Agradecemos ao Dr. Craig Roy e Dr. Dario Zamboni para fornecer um modelo para infecções protozoário. Agradecemos ao Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron e Todd Wisner para equipamentos e reagentes; Dr. Lulu Cambronne para revisão crítica do manuscrito. Citometria de fluxo foi realizada no Fluxo de instalação Citometria de Recursos OHSU compartilhado. Este trabalho foi financiado em parte por uma doação da Fundação de Pesquisa Médica de Oregon e uma concessão de NIH R21 AI088275 (EDC).

1. Preparação das Culturas Legionella pneumophila para infecções Estágio Escorvante <ol><li> Transformar toda L. estirpes pneumophila utilizados no ensaio com as pAM239 plasmídeo, que codificam uma isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) induzível da proteína verde fluorescente (GFP) 28. Streak as estirpes bacterianas em ferro e de cisteína suplementado N-(2-Acetamido)-2-aminoetanossulfónico (ACES) tamponada carvão ágar com extracto de levedura (CYEA) contendo 6,25 ug / ml de cloranfenicol (CM) (para a manutenção do plasmídeo) e incubar durante 72 hr a 37 ° C. </li><li> Transferir um inoculo da estirpe bacteriana em ACES suplementados tamponada caldo de extracto de levedura (AYE) com 6,25 ug / ml de CM e IPTG 1 mM e cultivar até à fase estacionária (O / N) num agitador orbital a 37 ° C. </li><li> Confirmar a expressão da GFP em culturas in vitro, utilizando a microscopia de fluorescência. Transferem-se 10 ul de cultura sobre uma lâmina de vidro sob uma coberturadeslizamento e imagem através de uma objectiva 60X com excitação GFP / cubo de emissão (AMG EVOS fl). </li><li> Diluir uma alíquota de 100 ul de cada cultura in vitro utilizando a 1:10 estéril H 2 O. Faça um branco usando 100 ul AYE media com IPTG 1 mM e 6,25 ug / cm ml e água. Tome OD600 medições das diluições usando um espectrofotómetro (Bio-Rad inteligente Spec Plus). Calcula-se o volume necessário para infectar um bem a um MOI = 20 para cada cultura in vitro: V = [(ameba seeded) x MOI] / [OD 600 x (factor de diluição) x (constante)] = [(1 X 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Concentração de bactérias é determinada como OD 600 = 1,0 = 1 x 10 9 CFU / ml. </li></ol> 2. Infecção Priming palco usando Acanthamoeba castellanii <ol><li> Manter e cultivar as amebas em meio ATCC PYG 712 em 175 cm 2 frascos de RT. </li><li> Substituir a mídia em cul amebasturas 24 h antes do início das culturas bacterianas de líquidos. No mesmo dia, líquidos culturas bacterianas são iniciados, recolha e contagem de células num microscópio de luz, utilizando um hemocitómetro. </li><li> Diluir as amebas com meio fresco para uma concentração final de 1 x 10 6 células / ml. Semente 12 poços de células placas de cultura com alíquotas de 1 ml da amebas utilizando um pipetador de repetição e incubar à temperatura ambiente O / N. </li><li> Após incubação, lava-se os poços das placas de 12 poços de cultura de células 3x com 1 ml de PBS estéril através de uma pipeta de 10 ml serológicos e um auxiliar de pipeta manual. </li><li> Após a aspiração do PBS, adicionar 1 ml de meio de infecção (ATCC 712 media PYG menos glicose, peptona, extrato de levedura e) com IPTG 1 mM e 6,25 ug / ml cm a cada poço. Incubar as placas à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Infect poços a um MOI = 20. Centrifugar a placa a 400 xg durante 5 min (Eppendorf 5810R) e flutuar num banho de água a 37 ° C durante 5 min. Transferir a placa para um de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante 18 horas. </li><li> Confirmar as infecções usando imagens de células vivas em um microscópio de fluorescência antes de sediar a lise celular e colheita de bactérias. </li></ol> 3. Semeando células THP-1 para a Target Infecção estágio celular <ol><li> (Comece este processo 24 horas antes de definir-se líquidos culturas bacterianas). Cultivar células THP-1 a 75, em cm 2 frascos de cultura para quase-confluência em meio RPMI 1640 com 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS). </li><li> Contar as células em suspensão utilizando um hemocitómetro, diluir as células THP-1 em meio RPMI 1640 com FBS a 10% e 100 ng / ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) para uma concentração de 1 x 10 6 células / ml , e prato em alíquotas de 1 ml em placas de 12 poços de cultura de células. Incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 4. Transformação de bactérias para a Target Infecção estágio de célula após a infecção Estágio Priming <ol><li> Aspirar a mídia da amebas preparado. </li><li> Lisam a ummoebae usando 500 ul de gelo frio, estéril de ultra-filtrado (UF) de H 2 O e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> O pool de lisados ​​de acordo com o tipo de estirpe e tomar uma medida nm E 512 para cada um dos lisados ​​agrupados utilizando um leitor de placas de fluorescência (Molecular Devices Spectramax Gêmeos EM). </li><li> Calcule um OD 600 de medição para os lisados ​​agrupados: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - fundo lisado) + 0,0019. A fórmula foi previamente determinada representando graficamente uma comparação directa de ambos o OD 600 e os E 512 nm medições de diluições de L. pneumophila GFP do tipo selvagem expressar de fase estacionária de cultura in vitro (Figura 1 *). Os lisados ​​de ameba não infectado, sujeitos às mesmas condições experimentais, a ameba infectada, são utilizadas como um espaço em branco, e desde um valor de correcção (por exemplo, fundo lisado), que foi incorporado na equação. O volume necessário tó infectar um bem a um MOI = 20 é calculada para cada pool de lisado: V = [(THP-1 sem sementes) MOI x] / [calcOD 600 x (constante)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600. </li><li> Lave as células THP-1 3x com PBS e adicionar 1 mL de RPMI fresco 1640 (10% de FBS) em cada poço. Incubar as células THP-1 durante 1 hora a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Infectar as células THP-1 na MOI calculada usando os lisados ​​pool. Permitir que um conjunto de cavidades de não ficam infectadas, servindo como um controlo negativo para a análise de citometria de fluxo. Processamento da fase de escorvamento deve ser concluída em menos de 30 min. Os lisados ​​foram mantidos em gelo para limitar as alterações na expressão de genes de bactérias antes da infecção. </li><li> Centrifugar a placa, flutuar para aumentar a temperatura, e incubar como na fase de escorvamento. </li><li> Uma hora após a infecção, que remove o suporte por aspiração e lavar os poços 3x com PBS para remover as bactérias extracelulares. </li><li> Adicione 1 ml fresh RPMI 1640 (10% de FBS) aos poços e devolver a placa à incubadora. O tempo imediatamente após a troca de mídia serve como tempo zero (T 0). Incubar as células THP-1 de 14-16 horas a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 5. Análise Experimental 5,1 imagens de células vivas Imagem cavidades infectadas, utilizando um microscópio de fluorescência (AMG EVOS fl) em 10X ou 20X de ampliação (Figuras 1A-D). As imagens podem ser comparadas, quer qualitativamente ou quantitativamente para determinar os níveis de infecção em ambas a fase de escorvamento e de infecções alvo estágio de células. A citometria de fluxo 5,2 <ol><li> Os picos de emissão de infecções diferentes podem ser comparados através de citometria de fluxo (FACS Calibur BD). Tripsinizar as infectadas células THP-1 e gentilmente lavá-los a partir dos poços através da mistura em PBS com uma pipeta. </li><li> Reunir as células de tipo tensão em tubos Falcon de 15 ml e de pelotas a 1800 xg durante 2min na centrífuga de topo de mesa. </li><li> Suspender as pelotas em 1 ml de PBS e transferir para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar as suspensões a 1.800 x g (Eppendorf 5424) e re-suspender as pelotas em 1 ml de PBS. Se as suspensões resultantes são altamente turva (OD 600 ≥ 1.0) eles devem ser diluídos em PBS adicional (1:3), para evitar o entupimento das linhas no citómetro de fluxo. </li><li> Use PBS estéril filtrada para equilíbrio do citómetro de fluxo e para as etapas de lavagem entre as injecções de amostra. Traça-se a dispersão para a frente / lateral de células alvo infectadas, antes da injecção de amostras-alvo da infecção das células. </li><li> Colete 20.000 eventos totais para cada condição utilizando 488 nm do laser de excitação e o canal FL1. </li><li> Portão populações de células pós-captura para excluir as células não infectadas e uma intensidade de fluorescência na trama de um histograma (FlowJo) (Figura 1E). </li></ol> 5,3 placas CFU <ol><li> Examinar a eficiência of infecção por CFU plaqueamento das células recolhidas por citometria de fluxo. Preparar diluições em série das amostras de ultra-filtrada H 2 O, 10 1, 10 -2, 10 -3 e. </li><li> Placa de 20 ul de cada diluição para 1/3 de uma placa CYEA com 6,25 ug / ml de CM. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C durante 72 h. </li><li> Contar as colónias, usando um palito e contador de células. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

A expressão do gene bacteriano é rigorosamente controlado por meio de uma combinação de progressão do ciclo de vida e resposta a sinais do micro-ambiente circundante. Patógenos vacuolares, tais como L. pneumophila responder a uma grande variedade de hospedeiros de células derivadas de pistas quando compartimentado em um fagossoma. Como resultado colectivo de exaustão de nutrientes na célula hospedeira, a bactéria compensa por expressar factores necessários para a difusão bem sucedida para uma célul...

Numerosos agentes patogénicos bacterianos adaptaram estratégias generalizadas de explorar as células hospedeiras para a sua sobrevivência e replicação num compartimento intracelular. Em muitos casos, os mecanismos patogénicos são semelhantes entre protozoários e metazoários células. No entanto, estes dois microambientes são muito diferentes e podem resultar em expressão diferencial de factores de virulência 1-4. A doença dos legionários bactéria Legionella pneumophila é onipresente associada com ambientes de água doce em todo o mundo 5. Importante, L. pneumophila cultivado em células de protozoários antes da infecção dos monócitos humanos ganhar uma vantagem patogénicas, o que sugere que os perfis de expressão gênica global da bactéria que sai de uma célula de protozoários são diferentes do que a do organismo cultivado in vitro em 6-8. Na natureza, a água doce amebas fornecer nutrientes limita ricos para amplificação rápida de uma bactéria invasora. Aquisição humana de L. pneumophila é o mais frequentemente atribuída a inalação de gotículas de água contaminada que contém a bactéria. É provável que essas gotículas porto protozoários associados a células de bactérias, células de protozoários, onde são mais resistentes a práticas convencionais de tratamento de água 9,10. Infecção de macrófagos alveolares do pulmão procede de uma maneira praticamente idêntica à do ciclo de vida da bactéria intracelular em células hospedeiras de protozoários 11-13. A fim de sobreviver e de se replicar em células eucariotas, L. pneumophila utiliza um tipo especializado sistema de secreção IVb denominado Dot / Icm para entregar cerca de 300 &#39;&quot;proteínas efectoras para o citosol da célula hospedeira 14-16. Estas proteínas efectoras funcionar colectivamente subverter processos celulares, a fim de gerar um compartimento de replicação para a bactéria permissiva 17,18. Deleções em qualquer um dos 26 genes que compreendem o resultado transportador Dot / Icm de estirpes defeituosas de mult intracelulariplication 19-23. Historicamente, a deleção de genes individuais que codificam efetores raramente resultou em estirpes atenuadas para o crescimento intracelular. Esse fenômeno tem sido atribuída a várias hipóteses, incluindo função redundante e cópias parálogas de efetores. Alguns factores de virulência são apenas expressas no contexto do hospedeiro associada a células de crescimento intracelular 24. Nós racionalizado que se um efector específico foi expresso apenas no contexto da infecção por protozoários, em seguida, a contribuição do efector não pode ser comparada com uma estirpe de tipo selvagem, quando ambos foram cultivadas in vitro. L. pneumophila transições de um replicativa a uma fase transmissivo enquanto entra na fase estacionária da cultura 25. O fenótipo de comutação fase representa o esgotamento de nutrientes encontrados durante crescimento intracelular e é exemplificada através de montagem de flagelos para a motilidade 26. Porque L. pneumophila é mais invasive e virulenta quando colhido a partir de células de protozoários, buscou-se desenvolver um ensaio que mais fielmente representado o estado patogênico da bactéria quando encontrou macrófagos de acolhimento. Para este fim, foi desenvolvido um ensaio de escorvamento versátil protozoário que pode acomodar qualquer hospedeiro adequado para ambos os primeiros (cell priming) e segunda (infecções de células alvo) de palco. O processo de infecção é tratável através da utilização de bactérias que expressam de forma estável a proteína fluorescente verde (GFP). O modelo de infecção pelo protozoário Acanthamoeba castellanii segue uma metodologia amplamente utilizado no campo 27. Para o passo de activação, L. estirpes pneumophila são cultivados in vitro até à fase estacionária em meios líquidos para produzir rotulados &#39;transmissivos &quot;bactérias (Figura 1A). As bactérias são depois utilizadas para infectar monocamadas de A. castellanii durante 18 horas para atingir uma fase tardia do ciclo de vida intracelular. Grandes vacúolos contêmbactérias ção pode ser visualizada nesta altura utilizando a microscopia de fluorescência (Figura 1A). As células são então lisadas por protozoários e bactérias recuperadas a partir do lisado são medidos para a emissão a 512 nm utilizando um leitor de placas de fluorescência. A fluorescência é proporcional à densidade óptica para calcular multiplicidade de infecção (MOI) durante a infecção das células alvo (figura 1, * Curva de correlação). Após invasão (T 0) e 18 horas pós-invasão (T 18), as células alvo são quantificadas por fluorescência, que representa as bactérias intracelulares. A fluorescência pode ser monitorizada por microscopia e citometria de fluxo, e a contagem de viáveis ​​pode ser medido através de plaqueamento de colónias. O ensaio de priming é sempre acompanhada por infecções de tipo selvagem L. pneumophila e de uma estirpe deficiente em Dot / Icm sistema de secreção de tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Este importante fornece controles internos para comparações diretas entre um tipo selvagemnd quaisquer estirpes isogénicas mutantes utilizados no processo de infecção. A inclusão da estirpe avirulenta DOTA Δ durante a fase de escorvamento estabelece um limiar para a observação de fenótipos de crescimento atenuado associados isogénicas estirpes mutantes que são cultivadas in vitro.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>chloramphenicol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP904-100</td>
 <td>antibiotic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1755-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ACES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9758-1KG</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATCC medium: 712 PYG</td>
 <td>ATCC</td>
 <td></td>
 <td>growth media for protozoans</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X PBS</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>SH30256FS</td>
 <td>phosphate buffered saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>activated charcoal</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>C272-212</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>yeast extract</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1422-500</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>peptone</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>211677</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1423-2</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-cysteine, 99%+</td>
 <td>Acros organics</td>
 <td>173601000</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferric nitrate nonahydrate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>I110-100</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>AMG</td>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>fluorescence microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Smart Spec Plus</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-2525</td>
 <td>spectrophotometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5810 R centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22627023</td>
 <td>bench top centrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repeater plus</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22230201</td>
 <td>repeating pipette</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SpectraMax Gemini EM</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td></td>
 <td>microplate reader</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Softmax Pro 5.3</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>0200-310</td>
 <td>microplate reader software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5424 microfuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22620401</td>
 <td>table top microcentrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast-release pipette pump II</td>
 <td>Scienceware</td>
 <td>379111010</td>
 <td>pipette aid</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FACS Calibur</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td></td>
 <td>flow cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FlowJo 7.6.1</td>
 <td>FlowJo</td>
 <td>license</td>
 <td>flow cytometery software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>polypropylene conical tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.6 ml microfuge tube</td>
 <td>Neptune</td>
 <td>3745.X</td>
 <td>microcentrifuge tubes</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

tractable mammalian cell infections with protozoan-primed bacteria

Muitos agentes patogénicos bacterianos intracelulares, protozoários usar água doce como um reservatório natural para a proliferação no ambiente. Legionella pneumophila, o agente causador do legionário pneumonia, ganha uma vantagem sobre patogénico em bactérias cultivadas in vitro quando a primeira colheita a partir de células de protozoários antes da infecção de macrófagos de mamíferos. Isto sugere que os factores de virulência importantes não podem ser adequadamente expressas in vitro. Nós desenvolvemos um sistema tratável para o priming L. pneumophila através do seu hospedeiro natural protozoário Acanthamoeba castellanii antes da infecção de células de mamíferos. A contribuição de qualquer factor de virulência podem ser examinados, comparando o crescimento intracelular de uma estirpe mutante de tipo selvagem de bactérias depois de priming protozoário. Expressando GFP-L. de tipo selvagem e mutante estirpes pneumophila são utilizadas para infectar monocamadas de protozoários num passo de escorvamento e deixada atingir a fase tardia de crescimento intracelular. Bactérias fluorescentes são então colhidas a partir destas células infectadas e normalizados por espectrofotometria para gerar números comparáveis ​​de bactérias para uma subsequente infecção em macrófagos de mamíferos. Para quantificação, as bactérias vivas são monitorizados após a infecção através de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, e por plaqueamento de colónias. Esta técnica destaca e conta com a contribuição de anfitrião a expressão do gene de células-dependente, imitando o ambiente que seria encontrado em uma rota de aquisição natural. Esta abordagem pode ser modificado para acomodar qualquer bactéria que utiliza um hospedeiro intermediário como um meio para a obtenção de uma vantagem patogénico.

Um resultado típico para o processo de infecção toda está delineado na Figura 1. Viver micrografias de células de fluorescência mostrando monocamadas de A.castellanii infectadas com o tipo selvagem L. pneumophila durante a fase de escorvamento é mostrado na Figura 1A. Uma medida de sucesso da etapa de iniciação levaria a uma população de cerca de 90% das células hospedeiras que contêm grandes vacúolos preenchidos com bactérias marcadas com GFP neste MOI....

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Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Esta técnica proporciona um método para colher, normalizar e quantificar o crescimento intracelular das bactérias, que são pré-cultivadas em células hospedeiras naturais protozoários antes da infecção de células de mamíferos. Este método pode ser modificado para acomodar uma grande variedade de células hospedeiras para a fase de escorvamento, bem como tipos de células-alvo.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

tractable-mammalian-cell-infections-with-protozoan-primed-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K visualizações.  Oregon Health & Science University. Esta técnica proporciona um método para colher, normalizar e quantificar o crescimento intracelular das bactérias, que são pré-cultivadas em células hospedeiras naturais protozoários antes da infecção de células de mamíferos. Este método pode ser modificado para acomodar uma grande variedade de células hospedeiras para a fase de escorvamento, bem como tipos de células-alvo.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Tratáveis mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias