Este trabalho foi financiado em parte pela National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).

1. Construção de Lentiviral Repórteres luciferase A construção repórter de mamífero circadiano geralmente contém uma cassete de expressão no qual um promotor circadiano é fundido com o gene da luciferase. Ambas as estratégias de ligação e de recombinação baseada são comumente usados ​​para a clonagem de DNA. Como um exemplo, aqui descrevemos um método baseado em recombinação clonagem Gateway para gerar um P (Per2)-d repórter Luc lentiviral, em que a luciferase desestabilizado (d Luc) está sob o controle do promotor do rato Per2. <ol><li> A clonagem do promotor Per2. Use PCR para amplificar o fragmento de DNA Per2 promotor de 526 bp a montante do sítio de iniciação da transcrição a partir de um clone BAC Per2 rato 9-13, utilizando um iniciador directo (5&#39;-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 &#39;) e um iniciador reverso (5&#39; CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC-TTGG-3 &#39;), e do clone em pENTR5&#39;-TOPO vector (Invitrogen) para gerarpENTR5&#39;-P (Per2). </li><li> Clonagem de d Luc. O Luc d contém o gene da luciferase do pirilampo e de uma sequência PEST C-terminal por degradação de proteínas rápida como anteriormente descrito 21. Use PCR para amplificar o fragmento de DNA d Luc, e clone em pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen) para gerar pENTR / Dd Luc. </li><li> Construção do vector repórter. Misture os dois plasmídeos pENTR, pENTR5&#39;-P (Per2) e pENTR / Dd Luc, com o vetor de destino lentiviral pLV7-BSD (BSD, blasticidina gene de resistência), e realizar a reação de recombinação usando Clonase para gerar um pLV7-BSD-P (Per2)-d repórter Luc (Figura 1). pLV7-Bsd é uma versão modificada (feito no nosso laboratório) de pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), em que o vírus da hepatite da marmota pós-transcricionais reguladoras de elementos (WPRE) sequências de 22 foram inseridos imediatamente a jusante da expressão de ca<html> ssette para aumentar a expressão do gene. </li></ol> 2. Produção de Partículas Lentiviral 1. Células de sementes 293T (dia 1) <ol><li> Crescer de rim embrionário humano (HEK) 293T células até à confluência em DMEM 90-100% normal suplementado com FBS a 10% e penicilina-estreptomicina 1x-Glutamina (PSG) em placas de cultura de 10 cm. (Células com crescimento acelerado, com número de passagens baixo são essenciais para transfecção eficiente.) </li><li> Antes de semear as células para transfecção, revestimento placas de cultura de 6 poços por adição de 1 ml de 0,001% de poli-L-lisina em PBS a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Aspirar a solução e lavar uma vez com 1x PBS antes da utilização. </li><li> Dissociar células 293T com tripsina e de sementes 0,75 x 10 6 células para cada poço das placas pré-revestidas com 2 ml de DMEM regular. Redemoinho as placas cuidadosamente para se obter uma distribuição uniforme de células em cada poço. Crescer as células na incubadora a 37 ° C durante a noite. </li></ol>tep &quot;&gt; 2 transfecção. Transient via CaPO4 / precipitação do DNA (dia 2) <ol><li> Observe as células semeadas a partir do dia 1. Celular deve chegar a confluência de 80-90%. </li><li> Preparar a mistura de transfecção do plasmídeo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por adição de 2 ug de ADN de um plasmídeo repórter lentiviral (por exemplo, pLV7-P (Per2) d-Luc; Liu lab) e os três vectores de empacotamento (1,3 ug Gag / Pol, 0,5 ug Rev, e 0,7 ug VSVG; Invitrogen). Como controlo, tanto para a transfecção e infecção subsequente, que geralmente incluem um poço adicional na transfecção de um vector lentiviral expressão da GFP, pLV156-CMV-EGFP (Figura 1A), abrigando proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), sob o controlo do promotor de CMV como descrito previamente 20. </li><li> Adicionar 100 ul de 0,25 M de CaCl2 (diluído com DNase / RNase DDH 2 O estoque de 2,5 M) à mistura de plasmídeo no passo 2 e misturar bem. Em seguida adicionar 100 ul de solução de BBS 2x (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, pH 6,95) e misturar suavemente mas profundamente. Incubar a mistura de ADN à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Enquanto espera, aspirar médio a partir de células 293T e altere a 2 ml de meio fresco. Regressar a placa à incubadora durante pelo menos 10 min para equilibrar o pH do meio antes da transfecção. </li><li> Adicionar mistura de transfecção a partir do passo 3 para células 293T gota a gota. Placa Mexa suavemente e observar a formação de partículas sob um microscópio. Incubar em 5% de CO2, 37 ° C durante a noite. (Formação de partículas finas de CaPO precipitado 4 / DNA é crítica para a transfecção eficiente.) </li></ol> 3. Partículas virais de colheita (dias 3-4) <ol><li> Cerca de 16 horas após a transfecção (dia 3), através da qual as células de tempo deve chegar a 100% de confluência, aspirar meio de células e substituir com 2 ml de DMEM fresco regular. Incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> No dia 4, avaliar a eficiência de transfecção pela observação de expressão EGFP em transfection células de controlo (A eficiência de transfecção de 90-100%, com maior expressão EGFP é uma previsão fiável de uma boa preparação viral.) </li><li> Recolher o meio contendo segregadas, partículas virais infecciosas. Centrifugar a&gt; 2000 xg durante 5 min para remover residuais células 293T e recolher o sobrenadante contendo vírus. Alternativamente, o meio pode ser limpo com um filtro de membrana de 0,45 um. As partículas virais estão prontos para utilização na infecção. </li></ol> 3. A infecção de células 3T3 1. As células 3T3 de semente (dia 3) Dividir e número de sementes apropriada (~ 12000) de células 3T3 numa placa de 12 poços para se obter 20-30% de confluência por dia seguinte. Incubar a 37 ° C durante a noite. 2. Infectar as células 3T3 (dia 4) <ol><li> Observe as células semeadas. Confluência de 20-30% (menos do que 50%) é desejado para a infecção. </li><li> Adicionar polibreno a uma concentração final de 5 ug / ml para o meio recolhido contendo viralpartículas. Misturar bem por pipetagem. </li><li> Aspirar meio de células 3T3 e adicionar 1 ml da mistura acima viral por poço. Incubar a 37 ° C durante a noite. (Polybrene é utilizado para melhorar a eficiência de infecção, mas não é absolutamente necessário. Como pode ser tóxico para algumas células, o teste prévio é recomendado.) </li></ol> 3. Selecione as células infectadas (dia 5 em diante) <ol><li> Vinte e quatro horas após a infecção, aspirar meio contendo polibreno vírus e de células infectadas, lavar uma vez com PBS 1x e mudar para meio fresco. Incubar a 37 ° C durante a noite para a recuperação e crescimento. </li><li> Quando confluentes (geralmente 1-2 dias mais tarde), dividir as células e incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte meio, aspirado a partir de células (&lt;50% de confluência é desejada) e substitua com meio fresco contendo 10 ng / ml para seleccionar blasticidina para estavelmente transduzidas células. (Blasticidina matar-curva tem de ser determinado empiricamente para uma linha de células particular.) </li><li&gt; Mudar para meio fresco contendo blasticidina cada 2-3 dias para a selecção contínua de antibiótico-resistentes células que expressam os repórteres de relógio (geralmente 4-6 dias no total). </li></ol> 4. Gravação de bioluminescência de Células Reporter 1. Repórter células de sementes Propagar células resistentes blasticidina repórter e dividida em placas de cultura de 35 mm. Incubar a 37 ° C até à confluência. Nós normalmente preparar ≥ 3 pratos para cada linha de células repórter em cada condição para fenotipagem circadiano. 2. Sincronização e mudança de meio de gravação <ol><li> Aspirar meio a partir de células confluentes repórter, lavar uma vez com PBS, e substituir com DMEM contendo 10 mM de forskolin (ou 200 nM de dexametasona). Incubar a 37 ° C durante 1 hora, para sincronizar as células. (Alternativamente, as células podem ser sincronizados por 23 ciclos de temperatura ou de choque de soro 24.) </li><li> Enquanto espera, prepare recordeing meio para células 3T3 como se segue: 1x DMEM (HyClone) contendo 10% FBS, 1x pH Pen / Strep / Gln, 1 uM de forscolina, 1 mM de luciferina, 25 mM de HEPES, 7,4. Soro ea concentração de forskolin pode ser determinada empiricamente. No caso de células muito fraca, média livre de vermelho de fenol podem ser usados. </li><li> No final do tratamento de forscolina, aspirar meio e substituir por meio de gravação feita recentemente. </li></ol> 3. Gravação bioluminescência de células repórter <ol><li> Após a mudança médio, cobrir placas de cultura com 40 milímetros lamínulas estéreis e selo em lugar com graxa de vácuo para evitar a evaporação. </li><li> Carregar os pratos para o luminómetro LumiCycle, que é mantido no interior de um conjunto de incubadora a 36 ° C sem H 2 O ou CO 2. </li><li> Iniciar gravação em tempo real de bioluminescência. Nós normalmente gravar ritmos durante 1 semana, seguido por troca de meio e de gravação contínua para uma segunda semana (ver Savelyev et al. Para mais pormenores) 25. (Para gravação de 96 nósll, placas Synergy SL2 foi usado como o dispositivo de gravação, ver Discussão 1.1 para detalhes). </li></ol> 5. Análise de Dados e Apresentação Células repórter facilitar alta resolução de gravação de luminescência quantitativa, fundamental para determinar efeitos fenotípicos sobre a função do relógio circadiano. Para obter parâmetros circadianos, incluindo fase, a duração do período, amplitude, ritmo e taxa de amortecimento, usamos o programa de Análise LumiCycle (Actimetrics) para analisar os dados de bioluminescência 5,14. Resumidamente, os dados em bruto são de linha de base equipado primeiramente, e da linha de base-subtraídas dados são montados a uma onda seno, a partir da qual os parâmetros são determinados. Para amostras que mostram ritmos persistentes, bondade do ajuste de&gt; 90% é geralmente obtida. Devido à elevada transiente bioluminescência após mudança de meio, que normalmente excluir o primeiro ciclo de análise de dados. Para a apresentação dos dados, que geralmente traçar dados brutos (bioluminescência, contagens / s) contra time (dias). Quando necessário, os dados de linha de base, podem ser representados subtraídos para comparar a amplitude e fase. 6. Resultados representativos 1. Fase específicos repórteres circadianos O relógio circadiano baseia-se num mecanismo de feedback negativo bioquímico 1. O ciclo de realimentação núcleo é constituído de ativadores transcricionais Bmal1 e relógio, e Pers repressores e Crys, que atuam sobre os elementos circadianos E / E&#39;caixa-Enhancer para produzir a expressão do gene rítmica (com fase de manhã, por exemplo, Rev-erb α). O laço núcleo regula e integra pelo menos dois outros circadianos cis-elementos, o elemento de ligação DBP/E4BP4 (D-box, para fase de dia, por exemplo, Per3) eo elemento ROR / REV-ERB ligação (RRE, por fase de noite, por exemplo, Bmal1) 17. Regulação combinatória por múltiplos elementos circadianos pode gerar novas fases intermediárias. Por exemplo, a transcrição Cry1ção é mediada por todos os três elementos circadianos (isto é, os elementos E, / E&#39;-box e D-box no promotor e RREs no primeiro intrão do gene Cry1), dando origem ao distinto Cry1 fase noite tempo 13. Com base nestes mecanismos de regulação dos genes, foram geradas quatro construções repórter diferentes: P (Per2) d-Luc e P (Cry1)-D repórteres Luc contendo tanto E / E&#39;-caixa e da caixa D-elementos na região reguladora 17, 26,27; P (Cry1) - Intron-d Luc representando regulação combinatória por todos os três elementos (ou seja, E / E&#39;-box, D-box, e RRE) 13,17, e P (Bmal1)-d Luc regulada exclusivamente por RRE 9,17,19,21. Introduzimos estas repórteres em células 3T3 para produzir as fases antecipadas distintos de expressão repórter (Figura 2). 2. Knockdown do gene através de RNAi e farmacologicamente active compostos Quando a eficiência de transfecção é elevada, siRNA sintético pode ser transientemente transfectados para células de derrubar a expressão do gene. Quando a transfecção é tecnicamente difícil, um vector de expressão podem ser estavelmente shRNA transduzida em células por meio de infecção por lentivírus, de modo a que shRNA produzido pela célula é processada para siRNA para knockdown do gene (KD). Apresentamos aqui os efeitos de KD Cry1 e cry2 genes utilizando siRNA em células U2OS (Figura 3A) e em células 3T3 shRNA, utilizando um vector de expressão de Gateway pLL3.7 9 (Figura 3B). Além de células 3T3, o modelo U2OS tornou-se outro modelo de relógio proeminente celular em grande parte porque ele atende aos requisitos fundamentais para high-throughput screening de bibliotecas disponíveis comercialmente siRNA humanos (por exemplo, origem humana, capaz de gerar fortes ritmos circadianos, função validada de todos os conhecidos genes do relógio, e passíveis de transfecção altamente eficiente egravação de luminescência quantitativa). Em ambos os tipos de células, RNAi mediada KD resultou em fenótipos de relógio consistentes com knockout rato anterior (KO) e estudos celulares KD 5,10,11,28. Por exemplo, Cry1 KD duração do período diminui e reduz a persistência do ritmo, enquanto cry2 KD prolonga período. Além disso, pequenas moléculas seleccionadas podem ser utilizadas para farmacologicamente alvo e a função da proteína perturb (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig1.jpg" /> Figura 1. O lentivírus mediada por sistema de entrega de genes. (A) Diagrama esquemático de dois P lentiviral (Per2)-D vetores repórter Luc e uma CMV-EGFP construir. Apenas a região para a integração no genoma da célula hospedeira é mostrado. Em ambas as construções repórter, a transcrição de d Luc está sob o controlo directo do promotor Per2. No pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vetor (recombinação baseada clonagem), um gene de resistência à blasticidina coexpressas (BSD) facilita a selecção de células infectadas. No pLV156-P (Per2) d-Luc vector (ligadura baseado clonagem), tradução EGFP é mediada por um local interno de entrada do ribossoma (IRES) a jusante da d Luc, permitindo por meio de observação visual e triagem por FACS de células infectadas. Além disso, um promotor de SV40 / terminador (P / T), é usado como isolante (ver discussão 1.3). No vector de controlo CMV-EGFP, expressão EGFP está sob controle de um promotor de CMV forte. (B) as imagens fluorescentes de GFP-transfectadas e infectadas que expressam as células. Tipicamente, conseguimos alta eficiência tanto na transfecção transitória de células 293T e na infecção por lentivírus de linhas de células do nosso interesse, como indicado pela expressão de GFP nestas células. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig1large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 2" src = &quot;files/ftp_upload/4234/4234fig2.jpg /&quot; /&gt; Figura 2. Fase a expressão específica de repórteres em células 3T3 de bioluminescência Os vectores lentivirais repórter utilizados nesta experiência são pLV7-Bsd-P (Per2) d-Luc, P (Cry1) d-Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, e P (Bmal1) d-Luc. Cada repórter apresenta uma fase distinta de oscilação, como indicado pelas setas. Enquanto o Per2 e Cry1 bioluminescência unidade promotores de pico na manhã de dia-fases e do promotor na fase Bmal1 noite, regulação combinatória pelo P (Cry1) - Intron abrigar E-box, D-box, e elementos RRE confere fase noite de bioluminescência de pico . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig3.jpg" /> Figura 3. Perturbação genética e farmacológicas dos ritmos circadianos em células de bioluminescência repórter. (A) Efeitos de Cry1 e cry2 knockdown por siRNAs sobre ritmos celulares de células repórter U2OS. O luminómetro LumiCycle foi utilizado para a gravação de bioluminescência de células em pratos de 35 mm. A Figura é adaptado de Referência n º 10, com a permissão da Elsevier (2009). (B) Efeitos da cry2 knockdown por shRNAs sobre ritmos celulares de células repórter 3T3. Um vector de Gateway pLL3.7 contendo uma cassete de U6-shRNA foi usada para knockdown cry2 gene. shRNA2 tem uma eficiência melhor do que knockdown shRNA1 como determinado por análise de Western blot (dados não mostrados). Um luminómetro Synergy foi utilizado para a gravação de bioluminescência de células numa placa de 96 poços. As configurações de gravação são as seguintes:. Incubadora de temperatura, 33 ° C, o tempo de integração de 15 segundos, o tempo de intervalo, 30 min (C) Efeitos de inibidores de moléculas pequenas em celritmos intracelulares de células repórter U2OS. Chir99021 Roscovitina e são inibidores dirigidos contra a GSK-3 e CDK, respectivamente. O sistema ViewLux (Chir99021 ensaio) e um luminómetro Tecan (Roscovitina ensaio) foram utilizadas para as gravações de bioluminescência de células em 384 poços. Figura é adaptado de Referência # 19 (Copyright 2008 Academia Nacional de Ciências dos EUA). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

Não há conflitos de interesse declarados.

1. Modificações protocolo atual 1.1 dispositivos de gravação e considerações de rendimento Devido à sua disponibilidade comercial, a LumiCycle (Actimetrics) tornou-se o dispositivo de luminimetro mais comumente utilizado automatizado para gravação em tempo real 4,5,9,19,29-31. O LumiCycle emprega tubos fotomultiplicadores (PMT), como detectores de luz, que proporcionam sensibilidade extremamente elevada e baixo ruído 14, e, por consegui...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Para o crescimento celular normal </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Para luminometria </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gln (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferina </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> Forskolin </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Todos os outros produtos químicos </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> De cultura de tecidos incubadora </td><td></td><td></td><td> 5% de CO2 a 37 ° C </td></tr><tr><td> Capuz de cultura de tecidos </td><td></td><td></td><td> BSL-2 certificado </td></tr><tr><td> Light &amp; fluorescente microscópio </td><td></td><td></td><td> O contraste de fase opcional </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

Nos mamíferos, muitos aspectos do comportamento e fisiologia, tais como ciclos de sono-vigília e metabolismo do fígado são regulados pela endógenos relógios circadianos (revisado 1,2). O sistema de cronometragem circadiano é uma rede multi-oscilador hierárquica, com o relógio central, localizado no núcleo supraquiasmático (SCN) a sincronização e coordenação de relógios SCN-extra e periférico em outro lugar 1,2. As células individuais são as unidades funcionais para a geração e manutenção de ritmos circadianos 3,4, e estes osciladores de diferentes tipos de tecidos de um organismo a percentagem notavelmente semelhante mecanismo de feedback negativo bioquímico. No entanto, devido a interacções a nível de rede neuronal no SCN e através rítmicos, pistas sistémicos ao nível dos organismos, os ritmos circadianos no nível organismal não são necessariamente células autónoma 5-7. Em comparação com estudos tradicionais de actividade locomotora in vivo e ex vivo explantes SCN, cell com base em ensaios in vitro permitir a descoberta de células autônomas defeitos circadianos 5,8. Estrategicamente, baseados em células modelos são mais tratáveis ​​experimentalmente para a caracterização fenotípica e rápida descoberta de mecanismos de clock básico 5,8-13. Porque os ritmos circadianos são dinâmicos, medições longitudinais com alta resolução temporal são necessários para avaliar a função do relógio. Em anos recentes, a gravação em tempo real usando a bioluminescência de luciferase do pirilampo, como repórter tornou-se uma técnica comum para o estudo de ritmos circadianos em mamíferos 14,15, uma vez que permite o exame da persistência e da dinâmica de ritmos moleculares. Para monitorar a célula-autónomos ritmos circadianos de expressão do gene, os repórteres de luciferase pode ser introduzido em células através de transfecção transiente 13,16,17 ou transdução estável 5,10,18,19. Aqui descrevemos um protocolo de transdução estável usando lentivírus mediada entrega de genes. Tele sistema vector lentiviral é superior aos métodos tradicionais, tais como a transfecção transiente e transmissão germinal devido à sua eficácia e versatilidade: ela permite a entrega eficiente e a integração estável no genoma do hospedeiro de ambos dividindo e não as células em divisão 20. Uma vez que uma linha celular repórter é estabelecida, a dinâmica da função de relógio pode ser examinado através da gravação de bioluminescência. Nós primeiro descrever a geração de P (Per2)-D linhas repórter Luc, e em seguida, apresentam dados deste e de outros repórteres circadianos. Nestes ensaios, os fibroblastos 3T3 de rato e células de osteosarcoma humano U2OS são utilizados como modelos celulares. Também discutimos várias formas de utilizar esses modelos de relógio em estudos circadianos. Métodos descritos aqui podem ser aplicados a uma grande variedade de tipos de células para o estudo da base molecular e celular do relógio circadiano, e pode ser útil na resolução de problemas em outros sistemas biológicos.

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Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

monitoring-cell-autonomous-circadian-clock-rhythms-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

22.1K visualizações.  The University of Memphis. Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...