Este trabalho foi possível graças ao financiamento do Wellcome Trust. JM (080.964) e ACS (080.948) foram apoiados pelo Wellcome Trust bolsas e DT por uma relação de confiança studentship Malawi-Liverpool-Wellcome.

1. Coleta de Amostras As plaquetas podem ser facilmente ativado através de temperatura, agitação ou armazenamento e, portanto, eles devem ser manuseados com cuidado. O uso de tubos sob vácuo para coleta de sangue para a preparação de plaquetas é inevitável na maioria das situações clínicas, mas deve ser cuidadosamente considerada como sucção pode causar a ativação plaquetária. Devido ao protocolo clínico utilizado em nosso hospital de pesquisa, nossas amostras são cuidadosamente recolhidos em vacutainers citrato de sódio. Nós não tiveram quaisquer problemas com a ativação plaquetária prematuro neste ou em nosso estudo anterior 12. Nós coletamos sangue para a preparação de plaquetas do grupo sanguíneo O + indivíduos para minimizar inespecífica grupo de agregação antígeno no sangue. Os doadores também não tenham tomado medicamentos nos dias 7-10 anteriores, como alguns fármacos são conhecidos por influenciar a função das plaquetas. 1.1 Preparação de plasma rico em plaquetas (PRP) <ol><li> Recolha cerca de 5 mlde sangue total a partir de uma série ingênua malária ou 2,5 ml de sangue do CM ou a malária grave (SM) pacientes em um vacutainer citrato de sódio (número do produto BD 36.276). </li><li> Centrifugar o sangue completo a 250 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Não centrifugar a 4 ° C como a baixas temperaturas pode causar a agregação das plaquetas. </li><li> Transferir cuidadosamente o sobrenadante nublado em um tubo limpo 15 ml. Plaquetas são facilmente ativado por variações de temperatura e choques físicos e deve ser manuseado com cuidado. Evite agitação ou quaisquer movimentos bruscos do tubo. </li><li> Use haematocytometer um Neubauer para contar e ajustar a suspensão de plaquetas para&gt; 300 x 10 3 plaquetas / l para os doadores saudáveis ​​e &lt;150 x 10 3 plaquetas / l de CM e os pacientes SM utilizando tampão fosfato 1X (pH 7,2-7,4; PBS). Certifique-se de escolher um alto fator de diluição para facilitar a contagem de plaquetas e assegurar sua exatidão. </li></ol> Nota: Malária patients ter uma contagem de plaquetas reduzida em comparação com os indivíduos saudáveis ​​16,17,18. Concentrações de plaquetas, portanto, para a CM e UM são ajustados de acordo com a contagem média de plaquetas para pacientes dentro de cada grupo de diagnóstico da malária. O P. falciparum fenótipo aglutinação é comum em isolados cm e apresenta uma forte afinidade de ligação, portanto, as concentrações reduzidas de plaquetas não afeta o tamanho moita ou a freqüência em que a concentração de plaquetas é padronizado para todos os casos CM. 1.2 Preparação de plasma pobre em plaquetas (PPP) <ol><li> Para obter o PPP, centrifugar uma porção do PRP obtido acima a 1,500 xg durante 10 min. A maioria das plaquetas são sedimentadas no fundo do tubo. </li><li> Ambos PRP e PPP pode ser armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Idealmente, a utilização de plaquetas frescas para o ensaio de aglutinação. Depois de 8-10 dias a maioria das plaquetas são susceptíveis de ser inactiva e, provavelmente, agregada. </li></ol> 2. Parasite Cultura <ol><li> Lavar as peletizadas CH três vezes com 5-10 ml de RPMI 1640 por centrifugação a 370 xg durante 5 min. Nota: neste protocolo todas as culturas começou a partir de cerca de 1 ml de volume globular (VG) e mantida em 5% do hematócrito. Culturas pode ser iniciado com qualquer PCV de concentrado de hemácias e ajustado em conformidade com infectada RBC e mídia para atingir hematócrito desejado. </li><li> Coloque a CH num frasco de cultura e com meio de cultura de suplemento malária padrão de RPMI 1640 suplementado com HEPES 25 mM, 5% Albumax II ou soro a 10% e 40 ug / ml de gentamicina para atingir um hematócrito de 5%. </li><li> Permeado frascos de cultura, com uma mistura de 92,5% de azoto, 2,5% de oxigénio e 5% de dióxido de carbono antes de selar e incubar. Alternativamente, o método de jarras estanque de Trager-Jensen, pode ser utilizado. </li><li> Para CH obtida directamente a partir de pacientes, incubar seu frasco de cultura de 24-36 horas em 37 ° C na incubadora de CO2 a 5% para obter parasitas maduros. NOTA: Most laboratório e as linhas de cultura adaptados são muito fácil de manter em cultura, sob condições normalizadas. Existem técnicas simples descritos abaixo, que podem ser usados ​​para sincronizar diferentes fases do parasita para manter a taxa de crescimento. </li><li> Preparar um esfregaço de sangue fina, conforme descrito abaixo e examinar maturação parasita sob um microscópio de luz. </li></ol> 3. Fina Sangue Film Deslize Preparação <ol><li> Colocar aproximadamente 10-15 mL de sangue em uma extremidade de uma lâmina de vidro fosco em repouso numa superfície plana. </li><li> Toque a gota de sangue com a extremidade de uma segunda corrediça até que o sangue se espalhe uniformemente através da borda da segunda pe. </li><li> Enquanto mantém o segundo slide em um ângulo de 45 °, de forma rápida, mas com cuidado, sem exercer demasiada pressão sobre o primeiro slide, deslizar o sangue em todo o primeiro slide para fazer um filme fino de sangue que é uniformemente distribuído. Ar seco. </li><li> Mergulhe a lâmina em metanol por 10 seg. Ar seco. </li><li> Mergulhe a lâmina em 2% Giemsa ruaain durante pelo menos 10 min. Lavar exaustivamente até que a água corre claro. Ar seco. </li><li> Examinar lâmina utilizando uma lente de emulsão de óleo de 90-100x num microscópio de luz </li></ol> 4. Purificação e sincronização de fases assexuadas A purificação da p maduro falciparum concentrado de hemácias é uma etapa necessária para o ensaio de aglutinação. Com efeito, só os parasitas maduros são capazes de se ligarem aos receptores de plaquetas, pois é nesta fase do ciclo de vida que os ligandos relevantes são expressos e sobressair a partir da superfície de eritrócitos infectados. Existem vários métodos para purificar e sincronizar as fases assexuadas de P. falciparum: estágios assexuados tardias podem ser enriquecidos por gradiente de Percoll 19; célula magnética classificação 20 ou usando a sedimentação gelatina protocolo 21 descritas aqui.. Sorbitol sincronização seleciona para estágios anelares 22, após o que os anéis são cultivadas por 24-26 horas para obter estágios maduros (sem need para executar flotação gelatina). 4.1 Plasmagel Flotação Plasmagel flotação utiliza solução de gelatina, como a escolha de menor peso nodoso eritrócitos permanecer em solução, enquanto as formas de toque e rosetas densas vão para o fundo. Esta técnica dá-se a 90% de pureza dos eritrócitos maduros fase infectadas e pode ser utilizado tanto para isolados de laboratório e de campo. No entanto, como mencionado anteriormente, Plasmagel flotação remove rosetas CH, bem como os estágios imaturos que poderia resultar em uma frequência aglutinação reduzida nas amostras com uma frequência elevada rosetas. No entanto, a ausência do concentrado de hemácias rosetting após Plasmagel flotação não afetaria o ensaio de aglutinação porque rosetting é uma interação de eritrócitos concentrado de hemácias e não infectados, enquanto aglomeração é concentrado de hemácias mediada por ligação por plaquetas. O ligando envolvidos nestes dois traços é diferente, com o receptor do complemento principalmente CR-1 na mediação de rosetas de eritrócitos infectados.<ol><li> Solução Gelofusine Pré-aquecer e soro / Albumax meio II livre de até 37 ° C num banho de água. </li><li> Transferir a cultura para um tubo estéril de 15 ml limpos e as células por centrifugação à temperatura ambiente a 370 xg durante 5 min. </li><li> Sobrenadante aspirado cuidadosamente de modo a não perturbar o sedimento e ressuspender as células num volume igual de meio Gelofusine e sem proteína. </li><li> Transfira a mistura para um tubo estéril de 15 ml e deixa-se repousar durante 15-20 minutos em uma incubadora de 37 ° C ou até que uma demarcação clara pode ser observada entre um nível superior e inferior. </li><li> Transferir cuidadosamente a camada superior a um ml novo tubo estéril 15 e adicione 10 ml de RPMI fresco. </li><li> Centrifugar a 370 g durante 5 minutos e descartar o sobrenadante cuidadosamente. </li><li> Avaliar o estágio de parasitemia e de desenvolvimento por esfregaço de sangue fino e examinar sob um microscópio de luz, conforme descrito na seção 4. </li></ol> NOTA: concentrado de hemácias Mature gama entre 60-90% dos eritrócitos infectados depending a parasitemia inicial da cultura. Para a alta porcentagem de parasitas maduros, utilizar culturas com uma parasitemia inicial de ≥ 10%. 5. Aglomeração Assay <ol><li> Use haematocytometer de Neubauer para contar e ajustar a suspensão obtida após a flotação CH Plasmagel a 1 x 10 8 CH / ul. </li><li> Em um tubo de 1,5 ml fresco, ressuspender em CH 5% de hematócrito, laranja de acridina a 20 ug / ml de concentração final e PRP em 10% do volume total. Em vez de laranja de acridina, cultura dos parasitas pode ser corado com 25 ug / ml de brometo de etídio durante 5 min antes da utilização. Por exemplo, para uma mistura de reação de 200 mL, adicione 10 ml concentrado de hemácias maduras, 20 l de 300 x 10 3 plaquetas / mL para PRP de doadores saudáveis ​​ou 150 x 10 3 plaquetas / l de pacientes SM e 170 mL de meio livre de proteínas. NOTA: A taxa de plaquetas: concentrado de hemácias nas reações finais é de 20:1. Isto é importante porque permite a máxima estáhum frequência de aglutinação de uma amostra a ser determinada. Se menos plaquetas são adicionados nos controles, então nem todos os aglomeração concentrado de hemácias pode ter a chance de moita. </li><li> Da mesma forma, preparar os seguintes controlos, células vermelhas do sangue não infectados e PRP, e CH com PPP para determinar o papel das plaquetas no concentrado de hemácias aglutinação. </li><li> Transferir a suspensão para um frasco ml com tampa de rosca cónica de 1,5-2,0. </li><li> Coloque o frasco sob agitação suave rolando em 10-12 rpm à temperatura ambiente. </li><li> Verifique se há formação de moita por um wet-slides preparados pipetando 10 ml de concentrado de hemácias ± mix de plaquetas sobre uma lâmina de vidro, cubra com um copo escorregar e examinar sob fluorescência. </li><li> A amostragem pode ser feita em intervalos de 15-20 min para um total de 120 min. Um grupo é considerado como um agregado de três ou mais eritrócitos infectados. </li></ol>

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos um ensaio de aglutinação das plaquetas mediada usada para estudar CH em isolados clínicos directamente no campo. Agregação de plaquetas mediada por um comportamento característico em P. isolados clínicos falciparum, foi identificado como um fenótipo adesivo distintos, frequente em isolados CD36 vinculativas 12,23-24. Temos utilizado este ensaio para identificar três pontos principais: 1) uma forte aglomeração em fenótipo vitro de P. falciparum isolado de crianças malauianas que está associada com a gravidade da doença eo diagnóstico 2) novos receptores mediaties P-selectina de aglutinação das plaquetas com CD36, 3) o grau de trombocitopenia presente em pacientes com CM é suficiente para limitar a formação de aglomerados em CH 12 in vitro. O envolvimento das plaquetas na formação moita é demonstrado através da análise de uma preparação wet-slide como descrito na seção 6. As plaquetas podem ser isolados a partir de PRP por centrifugação a altas velocidadesa fim de minimizar as reacções antigénicas do grupo sanguíneo, no entanto, foi utilizado PRP todo, a fim de minimizar a activação de plaquetas de um manuseamento excessivo prematuro e da centrifugação a alta velocidade. Actividade de plaquetas pode ser medida pelo teste de agregação de plaquetas utilizando agonistas de plaquetas ou epinefrina fracos, difosfato de adenosina (ADP), 25 como descrito em 26. Existem vários aspectos do ensaio que tenham anteriormente sido mal caracterizadas, sendo um deles a importância da selecção de fontes de PRP e o efeito de antigénios de grupos sanguíneos sobre o resultado do ensaio. Preparamos PRP de indivíduos que eram do grupo sanguíneo O + e não tinha tomado qualquer medicação nos últimos 7-10 dias antes de o sangue é extraído, como alguns fármacos podem afetar o comportamento das plaquetas. Outros fatores que podem afetar o sucesso incluem aglomeração concentrado de hemácias hematócrito, níveis de parasitemia e duração do ensaio de aglutinação. Usando o hematócrito elevado e co plaquetasUNT seria difícil dizer se o cluster é verdadeiramente uma moita ou se muitas células estão apenas sentados juntos, porque eles estão densamente 15. A aglomeração também geralmente aumenta com o tempo de incubação mais longos. Estas são todas as orientações úteis que devem ser considerados ao projetar estudos de aglutinação. Descobrimos que as amostras a partir de diferentes grupos clínicos podem ser analisados ​​em paralelo com o PRP a partir do mesmo doador, se é possível fazê-lo, mas em configurações de recursos limitados, tais como locais de campo da piscina transfusão é normalmente limitada. Por conseguinte, é difícil ter um único dador + O para padronizar os ensaios. Nós, portanto, identificou vários doadores + S para garantir a compatibilidade do grupo sanguíneo sempre que possível. Usando vários doadores também é útil em casos de grandes tamanhos de amostras de modo que ônus da doação de sangue não cair em apenas um indivíduo. Os pontos de amostragem em 15-20 min são muito mais viável se um único person está realizando os ensaios, permitindo a preparação wet-slides e realizando cinética de ensaio, sem tempos de amostragem que se sobrepõem. A maioria dos dados está microscópico visual e pouco objectivo, por isso, é importante que a contagem de células é verificada por meio de mais de uma pessoa. Nesse caso, a manipulação uma amostra de cada vez pode permitir uma análise completa de 3-4 amostras por dia, dependendo da eficiência de pessoal. Agregação de plaquetas mediada pode ser realizada utilizando tanto isolados clínicos e laboratoriais. Para as linhas de laboratório, recomenda-se que CD36 parasitas de ligação são utilizadas para maximizar frequências aglutinação. O ensaio pode ser acoplado com outros testes de aglutinação tais como a formação de rosetas, ou utilizados em ensaios de inibição de aglomeração que permitam o estudo de receptores nas plaquetas que pode mediar ligação CH, um aspecto pouco compreendido e examinadas deste fenótipo.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum provoca a maioria das infecções graves de malária. Os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à malária cerebral (MC) não são totalmente compreendidos e várias hipóteses têm sido propostas, incluindo a obstrução mecânica de microvasos por P. glóbulos vermelhos falciparum-parasitados (CHA). Com efeito, durante a fase intra-eritrocítico do seu ciclo de vida, P. falciparum tem a capacidade única de modificar a superfície do eritrócito infectado por exportar antigénios de superfície com diferentes propriedades adesivas sobre a membrana de RBC. Isto permite que o sequestro de CH em múltiplos tecidos e órgãos, por adesão às células endoteliais que revestem a microvasculatura de vénulas pós-capilares 1. Ao fazer isso, as formas maduras do parasita evitar a recarga do baço dos eritrócitos infectados deformado 2 e restringir o seu ambiente mais favorável a uma pressão de oxigénio de baixo 3. Como conseqüência deste Sequestração, é apenas parasitas assexuadas e gametócitos imaturas que podem ser detectados no sangue periférico. Citoaderência e seqüestro de concentrado de hemácias maduro para os inúmeros receptores do hospedeiro expressas em leitos microvasculares ocorre na doença grave e sem complicações. No entanto, diversas linhas de evidência sugerem que apenas os fenótipos adesivos específicos são susceptíveis de ser associados com os resultados patológicos graves de malária. Um exemplo de tais interacções hospedeiro-parasita específicos tem sido demonstrada in vitro, em que a capacidade da molécula de adesão intercelular-1 para suportar a ligação de CH com propriedades adesivas tem sido associada ao desenvolvimento de malária cerebral 4,5. A placenta também tem sido reconhecido como um local de acumulação de CHA preferencial em mulheres grávidas infectadas com malária, com sulfato de Condroitina A, expressos na linha sinciciotrofoblastos que o espaço intervilositário placenta como o receptor principal 6. Rosetting t de concentrado de hemáciasÕ eritrócitos infectados através do receptor de complemento 1 (CD35) 7,8 também tem sido associada com a doença grave 9. Um dos p mais recentemente descrito falciparum fenótipos citoaderência é a capacidade do CH para formar aglomerados de plaquetas mediadas in vitro. A formação de tais aglomerados CH requer CD36, uma glicoproteína expressa na superfície das plaquetas. Outro receptor humano, gC1qR/HABP1/p32, expressa em diversos tipos de células, incluindo células endoteliais e plaquetas, também tem sido demonstrado para facilitar a adesão das plaquetas CH para formar aglomerados 10. Se a aglutinação ocorre in vivo ainda não está claro, mas pode contribuir para o acúmulo significativo de plaquetas descritos na microvasculatura do cérebro das crianças do Malauí que morreram de CM 11. Além disso, a capacidade de isolamento clínico a aglutinar-se em culturas in vitro foi directamente relacionada com a gravidade da doença em 12 malaviano </sup&gt; Pacientes e Moçambique 13, (embora não em Mali 14). Com vários aspectos do fenótipo aglutinação CHA mal caracterizado, estudos atuais sobre o assunto não ter seguido um procedimento padronizado. Este é um problema importante, devido à alta variabilidade inerente conhecido no ensaio de 15. Aqui, apresentamos um método in vitro para agregação plaquetária mediada por P. falciparum com a esperança de que ele irá fornecer uma plataforma para um método consistente para outros grupos e aumentar a conscientização sobre as limitações na investigação deste fenótipo em estudos futuros. Sendo baseado no Malawi, nós fornecemos um protocolo projetado especificamente para um ambiente com recursos limitados, com a vantagem de que isolados clínicos recém-coletados podem ser examinados para fenótipo, sem necessidade de criopreservação.

Um exemplo de um ensaio de aglomeração de plaquetas mediada utilizando cerca de 70% de P. estádios maturos falciparum após o enriquecimento por Plasmagel flotação é mostrado na Figura 2. Um grupo é um conjunto de três ou mais eritrócitos infectados. A coloração com alaranjado de acridina ou brometo de etídio podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência. Laranja de acridina e espectralmente semelhante à fluoresceína, com um máximo de excitação a 502 nm e um máximo de emissão a 525 nm (verde), enquanto que o brometo de etídio tem um máximo de excitação a 493 nm e um máximo de emissão a 620 nm (semelhante aos corantes de rodamina, vermelho ). Tufos são facilmente visualizados ao microscópio sob luz normal como eles aparecem na forma de agregados celulares e sob a forma de pontos de fluorescência de verde ou vermelho, quando coradas com laranja de acridina ou brometo de etídio, corantes, respectivamente, como mostrado na figura 2 (ponto de tempo de 30 min, utilizando acridina laranja ). Quanto maiores as aglomerações, quanto maior for o agregado celular apresenta under luz normal e o maior dos pontos de verde ou vermelho em fluorescência para os respectivos corantes. Uma vez que os corantes de ADN alvo e, por conseguinte, os núcleos da mancha, plaquetas e RBC não infectadas não são detectados sob microscopia de fluorescência devido a sua falta de núcleos. Formação aleatória de pequenos aglomerados concentrado de hemácias de 4,7 ± 1,6 concentrado de hemácias / moita ocorrer após 30 min. O tamanho de aglomerado aumenta significativamente a uma média de&gt; 15 CH / aglomerados após incubação durante 120 min, com alguns aglomerados contendo numerosos CH / aglomeração que não puderam ser contadas visualmente. A frequência do fenótipo agregação é calculada como o número de células infectadas presentes nos aglomerados / 1000 células infectadas, contado em ensaios em duplicado. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Figura 1. O fluxo de trabalho aglomeração experimento. Platelet rich e plasma pobre em (A) e um p cultura de eritrócitos infectados com P. falciparum (B) são preparados em seguida combinados para o ensaio de aglutinação (C). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Figura 2. Aglutinação de eritrócitos infectados por P. falciparum laboratório isolar. Tufos formadas por HB3 no tempo 0, 30 e 120 minutos em plasma rico em plaquetas (A) e a formação de aglomerado pobre em plasma pobre em plaquetas (B). Limitações do ensaio Há limitações que afetam especificamente a função plaquetária ou resultado influência ea maioria deles já foi destacado por Arman e Rowe 15. Aqui podemos citar alguns dos problemas potenciais que podem ser encontradas em diferent etapas do ensaio: <ol><li> Adaptando isolados clínicos de cultura in vitro pode ser um desafio, como por vezes períodos de cultura mais longos são necessários a fim de conseguir a alta parasitemia suficiente para permitir a formação de aglomerados. Com altas taxas de variação antigênica em P. falciparum, o fenótipo adesiva da cultura adaptada parasita pode não reflectir a população de parasitas infectando original depois de tempos prolongados em cultura. </li><li> A fim de evitar a aglutinação não específica devido a antigénios de grupos sanguíneos, os doadores de plaquetas deve ser combinado para o antigénio de grupo sanguíneo com isolados clínicos utilizados no mesmo ensaio, ou o grupo dador de sangue universal O antigénio utilizado. No entanto, os indivíduos com o grupo sanguíneo O-são raros em sítios africanos, como Malawi e, portanto, as plaquetas comumente usados ​​são obtidos a partir de sangue do grupo O + e os doadores têm de ser adaptadas para o grupo sanguíneo. </li><li> Contando aglomerados em uma preparação da lâmina molhado é complicado e desafiador para captura de imagem como o cvaras estão em constante movimento. Normalmente, concentrado de hemácias acumular nas bordas da lamínula ou eles tendem a ficar juntos formando aglomerados &quot;falsas&quot; que podem ser facilmente confundidos com pedaços reais. A fim de reduzir o movimento de células, para permitir que as células sedimentar durante 15 minutos à temperatura ambiente antes da análise. </li><li> O teste de aglutinação é sensível ao tempo e, portanto, só permite uma amostra a ser analisada por pessoa em um momento de precisão ideal. Os pontos de amostragem de tempo para duas amostras diferentes podem sobrepor-se facilmente, o que resulta não correspondentes pontos de tempo de amostragem entre as amostras se manipulam mais do que uma amostra ao mesmo tempo. Em tais circunstâncias, o software quantitativas sofisticadas poderia calcular tamanhos moita ou, em alternativa, anticorpos específicos de células podem ser usadas para analisar a composição dos aglomerados. Embora estas técnicas podem melhorar significativamente a importância dos dados, em ambientes de recursos limitados sempre que tal ensaio susceptível de ser utilizado, tais técnicas e equipamentos não estão prontamente disponíveis. </li></ol>

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A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Este método investiga o fenótipo de aglutinação das plaquetas mediada<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Infectados hemácias (CHA) em isolados clínicos. Isto é realizado através do isolamento e da co-incubação do plasma rico em plaquetas e uma suspensão de CH.

Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrócitos&gt; infectados em uma configuração com poucos recursos

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K visualizações.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. Este método investiga o fenótipo de aglutinação das plaquetas mediada Plasmodium falciparum Infectados hemácias (CHA) em isolados clínicos. Isto é realizado através do isolamento e da co-incubação do plasma rico em plaquetas e uma suspensão de CH.

Vídeo: A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Imunologia e Infecção

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Separação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fase Tardia eritrócitos infectados por meio magnético

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.