Suportado pelo NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​a Fundação Hartwell, e Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny é um investigador do Hartwell Eric fundo ea Amy Strelzer Programa de Pesquisa Manasevit.

1. Dia experimento 0: Preparação de amostras e ELISA Revestimento placa de teste com anticorpo de captura para a IL-2Ra, e HGF REG3α <ol><li> Amostras de alíquotas de plasma a ser analisadas serão puxados, descongelada e centrifugada a 12000 rpm durante 10 min para separar os coágulos, na parte inferior e na parte superior lipidos do plasma. 150 ul de plasma não diluído irão ser plaqueadas a partir de cada amostra para uma placa de 96 poços de fundo V-(placa de fonte) por pipetagem manual de acordo com os mapas pré-definidos. As alíquotas será enrolado em parafilme e mantida numa câmara húmida a 4 º C durante todo o processo, não mais do que 72 h. </li><li> IL-2Ra e anticorpos de captura de HGF será reconstituído e diluído por a especificação do fabricante e 50 uL irá semeadas em cada cavidade de 96 cavidades respectivas de alta ligação semi-poços que são então seladas e incubadas durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, as placas de visita pode ser seco a 37 ° C e armazenados a 4 ° C para utilização posterior, dependemção sobre a estabilidade da proteína. </li><li> Anticorpo de captura REG3α será diluído de acordo com o protocolo do fabricante utilizando tampão fabricante de revestimento e 25 ul serão semeadas em cada poço de uma de 384 poços Nunc Maxi Sorp-placa, que é então selado e incubado durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2. Dia Experiência 1: IL-2Ra ELISA (Figura 1) <ol><li> A placa de teste de IL-2Ra foi lavada, bloqueadas com BLOTTO em TBS, e o padrão é reconstituído e uma curva padrão de 8 pontos é preparado segundo o protocolo do fabricante. </li><li> Após lavagem da placa após o passo de bloqueio, 50 ul de plasma não diluído é plaqueada em duplicado da placa de fonte para a placa de ELISA, e 50 ul de cada padrão é plaqueada em duplicado. A placa é selado e incubado durante 2 horas à temperatura ambiente num agitador rotativo placa fixada em 300 rpm. </li><li> O plasma é recuperado a partir da placa de ensaio de ELISA IL-2Ra e colocados de volta no undiluído placa da fonte de plasma. O ELISA é completado por protocolo do fabricante (com volumes ajustados para metade poços) e a densidade óptica de cada poço vai ser lido utilizando um leitor de placas de jogo para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> 3. Dia Experiência 1: REG3α ELISA (Figura 1) <ol><li> 10 ul de plasma não diluído é transferido para uma placa de fonte separada v inferior. 90 ul de tampão fornecido pelo fabricante de diluição é adicionada a cada poço para criar uma placa de diluição 1:10 fonte. </li><li> O ELISA é realizado por REG3α protocolo do fabricante (com volumes ajustado para 384 poços) e a densidade óptica de cada poço será lido utilizando um leitor de placas definido para 450-620 nm, e os dados serão guardados e analisados. </li></ol> 4. Dia Experimento 1: Elafin e TNFR1 Revestimento placa de teste com anticorpo de captura <ol><li> Elafin e anticorpos de captura TNFR1 será reconstituído e dilbuída por especificações do fabricante e 50 uL irá semeadas em cada cavidade de 96 cavidades respectivas de alta ligação semi-poços que são então seladas e incubadas durante a noite à temperatura ambiente durante Elafin, e a 4 ° C para TNFR1. </li></ol> 5. Experiment Dia 1-2: HGF ELISA (Figura 1) <ol><li> Após completar o ensaio ELISA IL-2Ra e assegurando o teste não necessita de ser repetida, 60 ul de plasma não diluído será transferida para uma placa nova fonte e, em seguida, 60 ul de BSA a 1% em 1 x PBS é adicionado a cada poço para tornar um 01:02 prato fonte diluída plasma. </li><li> A placa de teste é lavada HGF, bloqueadas com BLOTTO em TBS, e o padrão é reconstituído e uma curva padrão de 8 pontos é preparado segundo o protocolo do fabricante. </li><li> Após lavagem da placa após o passo de bloqueio, 50 ul de 1:2 de plasma diluído é plaqueadas em duplicado na placa de ELISA, e 50 ul de cada padrão é plaqueada em duplicado. A placa é selada eincubadas durante a noite à temperatura ambiente num agitador rotativo placa ajustada para 300 rpm. </li><li> O plasma diluído 1:02 é recuperado a partir da placa de teste ELISA HGF e colocada de volta na placa de fonte diluída de 1:02 de plasma. O ELISA é completado por protocolo do fabricante (com volumes ajustados para metade poços) e a densidade óptica de cada poço vai ser lido utilizando um leitor de placas de jogo para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> 6. Dia Experimento 2: Elafin ELISA <ol><li> 10 ul de plasma não diluído é transferido para uma placa nova fonte e, em seguida, 190 ul de BSA a 1% em 1 x PBS serão adicionados a cada poço para tornar 200 ul de plasma 1:20 dluted. </li><li> O ELISA Elafin como realizado de acordo com o protocolo do fabricante (com volumes ajustado para metade poços), e a densidade óptica de cada poço será lido utilizando um leitor de placas definido para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> 7. Da experiênciay 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 ul de BSA a 1% em PBS, será adicionado à placa de fonte de 1:20 (agora contendo 100 uL de plasma de 1:20) para obtenção de 125 ul de plasma diluído 1:25. </li><li> O ELISA é completado por TNFR1 protocolo do fabricante (com volumes ajustados para metade poços) e a densidade óptica de cada poço vai ser lido utilizando um leitor de placas definido para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> 8. Dia Experiência 2: IL-8 ELISA <ol><li> 60 ul de 1:2 de plasma diluído será transferida para uma placa nova fonte e, em seguida, 180 ul de IL-8 diluente é adicionado a cada poço para fazer uma placa de fonte diluída de 1:06 de plasma. </li><li> O ELISA de IL-8 é completado por protocolo do fabricante (com volumes ajustados para metade poços) e a densidade óptica de cada poço vai ser lido utilizando um leitor de placas definido para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> Uma vez que todos os testes ELISA foram concluídas, sem usod estoque plasma será substituído nas alíquotas descongelados e congelado para utilização futura.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<html> O método ELISA sequencial aqui apresentada permite a medição de várias proteínas do plasma em pequenos volumes de plasma que podem ser difíceis de obter e / ou insubstituível tais como amostras de indivíduos humanos com doenças raras ou de amostras de plasma obtidas a partir de ratinhos 9,10. Os ELISAs sequenciais são tipicamente realizadas na ordem do factor de diluição de plasma crescente, com testes ELISA requerem plasma diluído ≥ 1:10, normalmente, não necessitam de ser recuperado, embora isso possa ser feito se desejado. A capacidade de realizar ELISA sequencial é limitada por kits ELISA / protocolos em que o plasma é misturada com os restantes reagentes, ou para os quais tampões de diluição diferentes são requeridas para o plasma, o que se opõe à ablility de reutilizar uma amostra devido a preocupações de que um incompatíveis tampão / reagente irá interferir com o desempenho de um teste particular. Com um planeamento cuidado, de 10 ou mais ELISAs pode ser efectuado com a mesma amostra de plasma. ent &quot;&gt; Laboratórios individuais podem precisar de ajustar diluições de plasma, a fim de obter resultados interpretáveis ​​baseadas em concentrações plasmáticas esperados da proteína de interesse em amostras dos sujeitos de teste. Diferenças no equipamento de laboratório pode resultar na necessidade de optimizar a incubação e desenvolvimento colorimétrico vezes, o número de lavagens e / ou lavar tempos de imersão, de modo a optimizar qualquer dado ELISA. Para aumentar a taxa de transferência de alta capacidade e precisão e para realizar análises de forma rentável, a utilização de uma plataforma de manuseamento robotizado líquido capaz de análise em 384 placas de poços e um lavador de placas automático com a unidade de empilhamento são recomendados. Este equipamento pode aumentar a precisão e precisão das análises realizadas por vários usuários, e ajudar a fornecer consistência de análise para reduzir variação inter e intra-ensaio. Usamos ELISA sequencial em plataformas multiplex disponíveis por dois motivos: 1) A maior parte dapares de anticorpos para novas proteínas não podem ser facilmente conjugados com pérolas ou outro material, bem como demorada e cara, 2) ensaios de ELISA individuais são mais precisos do que microarray multiplex ou grânulos, secundária a uma ausência de reactividade cruzada 11. Se um método de confiança é estabelecida para executar multiplexados, grânulo com base em microarrays, pode ser capaz de substituir o processo de ELISA sequencial, mas pode ser limitada pela capacidade para conjugar os anticorpos de grânulos e / ou pelo número de proteínas desejadas de ser analisados.

Doença do enxerto-versus-hospedeiro aguda (GVHD), uma das principais causas de mortalidade não-recaída (NRM) após alogénico transplante de células hematopoiéticas (HSCT), mede-se por uma disfunção em três sistemas de órgãos: a pele, fígado e gastrointestinal (GI) trato 4. GVHD aguda geralmente ocorre entre duas e oito semanas após o transplante, mas podem ocorrer mais tarde, e muitas vezes é clinicamente indistinguível da de outros pós-TCTH complicações, tais como a toxicidade regime de condicionamento, infecção ou efeitos colaterais. Através da utilização de estratégias de proteômica e de alto rendimento de validação usando ELISA sequencial, foram identificados seis proteínas cujas concentrações são elevadas no início das manifestações clínicas da DECH. IL-2Ra, TNFR1, HGF e IL-8, quando combinados em um painel 4 biomarcador pode diagnosticar-GVHD no início dos sintomas clínicos e pode prever a sobrevivência pós-transplante, independentemente da gravidade da GVHD 1. Elafin, um biomarcador para GVHD do skem, pode discriminar entre erupção GVHD e erupção de outras causas, como erupções de drogas e pode prever a sobrevida do transplante 2. Nós recentemente identificado REG3α como um biomarcador de DECH do trato gastrointestinal, o órgão alvo mais associado com NRM. A concentração plasmática de REG3α pode identificar com segurança DECH como a causa para o pós-TCTH diarréia e correlacionar com a gravidade histológica da DECH em diagnóstico biópsias intestinais. As concentrações no GI REG3α início GVHD também pode prever a capacidade de resposta a terapia com GVHD e NRM 3. A incorporação desses biomarcadores validados GVHD em atendimento clínico está sendo investigado em ensaios clínicos. Estas experiências foram realizadas em pequenas alíquotas de plasma colhidas a partir de pacientes que receberam transplante entre 2000 e 2010 no momento do início GVHD que são insubstituíveis e de quantidade limitada. Devido à natureza precioso destas amostras, temos desenvolvido um metgico da medição das concentrações de proteína de plasma em múltiplos de forma eficiente e reprodutível para eliminar o excesso de ciclos de congelamento e descongelamento, o tempo de descongelamento e utilização de plasma. Esta técnica pode ser aplicada para realizar os testes ELISA para múltiplas proteínas / citocinas de interesse na mesma amostra (s) desde que as amostras não necessitam de ser misturadas com outros reagentes. Se kits ELISA não vêm com pré-revestidas, as placas de 96 cavidades de meia assim chapas ou placas de 384 poços pode ser usado para reduzir ainda mais o uso de amostras / reagentes. Este manuscrito incide sobre os aspectos tecnológicos da medição biomarcadores GVHD.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Human IL-2 R alfa DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> HGF humano DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> IL-8 humana OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match ASSEMBLEIA Humanos PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Humana sTNFRI/TNFRSF1A DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Humana Trappin-2/Elafin DuoSet </td><td> R &amp; D Syderiva </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 cavidades de polistireno de fundo cónico placas </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Usado para placas de fonte de plasma </td></tr><tr><td> Costar meio bem alta de ligação de 96 poços </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> Para a IL-2Ra, HGF, TNFR1 e ELISAs elafin </td></tr><tr><td> Nunc 384 poços Maxisorp </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> Para REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone Tampão fosfato salino, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino, Fracção V, choque térmico Tratada </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Bloqueador de BLOTTO em TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> Agente de bloqueio de IL-2Ra e HGF ELISAs TNFR1 </td></tr><tr><td> DulbeccoSalina tamponada com fosfato </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> O tampão de lavagem para a IL-2Ra, HGF, Elafin e ELISAs TNFR1 </td></tr><tr><td> Susbtrate Peróxido de TMB </td><td> Kirkegaard and Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> O tampão de lavagem para a IL-2Ra, HGF, Elafin e ELISAs TNFR1 </td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (Diluída a 2N) para solução de parada </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Proteômica estratégias de descoberta imparciais têm o potencial para identificar um grande número de novos biomarcadores que podem melhorar os testes de diagnóstico e prognóstico em um ambiente clínico e pode ajudar a guiar intervenções terapêuticas. Quando um grande número de proteínas candidatas são identificadas, pode ser difícil validar biomarcadores candidatos em tempo hábil e eficiente a partir de amostras de plasma de pacientes que são orientados a eventos, de volume finito e insubstituível, como no início da aguda do enxerto-versus- doença do hospedeiro (GVHD), uma complicação potencialmente fatal de alogênico de células tronco hematopoiéticas (TCTH). Aqui descrevemos o processo de execução de testes ELISA comercialmente disponíveis para seis proteínas validados GVHD: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, e REG3α 3 (também conhecido como PAP1) de uma forma sequencial para minimizar ciclos de congelamento e descongelamento, Tempo de plasma descongelado e uso de plasma. Para esse procedimento foi realizar os testes ELISA em ordem sequencial, conforme determinado pelo fator de diluição da amostra, conforme estabelecido em nosso laboratório utilizando kits ELISA fabricante e protocolos com pequenos ajustes para facilitar ótimo desempenho ELISA sequencial. As concentrações plasmáticas de biomarcadores resultantes podem então ser compilados e analisados ​​para resultados significativos dentro de um grupo de pacientes. Embora esses biomarcadores são atualmente apenas para pesquisa, sua incorporação cuidados clínicos está sendo investigado em ensaios clínicos. Esta técnica pode ser aplicada para realizar os testes ELISA para múltiplas proteínas / citocinas de interesse na mesma amostra (s) desde que as amostras não necessitam de ser misturadas com outros reagentes. Se kits ELISA não vêm com pré-revestidas, as placas de 96 cavidades de meia assim chapas ou placas de 384 poços pode ser usado para reduzir ainda mais o uso de amostras / reagentes.

<html> O fluxo de trabalho de biomarcadores e cronograma estão detalhados na Tabela 1 e Tabela 2, respectivamente. Depois de concluído, as concentrações de 6 proteínas diferentes foram agora quantificada na mesma amostra de plasma usando um total de 150 uL de plasma. Plaqueamento das amostras em duplicado por teste permite a garantia de qualidade interna, com CV% de menos de 10 sendo ótima. Se realizar o teste ELISA sequencial em placas múltiplas, consistentes densidades ópticas do padrão elevado são preferidos e permitir a fiabilidade inter-chapa melhorada das medições; curva padrão ODs podem ser comparados entre as placas de olhar para avaliar o desempenho inconsistência em ELISA (Figura 2). Os tempos de desenvolvimento, utilizando o substrato tetrametilbenzidina colorimétrica e alta concentração de ODs observada para cada biomarcador no nosso laboratório estão listados na Tabela 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Fluxo de trabalho para a IL-2Ra, e ELISAs REG3α HGF. Após as amostras de plasma foram semeadas em placas de IL-2Ra placas de ensaio de ELISA que é recuperada para fazer placas de diluição de fonte para os testes ELISA outros. Para o ELISA de HGF, o plasma é recuperado para preparar a placa de diluição de 1:6 de IL-8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Densidades Ópticas para a curva padrão de 7 placas de ELISA que medem diferentes concentrações REG3α correspondentes aos 1.084 pacientes testados para o GI REG3α relatório inicial biomarcador GVHD 3. ODs consistente entre as placas garantir as proteínas consistentes de concentração entre as placas. As concentrações de proteínasem amostras de plasma são calculadas comparando as densidades ópticas de amostras para as densidades ópticas da curva padrão. <table border="1"><tbody><tr><td> Dia experiência 0 </td><td> 1. Preparar amostras </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Ra, HGF e REG3α captura Ab </td></tr><tr><td> Dia experimento 1 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (por exemplo revestimento) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin e TNFR captura Ab </td></tr><tr><td> Dia experimento 2 </td><td> 1. HGF conclusão ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Recongelar não utilizadoplasma </td></tr></tbody></table> Tabela 1. GVHD Visão geral de fluxo de trabalho Biomarker <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Dia 0 </td><td colspan="3"> A preparação da amostra e a incubação durante a noite o corpo de captura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Ra </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Tempo (h) </td><td> 0,0 </td><td> Bloqueio </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Amostras banhados </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Recuperar as amostras de plasma; Detecção Ab </td><td> Amostras de bloqueio; preparar (diluição 1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td> Amostras banhados (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> Estreptavidina-HRP </td><td> Detecção de Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Estreptavidina-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td> Leitura placa </td><td> TMB </td><td> Bloqueadores; amostras preparar (diluição 1:2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Leitura placa </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td></td><td></td><td> Amostras banhados (1:2) </td><td> Capturar Ab (incubação durante a noite) </td><td> Capturar Ab (incubação durante a noite) </td><td></td></tr><tr><td> Dia 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tempo (h) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim plasma, Detecção de Ab </td><td> Bloqueio; amostras de preparar (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Chapeamento amostra (1:2) </td><td> Bloqueio; nova diluição de 1:20 para a diluição de amostras 01:25 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Chapeamento amostra (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Leitura placa </td><td> Detecção de Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Preparar as amostras (1:6 diluição) </td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Detecção de Ab </td><td> Chapeamento de amostra (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td> Leitura placa </td&gt; <td> HRP </td><td> Detecção de Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Leitura placa </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Leitura da placa </td></tr><tr><td colspan="2"> Após a conclusão </td><td colspan="6"> Substituir fonte de plasma em alíquotas e congelar para uso posterior </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Cronograma para a realização de testes ELISA. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Factor de diluição do plasma </td><td> Concentração Alto Padrão </td><td> Tempo substrato Desenvolvimento (min) </td><td> Alta OD </td><td> Curva </td></tr><tr><td> IL-2Ra </td><td> 01:01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Linear </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4 parâmetros </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4 parâmetros </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4 parâmetros </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 01:20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4 parâmetros </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Linear </td></tr></tbody></table> Detalhes Tabela 3. ELISA para 6 Biomarkers GVHD.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Validação com rendimento elevado de candidatos a biomarcadores múltiplos pode ser realizada por meio de ELISA sequencial de modo a minimizar de congelamento / descongelamento e utilização de amostras de plasma preciosos. Aqui, nós demonstrar como executar sequencialmente ELISAs para seis diferentes biomarcadores de plasma validados<sup&gt; 1-3</sup&gt; De enxerto-versus-hospedeiro (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; Na amostra de plasma mesmo.

High Throughput ELISA sequencial para a validação dos biomarcadores da doença enxerto-versus-hospedeiro aguda

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

high-throughput-sequential-elisa-for-validation-biomarkers-acute

Research

JoVE Journal

Medicine

15.7K visualizações.  University of Michigan. Validação com rendimento elevado de candidatos a biomarcadores múltiplos pode ser realizada por meio de ELISA sequencial de modo a minimizar de congelamento / descongelamento e utilização de amostras de plasma preciosos. Aqui, nós demonstrar como executar sequencialmente ELISAs para seis diferentes biomarcadores de plasma validados 1-3 De enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) 4 Na amostra de plasma mesmo.

Vídeo: High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Medicina

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal procedimento cirúrgico invasivo de induzir Infarto do Miocárdio em Ratos

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

Estudo do metabolismo in vivo da glicose em camundongos alimentados com dieta de alto teor em gordura usando o teste oral de tolerância à glicose (OGTT) e o teste de tolerância à insulina (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...