<p class="jove_title"> Reação reversa Transcriptase </p><p class="jove_content"> Vire bloco de aquecimento a 70-80 ° C e 42 ° C. Banhos de água também pode ser usado nesta etapa. Se estiver usando blocos de aquecimento, coloque um pouco de água para que o calor é uniforme. </p><ol><li> Reação priming <ol><li> Tome 3 mg de RNA </li><li> Ajustar o volume para 13 mL com água livre de RNase </li><li> Adicionar 2,5 mL de aleatório hexâmero primers (2mg/ml) </li></ol></li><li> Misturar bem e incubar a 70-80 ° C por 8 minutos. Em seguida, coloque, em gelo por 5 min. </li><li> Prepare RT cocktail (14,5 mL / rxn): <br /><br /><table border="0"><tbody><tr><td> <strong>Componente</strong> </td><td> <strong>Volume</strong> </td></tr><tr><td> Tampão 5X First Strand </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT <br /></td><td> 3 mL </td></tr><tr><td> Mix dNTP aminoallyl-25X </td><td> 1,2 mL </td></tr><tr><td> SuperScript II RT (200U/μl) </td><td> 2,3 mL </td></tr><tr><td> Água <br /></td><td> 2,0 mL </td></tr></tbody></table><br /> * Para as reacções n, prepare Mix Master de n 0,5 alíquotas de cocktail para garantir que você não vai acabar. <br /><br /></li><li> Adicionar 14,5 mL de reações resfriado. </li><li> Mix (não vortex) e incubar a 42 ° C por 3-4 horas </li><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário. </li></ol><p class="jove_title"> Hidrolisar RNA </p><ol><li> Para cada amostra, adicionar 3 mL de NaOH 1 N e 0,6 mL de 0,5 M EDTA. (Final conc.s = NaOH 100mM, EDTA 10mM) </li><li> Misturar e incubar a 65 ° C por 10 minutos. </li><li> Neutralize adicionando 33,6 mL HEPES 1M, pH = 7,0 (final conc .= 500mM HEPES) </li><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário. </li></ol><p class="jove_title"> Purificação de reação: Remoção de unincorporated aa-dUTP e aminas livres </p><p class="jove_content"> <em>Nota:</em> Este protocolo de purificação é modificado a partir da PCRpurification QIAquick Qiagen protocolo kit. A lavagem de fosfato e buffers de eluição são substituídos pela Qiagen buffers fornecidos porque os buffers Qiagen contêm aminas livres que competem com a reação de acoplamento Cy corante. As colunas do kit de mini-prep também pode ser usado. </p><ol><li> Mistura de reacção cDNA com 300 ml (ou volume de reação 5X = mL 336) tampão PB (Qiagen fornecido) e transferir para a coluna QIAquick. </li><li> Coloque a coluna em um tubo de coleta de 2 ml (Qiagen fornecido) e centrifugar a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. Tubo de coleta vazio. </li><li> Para lavar, adicionar 750 mL de fosfato tampão de lavagem (não Qiagen) para a coluna e centrifugar a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. </li><li> Esvaziar o tubo de coleta e repetir a lavagem 750 mL e etapa de centrifugação. </li><li> Esvaziar o tubo de coleta e centrifugar a coluna um adicional de 1 minuto na velocidade máxima. </li><li> Transferência da coluna para um novo microtubo de 1,5 mL e com cuidado, 30 mL de fosfato tampão de eluição. (Ver secção preparação da solução) </li><li> Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Eluir por centrifugação a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. </li><li> Eluir uma segunda vez (com outra mL 30 de tampão de eluição fosfato) no mesmo tubo, repetindo as etapas 6-8. O volume de eluição final deve ser ~ 60 mL. </li><li> A quantidade de cDNA podem ser quantificados nesta fase: <br /> ng cDNA = (fator de diluição) (OD260) (37) (volume total eluído da coluna) </li><li> Amostra seca em uma velocidade vac a 45 ° C. </li><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário. </li></ol><p class="jove_title"> Acoplamento aa-cDNA para Cy Ester Dye </p><ol><li> Ressuspender aminoallyl marcado cDNA com 10 ml 50 mM bicarbonato de sódio, pH = 9,0, se necessário. (Esta reserva deve ser feita nova a cada duas semanas) </li><li> Trabalhando em um lugar escuro, adicione a sonda a um tubo do corante Cy apropriado. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para voltar a suspender o corante. </li><li> Incubar a reação de uma hora no escuro à temperatura ambiente. (Incubação pode ir até duas horas) </li></ol><p class="jove_title"> Purificação reação II: Remoção de corante desacoplado </p><ol><li> À reação 35 mL adicionar 100 mM pH 5,2 NaOAc. Misture bem. </li><li> Adicionar 250 mL (ou volume de reação 5X = 225 mL) Buffer PB (Qiagen fornecido) para cada amostra e misture pipetando para cima e para baixo. </li><li> Coloque a coluna QIAquick em um tubo de coleta de 2 mL (Qiagen fornecido), aplicam-se a amostra para a coluna, e centrifugar a ~ 13.000 para 1 minuto. Tubo de coleta vazio. </li><li> Para lavar, adicionar 0,75 mL de tampão PE (Qiagen fornecido) para a coluna e centrifugar a ~ 13.000 para 1 minuto. </li><li> Repita o passo 4. </li><li> Tubo de coleta vazio e coluna centrífuga para um 1 minuto adicional na velocidade máxima. </li><li> Coloque em uma coluna limpa microtubo de 1,5 mL e adicionar 30 mL cuidadosamente tampão EB (Qiagen fornecido) para o centro da membrana da coluna. </li><li> Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Eluir por centrifugação a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. </li><li> Eluir pela segunda vez no mesmo tubo, repetindopassos 7-9. O volume final deve ser eluída ~ mL 60. </li></ol><p class="jove_title" align="left"> Análise da reação de Rotulagem </p><p class="jove_content" align="left"> A quantidade de cDNA e etiqueta pode ser quantificado nesta fase: </p><ul><li> Medida OD 260, 550 e 650 (em branco é a água.) Use o programa microarray nanodrop. </li><li> Calcular o pmol de corantes incorporação e DNA pmol e nuc / corante relação com as equações abaixo: <br /><br /> nucleotídeos pmol = [OD260 * volume (mL) * 37 ng / mL * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol </li></ul><p class="jove_content"> <em>Nota:</em> 1 OD260 = 37 ng / mL para cDNA; 324,5 pg / pmol peso molecular médio de um dNTP) <br /> pmol Cy3 OD550 = volume * (mL) / 0,15 <br /> pmol Cy5 = OD650 * volume (mL) / 0,25 <br /> nucleotídeos / relação dye = cDNA pmol / pmol Cy dye </p><p class="jove_content"> Se você estiver usando nanodrop, já dá pmol / mL para cada corante. Você só precisa multiplicar esse número por volume para obter a incorporação de corantes totais pmol. </p><p class="jove_content"> <em>Nota:&gt;</em> 150-200 pmol de incorporação de corante por amostra e uma proporção de menos de 20 nucleotídeos / moléculas de corante é ideal para hibridizações. </p><ul><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C no escuro. <ul><li> Combine sondas a ser hibridizado juntos e seco no speedvac a 42 ° C. </li><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até estar pronto para hyb. </li></ul></li></ul><p class="jove_title"> Pré-hyb slides </p><ol><li> Slides lugar rosto para baixo sobre RT 100 mL de água em um suporte de lâmina limpa vermelha por 3-5 minutos </li><li> Encaixe a lâmina seca, colocando a face para cima em um bloco de aquecimento 100 ° C por alguns segundos - relógio para a condensação de desaparecer </li><li> UV ligação transversal a lâmina de 250 mJoules (Digite 2500 para o reticulador UV) </li><li> Slides hidratar por imersão em pré-aquecido a água 42 C °. Spin-5 min a 700 RPM na RT. </li><li> Slides incubar em jarra de Coplin 50ml contendo pré-aquecido pré-hyb (5XSSC, BSA 1%, 0,1% SDS) para pelo menos 45 minutos @ 42 ° C, e de incubação pode ir mais longe, se necessário. <br /><br /> 50 buffer de pré-hyb mL: 12,5 mL 20x SSC, 10 ml BSA 5%, 0,5 ml SDS 10%, 27 mL de água <br /><br /></li><li> Dip slides na pré-aquecido a água (42 ° C) e agitar um par de minutos para remover o pré-hyb buffer. </li><li> Enxágüe em isopropanol e spin 5 min a 700 rpm, temperatura ambiente, para secar. </li></ol><p class="jove_title"> Amostras preparando para a hibridização </p><ol><li> Ressuspender sonda em água (volumes são apresentados abaixo) <br /><br /><table border="0"><tbody><tr><td> Para vol total. = 30μl <br /></td><td> Para vol total. = 35μl <br /></td><td> Para o total vol .= 40μl <br /></td><td></td></tr><tr><td> 19,8 mL de água <br /></td><td> 23,55 mL de água <br /></td><td> 27,2 mL de água <br /></td><td><br /></td></tr><tr><td> 1,5 mL </td><td> 1,5 mL </td><td> 1,5 mL </td><td> 10 mg / ml de DNA de esperma de salmão (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1,2 mL </td><td> 1,2 mL </td><td> 1,2 mL </td><td> 12,5 mg / ml tRNA </td></tr><tr><td> 4,5 mL </td><td> 5,25 mL </td><td> 6 mL </td><td> 20XSSC (final 3x) </td></tr><tr><td> 3 mL </td><td> 3,5 mL </td><td> 4 mL </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table><br /> <em>Nota:</em> A ordem de adição dos reagentes são importantes. Não preparar mix master. <br /><br /></li><li> Ferva por 5 minutos, depois de spin 5 minutos a 14.000 rpm. Esfriar por 2 min à temperatura ambiente. </li></ol><p class="jove_title"> Hibridização </p><ol><li> Adicionar 10-12 mL de 3X SSC aos poços da câmara de hibridação em cada ponta e no meio. </li><li> Adicionar um deslizamento levantador limpa para a área apropriada da lâmina e gentilmente carga em solução de hibridização (30 mL -40). Deve haver em cada amostra adicional borda da lamínula. </li><li> Coloque o slide na câmara. Aperte os parafusos e colocar em banho-maria a 65 ° C durante a noite. Não coloque a câmara diretamente sobre o fundo do banho-maria. Coloque um bloco no topo da câmara superior para manter tudo no lugar. Mantenha a tampa do banho de água para proteger as amostras sensíveis à luz. </li></ol><p class="jove_title"> Hyb Lava </p><ol><li> Preparar os buffers seguinte: <ul><li> SSC 1X, SDS 0,05% </li><li> 0,06 X SSC </li></ul></li><li> Depois de a câmara de incubação de hibridação unseal. Remove o slide da câmara, tomando cuidado para não perturbar a lamela. </li><li> Para remover lamelas, lâminas de submergir em um prato quente contendo 1X SSC, 0,05% SDS lamela tampão de lavagem de frente para o fundo do prato. A lamela cairá movendo o lado deslize para o lado. </li><li> Após a lamínula é retirada, coloque o slide em um rack de um banho quente fresco com 1XSSCm SDS 0,05%. Agitar por alguns minutos </li><li> Transferência de slides mais rack para um banho de 0,06 X SSC. </li><li> Transferência de slides para outro baª de 0,06 X SSC contendo um rack novo, apagando o slide sobre um papel toalha para remover o máximo tampão contendo SDS-quanto possível antes de colocar no banho fresco. </li><li> Agitar slides para um par de minutos. </li><li> Girar imediatamente à temperatura ambiente por 5 min @ 700 rpm, em seguida, slides estão prontos para fazer a varredura. Loja no escuro até digitalizada. </li></ol>

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	<li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for.">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> <em style='font-style: italic'>Microarrays &amp; TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization</em>. , .</li><li>Gilbert, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+&amp;+Hybridization+of+probed+labels.">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays &amp; Hybridization of probed labels.</a> , .</li><li>Hedge, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II.">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , .</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AA-dUTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A0410</td>
<td>5-(3-aminoallyl)-2&#x2019;deoxyuridine-5&#x2019;-triphosphate</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2035-01</td>
<td>100 mM dNTP Set PCR grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Random Hexamer primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2166-01</td>
<td>3mg/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperScript III RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>80800444</td>
<td>200U/&#x03BC;L</td>
</tr>
<tr>
<td>CyDye&#x2122;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN5661</td>
<td>Post-Labelling Reactive Dye Pack</td>
</tr>
<tr>
<td>QIAquick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>PCR Purification kit</td>
</tr>
<tr>
<td>1M K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KPO4</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:
9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate wash buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.
** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate elution buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Carbonate Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.
Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

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Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays