Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da ACS, incluindo T32CA009135, CA133027, CA070723, e CA022443. Bill Sugden é um American Cancer Research Professor Sociedade.

1. Engenharia de células com plasmídeos visíveis <ol><li> Use padrão de digestão de restrição ou técnicas de recombinação homóloga para introduzir um fragmento de DNA contendo aproximadamente 250 cópias da sequência do operador lactose (laço) no plasmídeo a ser visualizada. Nossa plasmídeo foi um bacmid de aproximadamente 170 kbp e continha o genoma completo do vírus do Sarcoma de Herpes de Kaposi associado (KSHV) e da resistência à higromicina codificada 12. </li><li> Introduzir LACO contendo o ADN plasmídico em células de mamífero através de transfecção com Lipofectamine 2000. Nós transfectadas células HeLa e SLK em 60 pratos mm para 4 h com 10 ug de ADN do plasmídeo purificado com 25 ul de Lipofectamina 2000, 0,5 ml OptiMEM, e 3,5 ml de DMEM. </li><li> Alterar o meio de cultura para 5 ml de DMEM com 10% de soro fetal de bovino e células incubar durante 48 hr. </li><li> As células em placa de baixa densidade em pratos de cultura e as células grandes em meio contendo um antibiótico de selecção para o pla introduzidosmid, sendo selecionados células em DMEM com 10% de soro fetal bovino com 300 ug / ml de higromicina durante 3 semanas. </li><li> Use pedaços de estéril, papel de filtro embebido com tripsina para transferir as colónias resistentes à higromicina para novas placas de cultura. </li><li> Quando os clones transfectados foram cultivadas para encher o prato, para isolar o ADN de digestão de restrição e transferência Southern para assegurar que o polímero da LACO plasmídeo é homogéneo e do tamanho esperado. </li><li> Se o plasmídeo não foi manipulada para expressar a fusão de Lacl, infectar clones adequados com um retrovírus que codifica o repressor de lactose (LacI) fundido com uma proteína fluorescente vermelha, como LacI-tdTomato. Usamos tdTomato em vez de proteínas que apresentam fluorescência verde mais próxima para minimizar photoxicity que poderia ocorrer a partir de múltiplas exposições mais longas 13 vezes. </li><li> Uma vez que a proteína de fusão de Lacl é introduzido, a cultura das células na presença de 200 ug / ml de isopropil-bD-tiogalactósido (IPTG) para bloquear as proteínas de fusão de ligaçãoDNA. </li><li> Cultura das células durante pelo menos 3 dias para permitir a expressão da proteína Lacl-tdTomato. </li><li> Clones de tela (por lavar o IPTG e visualização de células como descrito abaixo) para aqueles com níveis ótimos de LacI-tdTomato que revelam sinais distintos com níveis de fundo mínimos de proteína de fusão não ligado. </li></ol> 2. Desenvolvimento do Sistema de Imagem Nosso sistema de imagem consiste de um 200M Zeiss Axiovert equipados com um palco motorizado e Plano Aochromat-objetivo petróleo 63x/1.4. Luz de excitação de fluorescência é fornecida pela &quot;branco neutro&quot; LED de um sistema Colibri. Emissão é detectada por um CascadeII: 1024 EMCCD câmara. Trata-se de uma câmara, arrefecido back-diluído com um registo de ganho para sinais de amplificação, a corrente escura é 0,061 electrões por pixel por segundo, e a eficiência quântica é maior do que 0,90. O sistema é controlado por software Axiovision 4,8, incluindo o módulo SmartExperiments. Para a detecção de tdTomapara usamos um Zeiss 75HE conjunto de filtro para o qual 85% da luz que passou pode excitar o flúor e 95% da luz emitida passa o filtro de emissão. <ol><li> Montar um sistema de imagens com um microscópio invertido e uma câmara EMCCD para detecção sensível de sinais, uma fonte de luz LED para excitação específica e rápida de cofragem, uma fase motorizada e braço de focagem, e o controlo de software de aquisição automática de imagens sobre os intervalos de tempo longos, com múltiplas z-pilhas. O sistema deve sentar-se sobre uma mesa de ar para ser isolado a partir de vibração. </li><li> Montar uma incubadora fase superior para manter as células a 37 ° C, 5-10% de CO 2 numa câmara humidificada. Permitir tempo suficiente para que o sistema venha a uma temperatura estável para minimizar a artefactos de movimento durante a experiência. </li><li> Usar um colar aquecida para que o objectivo de evitar o objectivo de sifonagem de calor a partir da amostra. </li></ol> 3. Visualização do DNA etiquetado <ol><li> Células da placa em um de 35 mmcom fundo de vidro prato com uma densidade de menos de confluência de 10%, o que irá permitir que os pares de células se dividirem em colónias de 8-16 células sem sobreposição. Fazer isso, pelo menos, 24-48 horas antes de imagiologia de modo a que as células viáveis ​​têm tempo de se dividir. </li><li> Uma a três horas antes do início da imagiologia, lavar a placa 3 vezes com meio de cultura que não possui ambos os fármacos selectivos e IPTG. Este procedimento lava células não viáveis ​​e permite que as proteínas de fusão de Lacl para ligar sítios LACO nos plasmídeos. </li><li> Substituir o meio de cultura com 2 ml de DMEM com 10% de soro fetal bovino e 25 mM de HEPES. </li><li> Substituir a parte superior do prato de cultura com CultFoil esticada em um anel de montagem de um prato de 35 mm. Esta cobertura irá inibir a evaporação do meio de cultura, o que aumentaria a concentração de sal ao longo do tempo e matar as células. </li><li> Use contraste de interferência diferencial de imagem (DIC) para visualizar as células e determinar o plano focal da parte superior e inferior das células em vários campos de visão.Em cada campo, mover-se para um plano focal de aproximadamente 1/3 do caminho para baixo a partir da parte superior da célula. Salve o x, y, z coordena na lista de posições de palco salvos. Nota: Os sinais de plasmídeo não pode ser visível através das oculares, quando as células são iluminadas por LEDs de comprimento de onda apropriado para a proteína de fusão de Lacl. Sinais fracos podem ser apenas visível com o uso da câmara EMCCD, que permite a integração do sinal ao longo do tempo e, assim, de forma eficaz amplifica sinais fracos. </li><li> No software de controlo do microscópio, definir um z-pilha de imagens a serem realizadas em cada posição de fase salvas. Escolha az tamanho do passo de 0,35-0,50 um, que irá permitir que você amostragem de Nyquist aproximado na dimensão z 14. Incluem &quot;extra&quot; fatias acima e abaixo dos planos em que as células estão localizadas; essas fatias permitir a detecção de células seguindo os movimentos durante o ciclo celular, e são também usados ​​em pós-processamento de aquisição (desconvolução) das pilhas de imagens. Esta inclusão vairesultar em uma pilha de 40-60 imagens, dependendo da espessura das células. </li><li> No software de controlo do microscópio, definem uma série de experiências de tempo para recolher uma imagem de campo brilhante da z-stacks em intervalos de 30 minutos (para o rastreamento de divisões celulares e migrações durante tempos longos) e as imagens de fluorescência em intervalos de 10-60 min (para a visualização de plasmídeos no interior das células). Não utilizar imagiologia DIC durante a experiência, uma vez que requer mais luz do que imagens de campo brilhante padrão, que pode expor as células desnecessariamente a fototoxicidade, ao longo das experiências de comprimento. </li><li> Iniciar a experiência controlada por software. Garantir que o sistema não é perturbado (batido, expostos à luz ambiente em excesso, etc) durante o experimento. </li><li> Se necessário, repor a água no sistema de humidificação durante a experiência. </li></ol> 4. Pós-aquisição de Processamento de Imagens <ol><li> Reveja as imagens para cada ponto z-stack e tempo. Recortar as áreas desnecessárias deas imagens para reduzir o tempo de processamento do computador no passo seguinte. </li><li> Usar um algoritmo de desconvolução para atribuir novamente a intensidade do sinal para o pixel de origem, em cada 15 z-stack. Enquanto isto deconvolução pode ser baseada em uma função teórica ponto spread para o seu sistema de imagens, é preferível para medir a função propagação do ponto de seu sistema particular por imagem microesferas fluorescentes, e usar esta medida no algoritmo de deconvolução. Nós medimos a função de propagação do ponto de nosso sistema de imagem e aplicou um. Constrangido algoritmo iterativo máxima verossimilhança na AxioVision software (AxioVision descrição do software, Zeiss) </li><li> Examine as imagens para acompanhar as mudanças de intensidade e movimentos de plasmídeos durante o ciclo celular e particionamento de plasmídeos para as células filhas. </li></ol>

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	<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li><li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi's+sarcoma.">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li><li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner.">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li><li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells.">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li><li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence.">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li><li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV's+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells.">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li><li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+Kaposi's+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals.">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li><li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome:+application+for+genetic+analysis.">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+pixels,+and+gray+levels:+digitizing+image+data.">Points, pixels, and gray levels: digitizing image data.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+enhancement+by+deconvolution.">Image enhancement by deconvolution.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui descrito pode ser usado para seguir os plasmídeos em células vivas de mamíferos ao longo do tempo que mede múltiplas gerações. Ao limitar a exposição à luz de excitação, temos usado estas técnicas a seguir a partir de pares de células recém-divididas através de colónias de células 16-32, o que representa, pelo menos, 72 horas e 3 divisões celulares. Estas experiências fornecem informação que não pode ser obtida a partir de ensaios estáticos, tais como PCR quantitativo, Southern blot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Higromicina </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> 400 ug / ml para o SLK, 300 ug / ml para as células HeLa </td></tr><tr><td> Isopropil-bD-tiogalactósido (IPTG) </td><td> Roche </td><td> 10 724 815 001 </td><td> Concentração final de 200 ug / ml </td></tr><tr&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Com fundo de vidro pratos </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> Neutro LED branco </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro Cube 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Plano Apochromat-objetivo 63x/1.4 </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD câmara </td><td> Fotometria </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol mini- </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 digitais </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI controlador digital de 3700 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> Aquecedor objetivo </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio de aquecimento inserção P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio top-Incubadora S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema umidificador </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring plasmid replication in live mammalian cells over multiple generations by fluorescence microscopy

Alguns plasmídeos de ocorrência natural são mantidas em células de mamíferos. Entre estes estão os genomas de gama-herpesvírus, incluindo o vírus Epstein-Barr (EBV) e Sarcoma de Kaposi associado herpesvírus (KSHV), que causam várias doenças malignas humanas 1-3. Estes dois genomas são replicadas de forma licenciada, cada um utilizando uma única proteína virai e maquinaria de replicação celular, e são passados ​​para as células filhas durante a divisão celular, apesar de suas faltam centrómeros tradicionais 4-8. Muito trabalho tem sido feito para caracterizar as repetições destes genomas de plasmídeos usando métodos tais como Southern blotting e hibridação in situ fluorescente (FISH). Estes métodos são limitados, no entanto. Quantitative PCR e Southern blots fornecer informações sobre o número médio de plasmídeos por célula, numa população de células. FISH é um ensaio de célula única que revela tanto o número médio e a distribuição do plasmídeo<html> s por célula na população de células, mas é estático, não permitindo que a informação sobre os pais ou descendência da célula examinadas. Aqui, nós descrevemos um método para a visualização de plasmídeos em células vivas. Este método baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado lactose repressor para múltiplos locais no plasmídeo de interesse 9. O DNA de interesse foi concebido de modo a incluir de cerca de 250 repetições em tandem do operador lactose (laço) sequência. LACO está especificamente ligada pela proteína do repressor de lactose (LacI), que pode ser fundido a uma proteína fluorescente. A proteína de fusão pode ser expressa a partir do plasmídeo de engenharia ou introduzido por um vector retroviral. Deste modo, as moléculas de ADN são marcados por fluorescência e, portanto, tornam-se visíveis por meio de microscopia de fluorescência. A proteína de fusão é impedido de se ligar ao DNA de plasmídeo por cultura de células na presença de IPTG até os plasmídeos estão prontos para ser visualizado. ONTEÚDO &quot;&gt; Este sistema permite que os plasmídeos de ser controlados em células vivas através de várias gerações, revelando as propriedades da sua síntese e separação de células filhas. ideais são células aderentes, facilmente transfectada e têm núcleos grandes. Esta técnica tem sido utilizada para determinar que 84% dos doentes com EBV-derivados plasmídeos são sintetizados cada geração e 88% da partição plasmídeos recém-sintetizado fielmente às células em células HeLa. Pairs destes plasmídeos EBV foram vistos a ser ligado a ou associado com cromatídeos irmãos após a sua síntese em S- fase até que se viu a separar como os cromatídeos irmãos separados em Anáfase 10. O método está a ser utilizado para estudar a replicação do genoma KSHV em células HeLa e células SLK. células HeLa são imortalizadas células epiteliais humanas, e as células são imortalizadas SLK endoteliais humanas células. Embora as células SLK foram originalmente derivadas de uma lesão KSHV, nem a células HeLa, nem SLK linha celular naturalmente harbgenomas ors KSHV 11. Além de estudar a replicação viral, esta técnica de visualização pode ser utilizado para investigar os efeitos da adição, remoção, ou mutação de vários elementos de ADN de sequências de síntese, localização e separação de outros DNAs de plasmídeo recombinante.

<html> Projecções intensidade máxima de z-stacks adquiridos numa experiência representativa são apresentados na Figura 3. Típicos sinais de plasmídeos estão presentes em 3-8 fatias do z-pilha, dependendo se eles representam único ou grupos de plasmídeos. No caso do EBV e do KSHV derivados de plasmídeos, os sinais de mover-se lentamente no interior da célula até a célula atinge a mitose. As próprias células migram ao longo do curso do experimento. Eles também tornam-se esféricos e destac...

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Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Um método de se observar as moléculas individuais de DNA em células vivas é descrito. A técnica baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado repressor lac para os locais de ligação para a engenharia de ADN de interesse. Este método pode ser adaptado para seguir muitas DNAs recombinantes em células vivas ao longo do tempo.

Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

monitoring-plasmid-replication-live-mammalian-cells-over-multiple

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K visualizações.  University of Wisconsin - Madison. Um método de se observar as moléculas individuais de DNA em células vivas é descrito. A técnica baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado repressor lac para os locais de ligação para a engenharia de ADN de interesse. Este método pode ser adaptado para seguir muitas DNAs recombinantes em células vivas ao longo do tempo.

Vídeo: Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...