Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional para a Saúde Mental, e da National Science Foundation. Um agradecimento especial ao Dr. Jen Gutzman, Amanda Dr. Dickinson e outros membros do laboratório SIVE para muitas discussões úteis e críticas construtivas, e Olivier Paugois para criação de peixes especialista.

1. Preparando agulhas microinjeção e Bonde celular <ol><li> Encha Eppendorf CellTram óleo aparelho microinjector com óleo mineral de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Prepare agulhas microinjeção puxando tubos capilares utilizando Sutter extrator agulha instrumentos. </li><li> Montar a agulha na micromanipulador Eppendorf CellTram conectado. </li><li> Parta cuidadosamente a ponta da agulha. Para tamanho da ponta uniforme, medir com um micrômetro, ou comparar a uma agulha de referência. </li><li> Encher o comprimento da agulha com óleo, usando o CellTram para empurrar para baixo o comprimento de petróleo, tendo o cuidado para evitar as bolhas. </li></ol> 2. Preparando os embriões <ol><li> Criar buracos em uma placa de agarose a 1%, revestida com uma ponta de pipeta de 1-200 uL, e remover tampões de agarose. Preencha prato com media de embriões (feita de acordo com Westerfield 25). </li><li> Utilizando uma pinça, embriões dechorionate sob estereomicroscópio. </li><li> Transferência de embriões dechorionatedem agarose prato revestido. </li><li> Para anestesiar os embriões, adicionar tricaina (0,1 mg / ml) ao prato de agarose até embriões parar de se mover (feito de acordo com Westerfield 25). </li></ol> 3. Drenagem do eCSF <ol><li> Orientar os embriões com as caudas dos orifícios da agarose e os seus lados posteriores mais próximos do micromanipulador, permitindo a visualização do lado dorsal do cérebro. </li><li> Posicionar a agulha no rhombomere 0/1 dobradiça-ponto ou ponto mais largo do cérebro posterior esquerdo (Figura 1A). </li><li> Cuidadosamente placa telhado perfurar do ventrículo rombencéfalo tendo a certeza de não passar a profundidade do cérebro para a gema. </li><li> Drenar o eCSF usando o CellTram e recolher fluido na agulha de microinjecção. Tenha cuidado para evitar quaisquer células. </li></ol> 4. Coletar a eCSF para análise de composição <ol><li> Uma vez que o eCSF é recolhida na agulha, cuidadosamente parar de aspiração do CellTram. </li><li> Move o prato para fora sob a agulha e posicionar a agulha com cuidado para um tubo que contém o tampão desejado. </li><li> Usando o CellTram, drenar o eCSF para fora da agulha para o buffer de tentar evitar a contaminação da solução com óleo. </li><li> A fim de eliminar as células que tenham aspirado juntamente com o, eCSF rotação eCSF a 10.000 x g. Colete contaminada eCSF (sobrenadante) e armazenar a -80 ° C até estar pronto para análise posterior. </li></ol> 5. Reintrodução de fatores selecionados <ol><li> Drenar o eCSF cada 2 horas durante o intervalo de tempo desejado, uma vez que o líquido é alimentado dentro desse período de tempo. Entre os pontos de tempo de drenagem, retire a agulha e armazenar os embriões a 28,5 ° C ou a temperatura desejada. </li><li> Carregar agulha micropipeta segundo com factor de teste. </li><li> Agulha lugar em micromanipulador ligado a microinjetor. </li><li> Ajustar o volume de injecção de 1 nl medindo o tamanho da gota de óleo e ajustamento do tempo de injecção e pressure. </li><li> Injetar 1-2 NL em ventrículos cerebrais, como descrito anteriormente 26. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

A utilização desta técnica para drenar manualmente eCSF de ventrículos cerebrais zebrafish será útil para a determinação da exigência de eCSF durante o desenvolvimento. Além disso, esta técnica permite a descrição do perfil proteico eCSF ao longo do desenvolvimento embrionário. Identificação de proteínas diferentes durante este tempo irá permitir uma investigação mais aprofundada sobre a função do LCR e o seu papel potencial durante o desenvolvimento do cérebro. No amniotas, alguns factores identi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Eppendorf CellTram óleo </td><td> Eppendorf </td><td> 516 000.025 </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td></tr><tr><td> Tricaina pó </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Tubos capilares </td><td> FHC Inc. </td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

manual drainage of the zebrafish embryonic brain ventricles

Líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido rico em proteínas contidas dentro dos ventrículos do cérebro. Encontra-se presente durante o desenvolvimento embrionário precoce dos vertebrados e persiste durante toda a vida. Adulto CSF é pensado para amortecer o cérebro, remover resíduos, e proceder secretado 1,2 moléculas. No embrião de adultos e mais velhos, a maioria dos CSF é feita pelo plexo coróide, uma série de regiões altamente vascularizadas secretoras colocadas junto dos ventrículos do cérebro 3-5. No peixe-zebra, o plexo coróide está completamente formado a 144 horas pós-fertilização (hpf) 6. Antes disso, em embriões de vertebrados tanto peixe-zebra e outros, incluindo ratinho, uma quantidade significativa de embrionário CSF ​​(eCSF) está presente. Estes dados e os estudos em pintainho sugerem que o neuroepitélio é secretória precoce no desenvolvimento e pode ser a fonte principal de eCSF antes do desenvolvimento do plexo coróide 7. eCSF contém cerca de três vezes mais proteína than adulto CSF, sugerindo que pode desempenhar um papel importante durante o desenvolvimento 8,9. Os estudos realizados em pintos e de rato demonstram que os factores secretados no eCSF, a pressão do fluido, ou uma combinação destes, são importantes para a expressão do gene neurogenesis sobrevivência, a proliferação de células, e células, no neuroepitélio 10-20. Análises proteômicas de rato, humano, mouse e eCSF garota identificaram muitas proteínas que possam ser necessárias para a função LCR. Estes incluem componentes da matriz extracelular, apolipoproteínas, proteínas que regulam a pressão osmótica, e proteínas envolvidas na morte celular e proliferação 21-24. No entanto, as funções complexas do eCSF são largamente desconhecidos. Desenvolvemos um método para a remoção de eCSF ventrículos cerebrais zebrafish, permitindo assim a identificação de componentes eCSF e para a análise do requisito eCSF durante o desenvolvimento. Embora mais eCSF podem ser coletadas de outros vertebrados sistemas wom embriões maiores, eCSF podem ser coletadas desde os primeiros estágios de desenvolvimento do peixe-zebra, e sob condições genéticas ou ambientais que levam ao volume anormal do cérebro ventrículo ou morfologia. Remoção e recolha de eCSF permite a análise de espectrometria de massa de inquérito, de função eCSF, e reintrodução de factores seleccionados para os ventrículos para ensaiar a sua função. Assim, a acessibilidade do embrião do peixe-zebra precoce permite a análise detalhada da função eCSF durante o desenvolvimento.

Um exemplo de um ventrículo cerebral drenado é mostrado na Figura 1B, C-. Ventrículos cerebrais são recolhidos como falta eCSF (Figura 1B vs C). Como se vê nas imagens dorsal (Figura 1B-C, e A Figura 2A-D) do neuroepitélio rombencéfalo retém a sua morfologia característica e parece ser aberta, apesar da falta de eCSF provavelmente devido à robustas dobradiças-pontos. No entanto, vistas laterais (Figura 2A&#39;-D &quot;) demon...

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Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Apresenta-se um método para recolher fluido cerebrospinal (CSF) e para criar um sistema que não tem CSF dentro do sistema ventricular embrionário do peixe-zebra cérebro. Isto permite uma análise mais aprofundada de CSF composição e sua exigência durante o desenvolvimento do cérebro embrionário.

Drenagem Manual dos Zebrafish ventrículos cerebrais embrionárias

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

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Neuroscience

9.9K visualizações.  Massachusetts Institute of Technology. Apresenta-se um método para recolher fluido cerebrospinal (CSF) e para criar um sistema que não tem CSF dentro do sistema ventricular embrionário do peixe-zebra cérebro. Isto permite uma análise mais aprofundada de CSF composição e sua exigência durante o desenvolvimento do cérebro embrionário.