho recente demonstrou que a exposição de células imaturas derivados de monócitos dendríticas para a malária pigmento hemozoin aumentaram a sua capacidade de transferir o HIV-1 a células T CD4 + 6,7, mas que diminuiu o HIV-1 infecção de macrófagos 8. Para lançar luz sobre este processo complexo, uma análise sistemática das interações entre o parasita da malária e HIV-1 em diferentes populações de células humanas relevantes primário é extremamente necessárias. Várias técnicas para investigar o impacto de HIV-1 sobre a fagocitose de microrganismos eo efeito de agentes patogénicos tais sobre a replicação do HIV-1 têm sido descritos. Nós aqui apresentar um método para investigar os efeitos de P. falciparum infectadas eritrócitos sobre a replicação do HIV-1 em humanos primários macrófagos derivados de monócitos. O impacto da exposição parasita sobre o HIV-1 transcricionais / translacional eventos é monitorizada usando vírus de ciclo único pseudotyped em que um gene repórter da luciferase substituiu o gene Env enquanto que o efeito sobre a quantidade de vírus libertado pelos macrófagos infectados é determinada através da medição do HIV-1 de proteína da cápside p24 por ELISA em sobrenadantes de células.

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An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Nós desenvolvemos uma<em&gt; In vitro</em&gt; Malária-HIV-1 modelo de co-infecção para estudar o impacto da<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Sobre o ciclo replicativo do HIV-1 em humanos primários macrófagos derivados de monócitos. Este sistema versátil pode ser facilmente adaptado a outros tipos de células primárias sensíveis à infecção HIV-1.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

13.6K visualizações.  CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada. Nós desenvolvemos uma In vitro Malária-HIV-1 modelo de co-infecção para estudar o impacto da Plasmodium falciparum Sobre o ciclo replicativo do HIV-1 em humanos primários macrófagos derivados de monócitos. Este sistema versátil pode ser facilmente adaptado a outros tipos de células primárias sensíveis à infecção HIV-1.

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Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Imunologia e Infecção

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.