Este trabalho foi financiado pelo NCTR / FDA.

Embora não esteja representado no vídeo, os ratos receberam primeiro uma dose excessiva de 300 mg / kg de pentobarbital, resultando em anestesia, em menos de 3 minutos, e em seguida mortos por decapitação. Os seus cérebros foram rapidamente mas então cuidadosamente removido do crânio e arrefeceu-se com gelo uma solução salina normal durante 5 min. É importante deixar a arrefecer o cérebro para esse período de tempo antes da dissecação do MAV modo que o VAM pode ser separado a partir da superfície do córtex (parte superior da camada I). O cérebro foi então colocado no fundo de uma placa de Petri de vidro repousando sobre gelo que foi completo (1 cm de profundidade) de solução salina gelada normal ou de sódio 0,1 M de tampão fosfato com pH = 7,4 salina. Todos dissecção é feita com o cérebro, na maior parte imersa em solução salina. 1. A remoção da glândula Pineal <ol><li> Colocar-se o cérebro do lado dorsal (em relação à parte inferior da caixa de Petri). A glândula pineal está localizado na região mais caudal ventral entre os dois hemisférios para t apenas rostraisele cerebelo (recesso pineal), e é um pouco abaixo ou na superfície das meninges mais colículo. Remover a glândula pineal primeiro usando duas pinças de ponta pequenos amassados. É na cor rosa, como o córtex, mas é frequentemente cercado de restos de sangue e vasculatura residual de remoção de cérebro. </li></ol> 2. A remoção do MAV <ol><li> Virar o cérebro mais &quot;cabeça para baixo&quot; e separar a artéria vertebral, artérias menores e meninges que recobrem a ponte das meninges e vasculatura do cérebro anterior. A remoção do MAV prosencéfalo é então iniciado. É importante começar ventralmente no processo de dissecação. Grandes artérias principais do círculo de Willis, artérias cerebrais médias (ACM) e artérias anteriores são fortes e servem como &quot;andaimes&quot;, pelo qual as artérias menores e arteríolas superficiais da pial membrana pode então ser removido a partir do córtex com o restante das meninges. Ver revisão por Scremin 7 para mrepresentações visuais de minério e detalhes da vasculatura cerebral superfície. </li><li> Começando com qualquer hemisfério, use a pinça ponta pequenas tortas de cortar a artéria comunicante posterior apenas posterior à conjuntura carótida interna. Assim, separando as árvores mais anterior e posterior arteriais do prosencéfalo. Repita o mesmo processo para o hemisfério contralateral. </li><li> Segurando a MCA ea artéria anterior com a pinça, puxe-a delicadamente em direção anterior-dorsal para que o MAV cobrindo o ventral anterior do córtex (piriforme, tubérculo olfatório) é levantado sobre e em torno do trato olfativo. Isto remove a maior parte do MAV cobrindo o córtex anterior (cingulado e orbital). </li><li> Ligue o cérebro em um ângulo de 45 ° a 90 para a placa de Petri. Os laterais, regiões mais anteriores do MAV em torno das regiões laterais corticais (insular granular, somatossensorial secundário e córtex auditivo) pode ser liberado a partir do córtex segurando a MCA e associados arters e puxando dorsalmente ao longo do córtex. Se necessário, as extremidades das pinças pode ser usado para levantar e libertar as principais artérias a partir do córtex durante a dissecção. </li><li> Agora retire as regiões mais posteriores laterais da MAV. (Nota, é melhor para passar de um a outro hemisfério, durante este processo de colheita para assegurar que a MAV permanece frio e hidratado. Além disso, se a resistência a libertar a partir do córtex MAV é encontrado em um interruptor hemisfério para o hemisfério contralateral temporariamente e depois voltar para o hemisfério original mais tarde.) </li><li> Para remover as regiões mais dorsais da MAV rodeiam a somatossensorial primário e córtex motor transformar-se o cérebro do lado dorsal (em relação à parte inferior da caixa de Petri). Para finalmente libertar a partir de MAV cerebrais, utilizar as extremidades das pinças ao longo do seio sagital. Esta porção do MAV colhido pode ser mantido temporariamente ou em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. Freqüentementeo MAV cobrindo as regiões mais posteriores / caudal do córtex entorrinal (córtices auditivos, visuais e mais caudal) permanece ligado ao córtex. Sua remoção é mostrado no final do vídeo quando o MAV entre o córtex retrosplenial e sobrepondo-se às colículos são dissecados. </li></ol> 3. A remoção do plexo coróide <ol><li> Coloque o lado do cérebro dorsal-se e mantenha no lugar com a pinça maiores Empurre os fórceps menores através da linha média entre os hemisférios e depois usar as extremidades para perfurar através do corpo caloso córtex e corpus (≈ -3,3 milímetros de bregma) na parte superior do a linha média do hipocampo. </li><li> Use as pinças para puxar o córtex com callosum longe do hipocampo dorsal e septo, expondo mais do ventrículo lateral. O plexo coróide podem ser localizados e identificados pela linha ondulada vermelha demarcação da artéria principal que executa o seu comprimento. Use as duas pontas das pinças para erguer as paredes laterais do terceiro ventricle e ampliá-lo no final mais caudal (≈ -4,3 milímetros de bregma 8). </li><li> Usando a pinça pequenos, puxe esta final do plexo coróide livre. Então vá para a região muito anterior entre o septo e caudado / putâmen (extensão mais rostral, ≈ 1,6 milímetros de Bregma) e com a pinça ampliar esta secção do ventrículo e puxar o plexo coróide livre. Execute o mesmo procedimento no hemisfério contralateral para obter a segunda restante do plexo coróide. Novamente, isto pode ser tecido ou mantidos temporariamente em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. </li></ol> 4. A remoção do MAV restante no ventrículo 3 º cobre o tálamo e colículo bem como que sobre as regiões mais caudal do Cortex incluindo Retrosplenial, Auditiva e Visual Cortex <ol><li> Remover todo o hipocampo de ambos os hemisférios, expondo o MAV sobre o tálamo e colículo. A remoção deesta porção da MAV é muito menos difícil do que a remoção de MAV sobre o córtex. </li><li> Puxe esta parte do livre MAV segurando a maior vascularização que recobre a porção anterior do tálamo e puxando caudalmente. Este vasculatura está ligado à rede coliculares supra e fornece sangue ao hipocampo dorsal de rede e tálamo dorsal. Puxar para fora caudalmente e gradualmente livre da rede supracollicular até alcançar as últimas porções da vasculatura círculo caudal arterial. Neste ponto, mais cuidados devem ser tomados para remover qualquer remanescente MAV posterior ventral na superfície do retrosplenial granular, auditivo primário e córtex visual. Tal como acontece com a outra secção de MAV cobrindo as porções mais anteriores do córtex, este tecido pode ser mantido temporariamente ou em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. Qualquer MAV posterior restante ventral colhidas com esta seção MAV segunda devem ser retirados umad adicionadas à secção MAV primeiro dissecados cobrindo o córtex se estão a ser analisados ​​separadamente. </li></ol> 5. Resultados representativos Quando a dissecção é executada correctamente, os tecidos resultantes MAV devem estar em duas entidades intactos, pesando cerca de 35-45 mg no total. O MAV inicialmente dissecadas circundante a maior parte do córtex deve pesar cerca de 25 mg e a MAV cobrindo o tálamo, o córtex occipital colículos e deve pesar cerca de 15 mg. Deve ser um pouco rosado na cor do sangue residual na vasculatura. O plexo coróide bilateral colhida devem estar em duas amostras de tecidos intactos, pesando cada um com 1 a 2 mg. Embora a água em excesso pode ser removido do MAV antes do armazenamento ou de processamento, usando papel de seda, como a utilizada na limpeza das lentes, a fim de evitar a perda de tecido que não é uma boa ideia para remover o excesso de água a partir do plexo coróide dissecado. Figura 1 foi gerado por comparando profil expressão<html> es em três regiões (estriado, córtex parietal e MAV) em condições de controle usando Agilent-014879 Whole Rat Genome 4x44K 60mer arrays de oligonucleotídeos (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Adesão # GPL7294; GSE23093 e GSE29733 que estão presentes em o NCBI repositório GEO). Os dois gráficos na figura pictoricamente mostrar a expressão em 1) no estriado em relação ao córtex parietal e 2) o MAV relação ao córtex parietal. É claro que o striatum eo córtex parietal são muito mais intimamente relacionada com o outro do que o VAM. Os dados que comparam o plexo coróide com o MAV serão apresentados numa publicação futura. No entanto, é provável que o perfil de expressão do MAV e do plexo coróide são mais estreitamente relacionadas entre si do que são para o striatum eo córtex parietal. Figura 2 mostra a resposta diferencial a expressão do gene para a hipertermia (EIH) versus AMPH em comparação MAV para controlar e cada um dos outros. conteúdo &quot;&gt; A expressão dos genes de mais de 11.000 genes com símbolos oficiais de genes do NCBI em MAV dos animais controle foi comparado ao registrado no estriado e do córtex parietal. Mais de 2000 desses genes tinha uma expressão de 2,5 vezes ou mais diferindo no MAV em comparação com os dois neuronal tecidos ricos, e 550 genes tinham uma diferença de 10 vezes maior em expressão. Ligeiramente mais do que 40% (253) eram genes com expressão diminuída de 10 vezes ou mais em MAV e estavam relacionados com função neuronal. Havia 343 genes com uma sobre expressão de 10 vezes ou mais, em comparação com MAV córtex parietal e striatum. Esta lista de genes foi utilizado como ponto de partida com o qual para determinar genes com um enriquecimento muito elevada na MAV. Tabela 1 lista os genes com maior do que a expressão de 15 vezes em comparação com MAV córtex parietal e corpo estriado e classifica-os em relação à função. Muitos destes genes foram relacionados com o sistema vascular e / ou do sistema imunológico. Estes tIPOS de genes deve ser enriquecido cerca de 5 - a 10 - vezes a causa do aumento da vasculatura e do sangue próprio presente nele. No entanto, mesmo para os genes com funções conhecidas gerais vasculares, um aumento superior a 15 vezes indica enriquecimento em MAV. Havia também um número de genes com grandes alterações de dobragem que eram: 1) proteínas da matriz extracelular de lípidos (não especificamente relacionadas com a vasculatura), 2) os transportadores de soluto e 3) e o metabolismo do ácido retinóico. Como o crescimento, bem poucos e genes de diferenciação ou fatores de transcrição foram encontrados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig1.jpg" /> Figura 1. Comparação da Expressão Gênica em MAV com córtex parietal e estriado. Enredo Vulcão comparando os níveis de expressão gênica do córtex parietal e estriado (gráfico em cima) eo córtex parietal e MAV (gráfico inferior). Os símbolos vermelhos denotam os genes que são significativamente diferentes entre níregiões banho de p &lt;0,05 e têm uma expressão diferencial de 1,5 vezes ou maior entre as regiões. Os símbolos pretos representam os genes que não são significativamente diferentes entre as regiões (p&gt; 0,05) e são menos do que 1,5 vezes na expressão diferentes. Os símbolos indicam genes rosa com uma diferença inferior a 1,5 vezes na expressão, mas uma diferença estatisticamente significativa a p &lt;0,05. Os símbolos amarelos identificar genes que têm uma expressão de 1,5 vezes ou superior, mas esta mudança não é estatisticamente significativa para p &lt;0,05. Abreviaturas Anfetamina AMPH EIH hipertermia induzida ambientalmente Meninges VAM e associado à vasculatura cerebral Norma normotérmica controla <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig2.jpg" /> Figura 2. Efeitos da hipertermia e anfetamina sobre a expressão gênica no MAV. Parcelas Vulcão comparandoníveis de expressão de genes no MAV depois salino, EIH ou AMPH no ponto de tempo de 3 horas. Os símbolos vermelhos denotam os genes que são considerados significativamente diferentes, enquanto os pontos pretos / círculos representam genes que não diferem significativamente entre as regiões. A análise estatística adicional foi usado para verificar que a expressão diferenças entre o controlo e os tratamentos foram de facto estatisticamente significativa. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> MAV Expressão Cérebro Expressão </td><td fo:width="4.5in"> Símbolos NCBI Gene </td><td fo:width="1.5in"> Especificidade tecido ou função referida (s) </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Anxa2 um, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kl um, Lect1, Lepr, Lum, Myh11, OGN, Tagln, Thbs2, TNNT2 </td><td> Vasculatura &amp; coração </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Ccl19, CD74 a, Defb1, Lrrc21, MGL1, MRC1, Msln, Pla2g5, Prg4, RT1-Bb, RT1-Da </td><td> Sistema Imune </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Adh1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 </td><td> Ácido retinóico e Processamento de lipídeos </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> CDH1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, Gpc3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 </td><td> Extracelulares junções Matrix &amp; célula-célula </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr </td><td> Ion &amp; Homeostase Solute </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Alx3, Cdkn1c, FOXC2, IGFBP2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, Sfrp1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 </td><td> Desenvolvimento e regulação da transcrição </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 </td><td> Desconhecido &amp; Diversos </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td&gt; <td> Anxa1 um, Angpt2, C6 a, GJB2 Ptgis, Thbd, Timp1 </td><td> Vasculatura &amp; coração </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Casp12, CCL2, CCR1, Cd14, Cxcl10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, LGALS3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, SPP1, Xcl1 </td><td> Sistema Imune </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Col6a3, Cpxm1, Efemp1, FMOD, pop, Nid2 </td><td> Extracelulares junções Matrix &amp; célula-célula </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Cp, Cubn, Gcgr, S100a6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 </td><td> Ion &amp; homeostase Solute </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Cfd, Ch25h, Crabp2, Rarres2 </td><td> Ácido retinóico e Processamento de lipídeos </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> BMP6, Casp12, Dab2, Folr1, IGF2, Msx1, Tbx18, Twist1, Wnt5b </td><td> Desenvolvimento e regulação da transcrição </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Cela3b, CLN6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim </td><td> Desconhecido &amp; Diversos </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf um, Cnn1, Cox8h, CTSK, F13a1, Gja5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnip um, Vamp5, VTN </td><td> Vasculatura &amp; coração </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Ada um, Bst2, Ccl6, CD40, CD68, CTSC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-DB1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 </td><td> Sistema Imune </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Adamtsl4, COL1A1, Crb3, DPT, Egfl3, Fbn1, Fbln1, FBLN5, Fn1, ITGB4, LAMA2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, Mmp14, Mmp23, CIPP, SERPINH1, TIMP3 </td><td> Extracelulares junções Matrix &amp; célula-célula </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Cybrd1, Selenbp1, Slc2a4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 </td><td> Ion &amp; homeostase Solute </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> AGPAT2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, Pon3, Rbp1, RBP4 </td><td> Ácido retinóico e Processamento de lipídeos </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Atf3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, ptrf, Sphk1, Tgfbi, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 </td><td> Desenvolvimento e regulação da transcrição </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, Enpep, Enpp2, Epn3, Flna, FMO3, Gnmt, Gprc5c, Hspb1, Klc3, Krt18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, Sult1a1, Tmem106a, Wfikkn2 </td><td> Desconhecido &amp; Diversos </td></tr></tbody></table> * Genes incluídos na tabela deve ser tanto a expressão mais de 15 vezes acima do estriado e PARIETal córtex e de 5 vezes acima dos níveis de fundo. Quanto mais baixa das duas taxas (MAV / estriado ou MAV / córtex parietal) para cada gene foi usado para agrupamento. um Genes são encontradas nas células endoteliais, mas também provavelmente desempenham um papel importante na mediação de respostas imunes. Tabela 1. Genes com uma * 15 vezes ou mais a expressão aumentada em comparação com MAV striatum eo córtex parietal.

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflicted+traumatic+brain+injury+in+infants+and+young+children.">Inflicted traumatic brain injury in infants and young children.</a> Brain Pathol. 18, 571-582 (2008).</li><li>Maas, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+computerized+tomography+scan+characteristics+in+traumatic+brain+injury:+results+from+the+IMPACT+study.">Prognostic value of computerized tomography scan characteristics in traumatic brain injury: results from the IMPACT study.</a> J. Neurotrauma. 24, 303-314 (2007).</li></ol>

Não temos nada a revelar. O trabalho aqui apresentado pode não representam, necessariamente, a opinião do Food and Drug Administration.

Aspectos técnicos da MAV e dissecação do plexo coróide É crítico durante a dissecção do MAV ter o cérebro &quot;submergida&quot; na maioria das vezes em solução salina normal ou de sódio tamponada com fosfato. Permitindo que o VAM e córtex para desidratar durante a dissecção resultará na MAV aderindo firmemente a camada cortical I. Isto irá aumentar a quantidade de tecido cortical e colhida com o MAV / ou resultar na incapacidade de remover estas secções MAV aderentes a partir do córtex. Além disso, a paciência é necessária durante a dissecção. Mais uma vez, se encontra uma certa resistência na remoção do MAV do córtex em um hemisfério durante a dissecação, mude para o outro hemisfério e voltar mais tarde para o lado onde a resistência foi encontrado. Este método faz um pouco de prática para aperfeiçoar e requer cerca de 5 a 15 &quot;práticas&quot; dissecções antes uma colheita consistentemente uniforme de tecido MAV é alcançado. O método de começar a dissecção e removal do MAV no círculo arterial na base do cérebro, facilita a remoção das meninges, utilizando o maior vasculatura como suporte &quot;andaime&quot;. Grande parte do sangue originalmente na vasculatura MAV após o sacrifício deverá ser ejectado durante a dissecação, e menos de 5% do RNA colhido MAV devem ser de origem arterial. É possível remover quase todo o sangue por perfusão do animal, com 50 a 70 ml de solução salina, utilizando técnicas histológicas, antes de decapitação e remoção do cérebro. No entanto, é, em seguida, muito mais difícil de visualizar os tecidos MAV durante a dissecção. As três fontes mais prováveis ​​de &quot;contaminação&quot; dos tecidos MAV são a glândula pineal, camada cortical I tecido e tecido bulbo olfativo residual, mas também é possível obter o tecido da glândula pituitária na preparação. Contaminação pineal no MAV é detectado pelo MAV contendo uma ronda 1-2 esfera mm de diâmetro que é vermelha escura. A função primáriada glândula pineal é normalmente considerado completamente diferente do MAV. A sua função principal é produzir melatonina, que regula os aspectos do ritmo circadiano 9, e em 10 de lipoxigenação precursores lipídicas. Embora o Lox gene que regula a actividade de lipoxigenase, pensava-se estar presente em adultos, principalmente na glândula pineal 10, os nossos resultados indicam que é também consistentemente presente em níveis significativos em MAV. Residuais resultados bulbo olfativo corticais ou contaminação no rosada tecido MAV na web como ter algumas 1-2 milímetros tecidos mais densos que são muito mais pálida na cor incluído nele. Isto pode ser visto por &quot;flutuar&quot; do MAV na superfície do tampão, e, em seguida, removendo os tecidos mais pesados ​​corticais ou ampola, utilizando as duas pinças de dissecação. Se a contaminação da camada cortical MAV de I tecido, tecido hipotalâmico ou a glândula pineal está presente, então, vários genes terão uma signifiexpressão significativamente maior do que o que está normalmente presente em uma dissecção &quot;limpa&quot;. A contaminação do MAV com glândula pineal irá resultar em maior expressão de aril-alquilamina N-acetiltransferase (Aanat) que é necessário para a síntese da melatonina. Infelizmente, se a contaminação pineal ocorre durante a dissecção MAV, os níveis de Lox em MAV não será capaz de ser determinada com precisão. A contaminação do MAV com tecido cortical irá resultar em maior expressão de genes específicos de neurónios, como hippocalcin (Hpca), parvalbumina (Pvalb) e / ou receptor pentraxina neuronal (Nptxr). A contaminação de MAV com tecido hipotalâmico resultará no aumento da expressão da hormona de crescimento 1 (Gh1), ​​proopiomelanocortina (POMC). No caso em que alguma contaminação não existe nos tecidos colhidos, a maioria destes genes pode ser identificado e não usado em análise de expressão génica. Isto é particularmente importante para os genes presentes no blo circulanteod que ainda podem estar presentes na MAV ou plexo coróide. Interpretting dados de expressão gênica provenientes da colheita da MAV e plexo coróide A superfície cerebral (superficial) a vasculatura juntamente com meninges associadas (MAV) e o plexo coróide são necessárias para o fluxo de sangue cerebral e fluido cerebrospinal (CSF) a homeostase 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. A colheita de tecido é apropriada para análises bioquímicas e fisiológicas, e o VAM tem sido mostrado para ser sensível aos danos produzidos por anfetamina e 1,2 hipertermia por meio de análise de expressão génica. Estes resultados estão relacionados com o que também é conhecido sobre a hipertermia severa e exposição a anfetaminas na vasculatura cerebral, em geral, 18,19,20. Dados clínicos humanos apóia a crença de que a vasculatura subdural é sensível a danos por 21,22 anfetaminas e metanfetaminas. Como assim, as maiores e menores vasculatures cerebrais includção aqueles na camada pial das meninges que são colhidas em MAV são de interesse potencial elevado quando se investiga tipos concussivas de traumatismo craniano 23,24 25. O perfil de expressão gênica atual resultou da MAV indica que o pial e, possivelmente, as membranas aracnóide das meninges pode desempenhar um papel maior do que o esperado na regulação composição CSF. No futuro, por meio da utilização de técnicas de microscopia de dissecação, pode ser possível para separar ainda mais os tecidos que constituem a MAV, de modo que as membranas pial e aracnóide pode ser separado a partir do presente vasculatura arterial maior e, possivelmente, um do outro. Isto irá permitir uma melhor interpretação da função de cada um destes três componentes da MAV colhida.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Solução salina normal (9 gramas de solução salina / 1 litro de H 2 O) </td><td> Interno </td><td></td><td> Buffer de dissecção </td></tr><tr><td> 0,1 M fosfato de sódio pH 7,4 </td><td> Interno </td><td></td><td> Buffer de dissecção </td></tr><tr><td> Rongeurs osso </td><td> Roboz </td><td> RS-8300 </td><td> Remoção de osso do crânio </td></tr><tr><td> Fórceps curvado ponta (4 &quot;de comprimento e 0,8 mm de largura ponta) </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 ou RS-5137 </td><td> Fórceps de dissecação </td></tr><tr><td> Fórceps reto-ponta (5,5 &quot;de comprimento) </td><td> Roboz </td><td> RS-8124 ou RS-8104 </td><td> Molho pinça polegar </td></tr></tbody></table>

a visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain

Esta apresentação de vídeo foi criado para mostrar um método de colheita das duas mais importantes estruturas altamente vasculares, que não reside no cérebro próprio, que a função do cérebro anterior de apoio. Eles são a superfície cerebral (superficial), juntamente com vasculatura meninges associados (MAV) e plexo coróide que são necessárias para o fluxo sanguíneo cerebral e do líquido cefalorraquidiano (LCR) homeostase. O tecido colhido é adequado para análises bioquímicas e fisiológicas, e o MAV tem sido mostrado para ser sensível aos danos produzidos por anfetamina e 1,2 hipertermia. Como assim, as maiores e menores vasculatures cerebrais colhidas no MAV são de interesse potencialmente elevado ao investigar tipos concussive de traumatismo craniano. O MAV dissecados nesta apresentação consiste no pial e alguns da membrana aracnoideia (dura menos) das meninges e os vasos de superfície maior e menor cerebral. O plexo coróide dissecado é a estrutura que reside no lateral ventrículos como descrito por Oldfield e McKinley 3,4,5,6. Os métodos utilizados para a colheita de estes dois tecidos também facilita a colheita de tecido cortical regionais desprovido de meninges e vasculatura cerebral maior superfície, e é compatível com a colheita de tecidos cerebrais, tais como estriado, hipotálamo, hipocampo, etc A dissecação dos dois tecidos leva 5-10 total de min. Os níveis de expressão de gene para a MAV dissecados e do plexo coróide, como mostrado e descrito nesta apresentação podem ser encontradas em GSE23093 (MAV) e GSE29733 (plexo coróide) no repositório GEO NCBI. Estes dados têm sido e estão sendo, utilizados para ajudar a compreender melhor o funcionamento do MAV e do plexo coróide e como neurotóxicos eventos, tais como a hipertermia grave e AMPH afectar adversamente a sua função.

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A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Este vídeo de apresentação mostra um método de colheita das duas mais importantes estruturas altamente vasculares que suportam a função do cérebro anterior. Eles são a superfície cerebral (superficial), juntamente com vasculatura meninges associados (MAV) e plexo coróide que são necessárias para o fluxo sanguíneo cerebral e do líquido cefalorraquidiano (LCR) homeostase.

A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

a-visual-description-dissection-cerebral-surface-vasculature

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.9K visualizações.  National Center for Toxicological Research. Este vídeo de apresentação mostra um método de colheita das duas mais importantes estruturas altamente vasculares que suportam a função do cérebro anterior. Eles são a superfície cerebral (superficial), juntamente com vasculatura meninges associados (MAV) e plexo coróide que são necessárias para o fluxo sanguíneo cerebral e do líquido cefalorraquidiano (LCR) homeostase.

Vídeo: A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

Modelo de isquemia focal cerebral por oclusão Suture Endovascular da artéria cerebral média no Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Neurociência

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visual Gravação Potencial Evocado em um modelo de rato de Experimental Nervo Óptico desmielinização

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Um método volumétrico para quantificação de vasoespasmo Cerebral em um modelo murino de hemorragia subaracnoide

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Extraction and Dissection of the Domesticated Pig Brain

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular systems, gastrointestinal systems, and nutrition, and the pig is increasingly being used as a large animal model in neuroscience. Furthermore, the pig is an accepted model to study neurodevelopment as it displays brain growth and development patterns similar to what occurs in humans. As a less common animal model in neuroscience, surgical and dissection procedures on pigs may not be as familiar or well-practiced among researchers. Therefore, a standardized visual protocol detailing consistent extraction and dissection methods may prove valuable for researchers working with the pig. The following video showcases a technique to remove the pig brain while keeping the cortex and brainstem intact and reviews methods to dissect several commonly investigated brain regions including the brainstem, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus, and medial prefrontal cortex. The purpose of this video is to provide researchers with the tools and knowledge necessary to consistently perform a brain extraction and dissection on the four-week-old pig.

This protocol details the technique for removal of the pig brain in its entirety and dissection of several brain regions commonly studied in neuroscience.

Extração e Dissecção do Cérebro de Suínos Domesticados

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular ...