Este protocolo facilita a observação direta de várias alterações fenotípicas a um nível unicelular e permite o monitoramento contínuo da localização de proteínas e do tempo de expressão genética. A principal vantagem da microscopia de fluorescência é que é um método simples para monitorar vários processos biológicos, como a divisão celular e mudanças de morfologia celular em células vivas. Certifique-se de prestar especial atenção ao protocolo de preparação da amostra e explorar o software de microscópio para poder localizar as configurações e opções listadas neste protocolo.
Uma representação visual deste protocolo é fundamental porque permite que os usuários observem e aprendam os passos significativos da técnica à medida que configuram seus próprios experimentos. Comece rotulando uma alíquota de cinco a 50 microliteres da cultura celular de interesse com um corante de coloração de membrana apropriada e adicionando cinco microliters das células bacterianas vitrais em um deslizamento de tampa na parte inferior de um prato de cultura de fundo de vidro de 35 mililitros. Coloque uma laje de 11 milímetros de diâmetro sobre a amostra e toque suavemente para certificar-se de que a laje está plana contra o deslizamento da tampa.
Em seguida, adicione aproximadamente cinco microlitros de água ao redor da tampa para evitar que a almofada de agarose seque e permita que o prato de cultura se equilibre à temperatura dentro da câmara de incubação de um microscópio de desconvolução de alta resolução por 15 a 20 minutos. Para visualizar a amostra, use o botão de foco de ajuste grosseiro para certificar-se de que o objetivo está totalmente reduzido antes de inicializar o microscópio dentro do software de microscópio. Coloque uma gota de 1.517 óleo de índice refrativo no objetivo de imersão de óleo de 100x e transfira o prato de fundo de vidro contendo a amostra para o caixão de carcaça metálica.
Deslize suavemente o prato para dentro do grampo de palco, e use o botão de ajuste grosseiro para elevar o objetivo até que o óleo faça contato com o fundo de vidro do prato. Use a ocular e o botão de ajuste fino para colocar a amostra em foco e mude para o modo câmera. No software de imagem na janela Resolver 3D, selecione o ícone Design/Executar Experimento.
Uma nova caixa de diálogo aparecerá intitulada Design/Executar Experimento. Abra as guias Design e Secção na caixa de diálogo para definir o número de pilhas Z e a espessura da amostra. Para medir a espessura das células da amostra, ajuste gradualmente o plano Z usando as setas para cima e para baixo na caixa de diálogo Resolver 3D, fazendo com que as células saiam de foco como os limites superiores e inferiores para a Aquisição de Imagem.
Depois de ajustar a Transmissão percentual da intensidade da luz e a duração da Exposição para os canais selecionados individuais na caixa de diálogo Resolver 3D, clique em Lista de pontos para abrir a Lista de Pontos. Nas guias Design e Time Lapse, selecione a caixa de seleção Time Lapse e digite os parâmetros de lapso de tempo. Selecione a opção Lista Do Ponto de Visita e digite os pontos a serem imagens na caixa de texto, separando os pontos por írgulas ou hífens para sequências completas.
Em seguida, edite nomes de arquivos e locais de arquivo na guia Executar e selecione Reproduzir na caixa de diálogo Iniciar experimento para iniciar o experimento. Ao final da análise, abra os arquivos de imagem RAW de interesse em um programa de desconvolução apropriado e selecione a guia Processo e Deconvolve. Execute qualquer subtração manual de ruído de fundo e ajuste de contraste de brilho em qualquer ou todos os canais de comprimento de onda, conforme necessário, antes de salvar a imagem como um arquivo TIFF.
Para quantificação do comprimento do celular, abra os arquivos de imagem desconvolucidos no software fornecido pelo fabricante ou em software de imagem livre, como ImageJ, e abra a guia Ferramenta. Em seguida, selecione Medir distâncias e clique à esquerda nos pontos de partida e extremidade do arquivo de imagem desejado para medir o comprimento da célula. Para quantificação de sinal fluorescente, selecione Data Inspector.
Desenhe uma caixa com a opção Coluna/Linha definida para a dimensão específica de interesse e selecione a área com o sinal a ser quantificada. A adição de xilose para induzir uma cepa GGS 8 resulta em um fenótipo de seis células. Enquanto os controles vetoriais vazios parecem semelhantes às células de controle cultivadas na ausência de indutor.
A superprodução do estafilococos aureus gpsB interrompe a divisão celular em B.subtilis medida pela microscopia de lapso de tempo e quantificação do comprimento da célula. Além disso, os padrões de localização de FtsZ ou uma das proteínas associadas a essa proteína podem ser usados por um repórter para estudar e/ou identificar novos compostos antimicrobianos através da imagem de lapso de tempo e quantificação do comprimento celular. Certifique-se de usar um óleo com o índice de refração adequado, pois o índice de refração pode mudar dependendo da temperatura utilizada para a imagem.
A desconvolução pode ser realizada se o usuário quiser remover ruídos fora do foco, e a análise de dados envolvendo quantificação de sinal fluorescente e medidas de comprimento e largura da célula também podem ser realizadas.
