Os autores agradecem a Elisabeth Blanchard, por sua assistência técnica. Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

1. Cultura Calu-3 células para uso em culturas Transwell Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. <ol><li> Para descongelar as células de armazenamento de congelados: <ol><li> Prepare Meio Mínimo Essencial de Eagle contendo 20% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 0,1 mM de não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina, e 10 mM de HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Esterilizada por filtro de média a preparada utilizando um filtro de 0,2 um de tamanho de poro, e aquecido num banho de água a 37 ° C. Para ser mais reflectora do ambiente em situ das vias aéreas epitélio, o meio não é suplementado com antibióticos ou antimicóticos. </li><li> Descongelar um criotubo gelado de células Calu-3 rapidamente (&lt;1 min) num banho de água a 37 ° C. </li><li> Transferir as células descongeladas a um tubo de 50 ml estéril cónico e adicionar 30 ml de EMEM-aquecido a 20% + S. </li><li> Pellet as células por centrifugação durante 5 min a 1,000-1,200 × g,sem refrigeração, e com uma velocidade baixa de freio. </li><li> Decantar o sobrenadante cuidadosamente e ressuspender as células em 5 ml de EMEM-20% + S aquecido suavemente pipetando para cima e para baixo. Semente 2-5 x 10 6 células por poço numa placa de cultura de tecidos de 6 poços e incuba-se a 37 ° C, 7% CO 2 em ar ambiente até que as células são de 75% - 80% confluentes. Verifique diariamente; até 7 dias podem ser necessários. A cada 3-4 dias, aspirar o meio das células e substitui-lo com EMEM fresco, 20% + S. </li></ol></li><li> Para subcultura de células: <ol><li> 0,05% de tripsina quente - 0,02% de EDTA em um banho de água a 37 ° C. Aspirar o meio das células, uma vez que as células e lava-se com tripsina a 0,05% aquecida - EDTA a 0,02% para remover o excesso de meio e soro. Remover a solução de lavagem e adicionar 1 ml de tripsina aquecido por poço para as células. </li><li> Incubar a 37 ° C e CO 2, e 7% de monitor sob um microscópio a cada 5 min até que pelo menos 75% das células destacam do poço (s) da placa de cultura de tecidos. Isso podeter entre 5 e 30 min. </li><li> Lave as células em EMEM-20% + S para remover o excesso de tripsina. Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml estéril cónico. Múltiplos poços de células a partir de uma placa de cultura de 6 poços podem ser reunidos numa única tubo estéril de 50 ml de Erlenmeyer. Adicionar 30 ml de células de EMEM a 20% +-S e de sedimento por centrifugação a 1,000-1,200 × g, sem refrigeração, e com uma velocidade baixa de freio. </li><li> Decantar o sobrenadante com cuidado e ressuspender as células em% EMEM-20 fresco + S cuidado pipetando para cima e para baixo. Usando etapas 1.2.1 1.2.3 acima através de Tripsinizar as células, as células continuarão a subcultura em placas de cultura de tecidos, tal como descrito nos passos 1.2.5 1.2.7 através quando estão entre 75 - 80% confluentes. </li><li> Subcultura a partir de um poço de uma placa de 6 poços até um T-25 centímetros balão 2, num volume final de 5 ml de EMEM a 20% +-S, semeando entre 0,5 a 1 x 10 6 células / frasco. </li><li> Usando 5 ml de tripsina aquecido por T de 25 cm 2 balão para separar células de subcultura,a partir de um frasco de T-25 cm2 até um T-75 cm 2 balão num volume final de 10 ml de EMEM a 20% +-S, semeando entre 1 e 5 x 10 6 células / frasco. </li><li> Utilizando 8 ml de tripsina aquecido por T de 75 cm 2 balão para separar células de subcultura, a partir de um T-75 cm 2 em 2 frasco T-75 cm 2 frascos. Para o crescimento celular óptimo, não se células de subcultura em frascos maiores do que T-75 cm 2 ou subcultura a uma proporção maior do que um frasco de pai: 3 frascos novos. </li></ol></li><li> Uma vez que as células foram subcultivadas, remover completamente e substitua meio a cada 2 a 3 dias até atingirem a confluência de 75-90%. As células podem levar até 3 semanas para chegar a confluência de 75-90%. Para a geração óptima de culturas polarizadas, células de subcultura antes que crescem para além de 90% de confluência como uma camada única. </li><li> Continue a células de subcultura até um número suficiente de células cresceram até o número desejado de sementes de inserções Transwell. Cada pastilha Transwell requer 2 × 10 5 células. Para um desempenho ideal gerando culturas polarizadas, utilize células que sofreram mais de 10 subculturas. </li></ol> 2. Crescimento polarizado Calu-3 líquido cobertas de Culturas (LCC) Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. <ol><li> Prepare EMEM contendo FBS a 10% (EMEM-10%) e aquecido num banho de água a 37 ° C. </li><li> Prepare uma placa de 24 poços Transwell para a semeadura. Utilizando fórceps estéreis, mover inserções Transwell do interior para as linhas exteriores da placa, sem tocar na membrana de inserção. As células devem ser subcultivadas apenas em poços sobre as linhas exteriores da placa. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos basolateral, adicionar 600 uL de EMEM a 10%, para cada uma a dobrar a pipeta contra a parede de cada compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. </li><li> Separar as células T a partir de 75 cm 2 de tecido. Subcufrascos LTURE utilizando tripsina aquecido, e lavar com 30 ml de EMEM-20% + S por cada 2 frascos de células tripsinizadas, tal como descrito no passo 1.2. </li><li> Completamente ressuspender as células lavadas em 5 ml de EMEM a 10%, com cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Determinar a contagem de células viáveis ​​e total pelo método de exclusão de azul de tripano. Prossiga apenas se a 80% - 90% são viáveis. </li><li> Num tubo de 50 ml estéril cónico, diluir as células a uma concentração de 2 x 10 6 células viáveis ​​/ ml, com EMEM-10%. </li><li> Adicionar células para o compartimento apical de cada Transwell. Para poços A1 e D1, o qual será poços de controlo isentos de células, isto é, espaços em branco, adicionar 100 uL de EMEM a 10%, sem células. Para cada uma das cavidades restantes, adicionar 100 ul de ressuspensos Calu-3 células, gentilmente dobrando a pipeta contra o canal de guia interior da parede da inserção e, lentamente, libertando as células. Não toque a pipeta para a membrana de inserção. Para manter uma suspensão homogénea de células Calu-3, agite suavemente a suspensão de célulasdurante este passo de semeadura. </li><li> Incubar a placa Transwell a 37 ° C e 7% CO 2 em ar atmosférico. Coloque a placa em uma incubadora onde perturbação física será mínimo. Para melhorar a eficiência de polarização, não se acumulam chapas em cima uns dos outros. </li><li> Para manter as culturas até polarizado e pronto para uso em experimentos, substituir completamente no meio transwells, como descrito nos passos a 2,10 2,13 a seguir. Meio deve ser completamente substituído três dias depois de ter sido subcultivados em transwells, e, em seguida, em um ciclo alternado entre o quarto dia e, em seguida, após a terceira alimentação anterior, até que as células são totalmente polarizado. </li><li> Quente EMEM-10% em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente meio de inserções Transwell. Com uma pipeta capilar ligado a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave, ou com um padrão de pipeta de 1 ml, o meio aspirado a partir de células livres de poços A1 e D1, em seguida, a partir de poços semeados, antes de remover o meio apical de todos os poços, e tgalinha de remover o meio basolateral de todos os poços. Não toque membranas inserção enquanto aspiração médio. </li><li> Adicionar 200 uL de EMEM a 10%, para o compartimento apical de células livres de poços A1 e D1, em seguida, aos poços semeados, dirigindo o meio no compartimento apical usando o lado da inserção para guiar a ponta da pipeta. Não adicione médio diretamente sobre as células, e não tocar a membrana de inserção. </li><li> Adicionar 600 uL de EMEM a 10%, para os compartimentos basolateral. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos basolateral, adicionar meio de cada um por dobrar a pipeta contra a parede de cada compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. </li></ol> 3. Avaliação do Desenvolvimento da Resistência Calu-3 LCC Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. <ol><li> Trans-epitelial avaliar a resistência eléctrica (TEER) de Calu-3 LCC 30 min depoismudanças médio, a avaliação pode ser realizada após cada mudança de meio, se desejar. Realizar medições em condições estéreis. Comece medições com o controle livre de células poços A1 e D1 (os espaços em branco) para obter medidas de base, e continuar com as medidas para cada poço. <ol><li> Sob condições estéreis, transferir o eléctrodo STX2 para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 70% de etanol em água estéril, e esterilizar 15 min. </li><li> Calibrar e testar o voltohmmeter para uso de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Retire o eletrodo a partir do etanol, o ar seco 5-10 segundos, e enxaguar o eletrodo com% EMEM-10 estéril. </li><li> Defina o modo do voltohmmeter para a definição de resistência, e ligar o rádio. </li><li> Coloque suavemente o eléctrodo numa das três portas que permitem o acesso ao compartimento basolateral de uma cultura Transwell. Eléctrodo lugar de modo que o fio mais apenas tocar levemente na parte inferior do poço e exterior permanece vertical,e o mais curto é no meio de cultura de tecido do compartimento apical, sem tocar na membrana de inserção. </li><li> Push &quot;Medida R&quot; botão, e aguarde a leitura estabilize. Repetir para as outras duas portas de cada poço e registar as medições de todos os três portas, para um total de três medições por poço. Continuar a medir a resistência de todos os poços de células. </li><li> Limpar o eléctrodo por imersão 5-10 min em etanol a 70%, enxaguando em dH2O estéril, e secagem cuidadosamente. Conservar na embalagem original. </li><li> Calcula-se a resistência de cada poço, usando a Equação 1. Ω = Ω amostra real - Equação Ω em branco, 1 onde a amostra Ω é a medição média de um poço e semeado em branco Ω é a medição média da 2 poços, A1 e D1, contendo inserções e médios, mas sem células. </li><li> Calcular a resistência por unidade de área, utilizando Equação 2. Ω real × área efectiva de membrana Equação = Ω × cm 2, 2 em que a área efectiva da membrana é de 0,33 cm 2 para inserções Transwell de 24 cavidades. </li></ol></li><li> Verificar que a polarização é completa através da realização de um ensaio secundário, medindo a difusão passiva de fluoresceína de sódio entre os compartimentos apical e basolateral, em 1-3 culturas Transwell. Os poços utilizados para o ensaio de fluoresceína de sódio deverá ser descartado imediatamente após a conclusão do ensaio. <ol><li> Preparar tampão não fluorescente (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl, 2,53 mM de CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM de NaHCO3 em água estéril; filtro estéril com 0,45 uM dispositivo de filtração ). Prepare fluoresceína de sódio a 1 mg / ml em tampão não fluorescente, o filtro esterilizado, envoltório em folha de alumínio, e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. Quente para o quarto de temperature antes da utilização. </li><li> Depois de completar as medições de resistência, remova cuidadosamente médio de ambos os compartimentos basolateral e apical de um a três culturas individuais Transwell. </li><li> Lavar culturas Transwell. Suavemente adicionar 600 ul à temperatura ambiente estéril PBS Dulbecco (D-PBS) para os compartimentos basolateral e 100 uL à temperatura ambiente estéril D-PBS para os compartimentos apicais. </li><li> Remova cuidadosamente D-PBS dos poços. Adicionar 600 ul de tampão não fluorescente estéril para os compartimentos basolateral. Adicionam-se 100 ul de uma estéril de fluoresceina de sódio mg / ml para os compartimentos apicais. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 1 h. CO 2 não é necessário durante a incubação. </li><li> Durante a incubação, preparar uma curva padrão de fluoresceína de sódio que varia entre 20 ng / ml e 0 ng / mL, utilizando tampão não fluorescente para diluir fluoresceína de sódio. Preparar pelo menos 8 concentrações diferentes de fluoresceína de sódio, cada um em um volume final de, pelo menos, 600 ul. Manterdiluições da curva padrão protegido da luz até que esteja pronto para medir a absorbância. </li><li> Transfira a amostra tampão não fluorescente a partir do compartimento basolateral de cada Transwell de teste para um tubo limpo separado para análise. Remover o teste transwells usado para examinar a difusão passiva de fluoresceína de sódio a partir da placa e descartar. Regressar a placa com transwells restantes para a incubadora. </li><li> Coloque 100 ul de cada solução padrão em triplicado numa placa de 96 poços de fundo plano. </li><li> Preparar três diluições de cada amostra basolateral (1:2, 1:20, e 1:50) em tampão não fluorescente, e adicionar 100 uL de cada amostra não diluída e de cada uma das diluições, em duplicado, para um de 96 poços plana placa de fundo. </li><li> Absorvância medida da amostra num leitor de placas de ELISA a 486 nm ou 490 nm. </li><li> Determinar a concentração de fluoresceina de sódio no compartimento basolateral através da comparação da absorvância das amostras contra os valores de absorvância para a fluoresceína sódica standard curva. </li></ol></li></ol> 4. Infectando Polarized Calu-3 LCC com Vírus Respiratório Medidas de Segurança: executar todos os procedimentos descritos em uma cabine de segurança biológica utilizando a técnica de cultura estéril, a um nível apropriado de segurança biológica para o vírus a ser utilizado. <ol><li> Diluir vírus em EMEM livre de soro, de modo que seria desejado inóculos em 100 ul. </li><li> Lave as células em EMEM livre de soro. Aspirar cuidadosamente meio de todos os poços, o meio de remoção apical então o meio basolateral. Com uma pipeta capilar ligado a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave, ou com um padrão de pipeta de 1 ml, o meio aspirado a partir de células livres de poços A1 e D1, em seguida, a partir de poços semeados, em primeiro lugar remoção do meio apical de todos os poços, e em seguida removendo o meio basolateral de todos os poços. Não toque membranas inserção enquanto aspiração médio. <ol><li> Adicionar 100 uL de EMEM livre de soro para o compartimento apical de células livres de poços A1 e D1, e depois a tele seeded poços, dirigindo meio no compartimento apical usando o lado da inserção para guiar a ponta da pipeta. Não adicione meio diretamente sobre as células, e não tocar a membrana de inserção. </li><li> Adicionar 600 uL de EMEM livre de soro para os compartimentos basolateral. Adicionar meio de cada Transwell pela angulação da pipeta contra a parede do compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. </li><li> Aspirar cuidadosamente meio isento de soro dos poços. </li></ol></li><li> Começando com os poços não infectadas ou falsamente infectadas, adicionar as diluições de vírus apropriadas para o compartimento apical do transwells. Para poços não infectados, adicionar 100 uL de EMEM livre de soro para o compartimento apical do transwells apropriados, por falsamente infectadas poços, adicionar 100 ul de vírus livre de preparação diluída em EMEM livre de soro para o compartimento apical do transwells adequadas, por infecção por vírus, vírus diluído em EMEM livre de soro e adicionar 100 ul para os compartimentos apicais de transwells apropriados. </li><li>Adicionar 600 uL de EMEM livre de soro de todos os compartimentos basolateral. </li><li> Incubar a 37 ° C e 7% CO 2, durante 2 horas. </li><li> Aspirar meio de poços, em primeiro lugar a partir de poços não infectados e falsamente infectadas, em seguida, a partir de poços infectados. Remover sobrenadantes apicais primeiro lugar, seguido por sobrenadantes basolateral. </li><li> Substituir meio com 200 uL de EMEM a 10%, nos compartimentos apicais e 600 uL de EMEM a 10%, nos compartimentos basolateral. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ao estabelecer Calu-3 LCC em inserções Transwell, as células não podem polarizar de todo, ou não pode polarizar completamente, tal como definido por um TEER ≥ 1,000 Ω × 2 cm e ≤ sódio a 1% de corante de fluoresceína de equilíbrio entre os compartimentos apical e basolateral. Além disso, Calu-3 células de LCC pode totalmente polarizar, mas TEER podem ser inconsistentes entre as medidas. Apesar de flutuações nas medidas de Teer Calu-3 LCC são normais do dia a dia, uma vez totalmente polarizados, oscilações dramáticas na TEER não se espera até a cultura naturalmente diminui com a idade, o que pode ser tão pouco como cinco semanas ou enquanto 12 semanas após a semeadura. A capacidade de Calu-3 LCC para polarizar depende em parte da forma como as células são mantidas e subcultivados antes da sua utilização no sistema Transwell. As células que cresceram para além de 90% de confluência como uma monocamada durante a repicagem, que foram subcultivadas mais de 10 vezes do stock congelado, ou que não sejaen fornecido com meio fresco em uma programação regular são menos propensos a polarizar completamente, e qualquer polarização provavelmente diminuirá rapidamente. Falta incompleta ou total de polarização pode também ser atribuída à variação no material e tamanho de poro de transwells utilizados para Calu-3 LCC, e de lote para lote, em transwells variação de composição semelhante e de tamanho de poro pode também afectar a polarização. Tamanhos maiores de poro pode permitir Calu-3 a crescer através da membrana Transwell no compartimento basolateral, impedindo a cultura a partir de polarização. Uma ausência de polarização pode também ser devido ao crescimento bacteriano, indicado por meio de cultura turva, o que leva à destruição subsequente das junções apertadas entre as células Calu-3. Medições TEER variáveis ​​de Calu-3 LCC pode ser causada por perturbações mecânicas dos Calu-3 monocamadas de células LCC, as inserções, ou as placas propriamente ditas. Mudanças de médio e medições Teer deve ser realizada sem ponteiras ou electroleva de tocar nas células. Durante a realização destas operações, deve ser tomado cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos apical e basolateral, que perturbam a capacidade do voltohmmeter para detectar a resistência. A capacidade do voltohmmeter para detectar a resistência de uma cultura que é, na verdade, polarizada pode também limitada pela acumulação de proteínas sobre as pontas dos eléctrodos. Esta acumulação-podem ser removidos com lixa suave, ou pode ser corrigido através da substituição do eléctrodo. Uma vez Calu-3 LCC completamente polarizar o TEER e já não está a aumentar, Calu-3 LCC está pronto para ser utilizado como um modelo in vitro para caracterizar as respostas das células hospedeiras pulmonares epiteliais de infecção respiratória. Este sistema permite uma melhor caracterização das respostas de direcção, para agentes patogénicos em comparação com monocamada de cultura de linhas celulares de pulmão, tradicionalmente usados ​​para estudar agentes patogénicos respiratórios, tais como A549 e células HEp-2, com as vantagens adicionais de Calu-3 LCC being mais rápido para desenvolver, mais fácil de obter, e menos dispendioso para gerar de primário, NHBE, polarizada diferenciada. Semelhante a NHBE, polarizada Calu-3 demonstram a formação da junção apertado, e produzir mucinas. No entanto, ao contrário NHBE, polarizados Calu-3 células não se diferenciam em camadas de células basais e células ciliadas epiteliais colunares, e poucos polarizadas Calu-3 células se desenvolvem cílios-como projeções 19. Assim, apesar de serem úteis para o exame respostas polarizadas de células epiteliais das vias aéreas respiratórias a insulto, polarizado Calu-3 LCC não é um modelo ideal para examinar o desenvolvimento das vias aéreas ou de remodelação em resposta ao insulto ou ferimento respiratório. A produção de muco pelas células em cultura in vitro podem ter impacto infectividade celular, bem como a libertação de vírus infeccioso e propagação do vírus em um modelo de polarização, e uma comparação directa da produção de muco polarizada entre Calu-3 LCC e NHBE, polarizada diferenciada não foi relatada . A549 e células HEp-2 are mais fácil do que a cultura de células Calu-3, no entanto, ao contrário de Calu-3 LCC, elas não formam as culturas polarizadas, quando cultivada em inserções Transwell, e, portanto, não são modelos ideais para a análise in vitro das respostas das células epiteliais polarizadas a infecção por vírus respiratório .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTES </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina a 0,05% - 0,02% de EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Heat-inactivam, 56 ° C, 30 min </td></tr><tr><td> Não-aminoácidos essenciais 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Armazenar a 4 ° C no escuro </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> FBS a 10%-EMEM (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Suplemento EMEM com FBS inactivado pelo calor a 10% de soro, esterilizada por filtro </td></tr><tr><td> EMEM-FBS a 20% + suplementos (% EMEM + S-20) </td><td></td><td></td><td> Suplemento EMEM para concentrações finais: FBS inactivado pelo calor, a 20%; 1X aminoácidos, 2 mM de L-glutamina, a 10 mM de HEPES; esterilizada por filtro </td></tr><tr><td> Placas de 24 poços Transwell </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> Tamanho de poro 3 uM de poliéster, </td></tr><tr><td> Trypan azul </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Prepare-se para 70% utilizando dH2O estéril </td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Não fluorescente tampão </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM de KCl; 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM de NaHCO3 em água estéril; esterilizada por filtro </td></tr><tr><td> Fluoresceína </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml em tampão não fluorescente estéril; esterilizada por filtro, proteger da luz; armazenar a 4 ° C até 6 meses </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 eletrodo </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas ELISA </td><td></td><td></td><td> Capaz de medir um 486 ou um 490 </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

As superfícies apicais e basolateral das células epiteliais das vias aéreas demonstram respostas direcionais para exposição patógeno in vivo. Assim, em modelos in vitro ideal para análise de respostas celulares a patogénios respiratórios polarizar, formando superfícies apical e basolateral. Um tal modelo é diferenciado normais células epiteliais brônquicas humanas (NHBE). No entanto, este sistema requer amostras de tecido pulmonar perícia, isolamento e cultura de células epiteliais do tecido e, em vez de gerar uma cultura de interface ar-líquido. Calu-3 células, derivadas de um adenocarcinoma humano brônquica, são um modelo alternativo para a análise da resposta das células das vias respiratórias epiteliais proximais ao insulto respiratório 1, os compostos farmacológicos 2-6, e 7-9 de bactérias e agentes patogénicos virais, incluindo o vírus da gripe, rinovírus e síndrome respiratória aguda grave - associada coronavírus 10-14. Recentemente, we demonstraram que as células Calu-3 são susceptíveis ao vírus respiratório sincicial (RSV) a infecção de uma forma consistente com NHBE 15,16. Aqui, detalhe o estabelecimento de um polarizado, cultura líquido coberto (LCC) da Calu-3 células, concentrando-se sobre os detalhes técnicos de cultivo e cultura Calu-3 células, mantendo as células que foram cultivadas em LCC, e nós apresentamos o Método para a realização de infecção por vírus respiratório de polarizadas Calu-3 células. Para obter consistentemente polarizada Calu-3 LCC, Calu-3 células devem ser cuidadosamente repicadas antes de cultivo em inserções Transwell. Calu-3 culturas em monocamada deve permanecer abaixo de confluência de 90%, devem ser subcultivadas menos de 10 vezes do stock congelado, e devem ser regularmente fornecido com meio fresco. Uma vez cultivadas em transwells, Calu-3 LCC devem ser manuseados com cuidado. Alterações irregulares de mídia e ruptura mecânica ou física das camadas de células ou placas de impactar negativamente a polarização paravárias horas ou dias. A polarização é monitorizada através da avaliação de trans-epitelial de resistência eléctrica (TEER) e é verificada através da avaliação da equilibração passiva de fluoresceína de sódio entre os compartimentos 17,18 apical e basolateral. Uma vez que TEER planaltos em ou acima de 1000 Ω × 2 cm, Calu-3 LCC está pronto a ser usado para analisar a resposta celular a agentes patogénicos respiratórios.

Quando cultivados como líquido cobertas culturas (LCC), em sistemas de cultura Transwell, tal como ilustrado na Figura 1, as células Calu-3, polarizam desenvolvimento distintas superfícies apical e basolateral. Seguindo o método descrito aqui, a resistência eléctrica trans-epitelial (TEER) de Calu-3 LCC atinge um patamar igual ou superior a 1.000 Ω × cm 2 a 3 semanas depois da sementeira, a exemplo do que é mostrado na Figura 2. As junções formadas entre as células polarizadas prevenir equilíbrio passivo de pequenas moléculas entre os compartimentos apical e basolateral. Assim, uma modificação do ensaio de equilíbrio de sódio fluoresceína é utilizada para confirmar a polarização de Calu-3 LCC 15,17,18. À medida que o TEER de monocamadas de células Calu-3 em aumentos de LCC, a quantidade de fluoresceína que equilibra passivamente no compartimento basolateral diminui. Uma vez que o TEER é 1000 × Ω cm 2, a quantidade de fluoresceína, que se equilibra, empara o compartimento basolateral é ≤ 1%, como mostrado na Figura 3 e, portanto, Calu-3 LCC são consideradas totalmente polarizado quando o TEER é ≥ 1,000 Ω × 2 cm. A medição do pico de TEER Calu-3 LCC podem variar de experiência para experiência. No entanto, uma vez que os valores TEER plateau para qualquer dada experiência, um totalmente polarizado, uninfected Calu-3 LCC pode ser estável durante 5 a 12 semanas após a semeadura. A ausência de desenvolvimento de resistência em Transwell-cultivadas Calu-3 pode ser causada por diversos factores como descritas na Tabela 1. Uma vez que o TEER de Calu-3 planaltos LCC em ou acima de 1000 × Ω cm 2, o modelo está pronto para ser usado para examinar As respostas das células epiteliais das vias aéreas a agentes patogénicos respiratórios, incluindo o vírus sincicial respiratório (RSV). A exposição a resultados de RSV em um declínio mais rápido na integridade cultura polarizada em comparação com uma infecção simulada, de células (Figura 4). Figura 1. Células secção transversal da representação Transwell-cultura de células. São cultivadas na superfície da membrana apical de inserção. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Figura 2. Desenvolvimento de trans-epitelial de resistência eléctrica (TEER) e polarização de células Calu-3 após a semeadura em inserções Transwell. Em cada ponto de tempo, TEER é apresentada como mediana Ω x cm 2 ± SEM de 32 poços independentes de uma experiência representativa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Figura 3. Passiva equi<html> bração de fluoresceína de sódio no compartimento basolateral de monocamadas de células Calu-3 é inibida como as células tornam-se polarizada. dados acumulados de quatro experiências independentes são apresentados. Cada ponto de dados representa uma medição individual. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Figura 4. RSV infecção de polarização Calu-3 LCC acelera um declínio na integridade monocamada. Polarizados Calu-3 células foram infectadas com RSV-A2 a uma MOI = 1, no dia 0, e a polaridade foi monitorizada durante 8 semanas após a infecção. Um experimento representativo é mostrado. Os dados são apresentados como média resistência de 8 poços independentes por infecção ± SEM por ponto de tempo. * P &lt;0,05 entre as culturas falsamente e RSV-A2 infectados, como determinado pelo teste t de Student. maneiras &quot;&gt; <tbody><tr><td> Questão </td><td> Resolução (s) </td></tr><tr><td> A resistência não é mensurável </td><td><ul><li> Remova todas as bolhas de ar nos poços </li><li> Use Calu-3 células que foram subcultivadas a partir de estoque congelada a menos de 10 vezes </li><li> Não permitir que as células Calu-3 para atingir 100% de confluência em subcultura monocamada </li><li> Verificar que as células não estão em crescimento sobre o plástico bem abaixo do elemento de inserção (o que indica que as células podem ter crescido através dos poros da pastilha) </li><li> Permitir 2-3 semanas pós-sementeira para o desenvolvimento de resistência plena </li><li> Verifique a composição e tamanho de poro de pastilhas usadas, se necessário, alterar (insert poliéster recomendada, 0,3 ^ M de tamanho de poro, sem revestimentos, ver materiais para detalhes) </li><li> Verificar a qualidade do eléctrodo, lixar suavemente para remover proteínas acumuladas a partir da ponta, e substituindo, se necessário </li><li> Verifique meio para o crescimento de bactérias </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> Resistência desenvolve, mas polarização plena (≥ 1,000 Ω × cm 2) não é alcançada </td><td><ul><li> Permitir tempo adicional para a polarização de desenvolver (ocasionalmente pode levar até 4 semanas) </li><li> Use Calu-3 células que foram subcultivadas a partir de estoque congelada a menos de 10 vezes </li><li> Não permitir que as células Calu-3 para atingir 100% de confluência em subcultura monocamada </li><li> Consistentemente substituir médio em culturas Transwell, alternando entre o terceiro dia e depois quarto após a alimentação anterior </li><li> Apenas as células de cultura de inserções que são colocados nas linhas exteriores das placas </li><li> Use muito diferente de inserções Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> Células totalmente polarizar, mas a resistência não é consistente de uma leitura para a próxima </td><td><ul><li> Não perturbar ou empilhar placas na incubadora </li><li> Não causam vibrações na cabine de segurança biológica, enquanto Transwell plates estão sendo manipulados </li><li> Remova todas as bolhas de ar nos poços </li><li> Não perturbe a camada de células com ponteiras ao mudar de mídia ou realizar leituras Teer </li><li> Usar 200 ul de meio no compartimento apical; menor volume pode resultar em leituras instáveis ​​TEER </li><li> Verifique a qualidade do eletrodo, lixar suavemente para remover proteínas acumulados a partir da ponta, e se necessário, substituir </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Resolução de problemas problemas que podem surgir quando a cultura de Calu-3 células de transwells. Vários fatores contribuem para a polarização cheio de Calu-3 células em líquido cobertas de culturas, o mais provável de que são destaque na tabela.

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Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

22.3K visualizações.  Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Imunologia e Infecção

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Mouse e humanos derivada de cultura de monocamada epitelial gástrica primária para o estudo da regeneração

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...