Name: high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays
Uploaded: 2014-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
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Os autores gostariam de reconhecer as crianças e os dadores de plasma de adultos, e os funcionários da Papua Nova Guiné Instituto de Pesquisa Médica. Os autores gostariam de agradecer a Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller e Diana S Hansen por sua contribuição para o desenvolvimento desta técnica, e agradecer o australiano da cruz vermelha por pacotes de sangue e soro. Este trabalho foi possível graças vitoriana Governo do Estado Operacional de Apoio Infra-estrutura e Australian Government NHMRC IRIISS. Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council concede # 1031212 e # 637406, e os Institutos Nacionais de Saúde concessão # AI089686.

Nota: Todos os passos de, para além da centrifugação e a citometria de fluxo, deve ser realizada dentro de uma câmara de fluxo laminar, para manter a esterilidade. Assegurar as devidas precauções sejam tomadas em relação a manipulação de amostras humanas. O ensaio é muito sensível para pequenas quantidades de plasma. As diluições fornecidas são ideais para a resolução de respostas que vão 5-78% com plasma de crianças semi-imunes de Papua Nova Guiné (PNG). A diluição ideal pode variar com aparelhos de plasma a ser testado e, portanto, recomenda-se que o plasma ser titulada para determinar as condições experimentais para cada aplicação. Garantir a inclusão de dois controles negativos células THP-1 com merozoites na ausência de plasma; e células THP-1 com merozoites opsonizadas com um pool de plasma de malária indivíduos ingênuos. Isto irá permitir um controlo para a adesão dos merozoítos para células THP-1 e para permitir rigorosa gating citometria de fluxo de eventos de fagocitose. O uso de amostras de plasma foi PNGaprovado pelo Comitê Consultivo de Pesquisa Médica, Papua Nova Guiné Ministério da Saúde, o Walter e Eliza Hall Institute Comitê de Ética em Pesquisa Humana (número do projeto 04/04). Foi obtido consentimento escrito dos pais / encarregados de educação de todos os participantes. 1. THP-1 Cultura <ol><li> Manter a linha celular monocitica humana THP-1 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 55 uM de 2-mercapthoethanol (THP-1 médio) e a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 umidificada. </li><li> Manter as células a uma densidade inferior a 5 x 10 5 células / ml. NOTA: Supercrescimento irá resultar em diferenciação em células aderentes e infra-regulação de receptores Fc. Uma vez que as células foram passadas a aproximadamente 10 vezes, descongelar um frasco novo para manter o fenótipo da célula. </li></ol> 2. Preparação de Amostras de anticorpos e de diluição <ol><li> Calor plasma inativar a ser testado e plasma controle da malária ingênuo por incubação a 56 °; C durante 30 min </li><li> Diluir em série de amostras de plasma a 1/2, 000, em células THP-1 de gama média. </li><li> Plasma loja diluída a -20 ° C. </li></ol> 3. Cultura de Altamente Sincronizado P. falciparum NOTA: A linha parasita expressando GFP-D10-PfPHG 27 foi utilizado devido ao seu ciclo de vida de 48 horas, que auxilia a sincronização de parasitas eo momento controlada de E64 disso. Além disso, porque esta linha expressa GFP no citosol, esta linha permite a detecção de parasitemia e merozoitos livres por citometria de fluxo, detecção de GFP. No entanto, a intensidade de fluorescência da GFP não é suficiente para proporcionar a visualização no interior de células THP-1, e, portanto, os merozoítos são contrastadas com brometo de etídio (EtBr). Outras estirpes do parasita podem ser utilizados, desde que a sincronia apertado é realizável. Sincronizar parasitas utilizando uma combinação de tratamento de sorbitol para lisar as formas maduras de 28 e heparina para inibir a invasão 15 </sup&gt;. <ol><li> Manter P. falciparum parasitas em O + eritrócitos humanos (RBC) em 3% de hematócrito em meio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado com 25 mg / ml de HEPES, 50 ng / ml de hipoxantina, 10% de soro humano, 2 mg / bicarbonato de sódio ml, e 20 ug / ml de gentamicina (meio parasita). Adicionam-se 5 mg / ml de blasticidina S-hidrocloreto ao meio de cultura para seleccionar para GFP + parasitas. </li><li> Incubar as culturas em caixas estanques ou frascos de cultura, alternativamente dupla selados a 37 ° C numa atmosfera de 1% de O2, 4% de CO2 e 95% de N2. </li><li> Prepare esfregaço finas, fixar em 100% de metanol durante 10 segundos, e a mancha com uma solução de 10% de Giemsa em 6,7 mM (pH 7,1), tampão fosfato (solução de Giemsa) durante 10 minutos para monitorar a parasitemia. Após a coloração, lavar com água e ar seco. Avaliar a parasitemia usando uma lente de imersão em óleo de 100X. </li><li> Manter culturas de parasitas em uma parasitemia abaixo de 5% RBC infectado dividindo culturas e adicionando não infectadoRBC, conforme necessário. </li><li> Para sincronizar com heparina, adicionar 20 UI / ml de heparina de grau médico para tocar em estágio culturas. </li><li> Quando a maioria dos parasitas estão na fase de esquizonte, células de pelotas a 300 xg durante 5 min, remove-contendo heparina de médio e ressuspender em meio de parasita para permitir a ruptura esquizonte e merozóito invasão. </li><li> Depois de 4 horas, adicionar 20 UI / ml de heparina de volta para as culturas, bloqueando qualquer outra invasão merozoite. NOTA: Vários ciclos de sorbitol e de tratamento de heparina pode ser necessária antes de parasitas são suficientemente sincronizada. Para gerar números adequados de merozoítos, preparar 150 ml de cultura parasita a 3 - 5% parasitemia. </li></ol> 4. Isolamento de Final Stage P. falciparum Trofozoítos <ol><li> Trinta e seis horas após o retorno da heparina para culturas, sedimentar as células cultivadas a 300 xg durante 5 min, e ressuspender em meio de pelota do parasita a 25% hematócrito. </li><li> Anexar uma grande coluna magnética (volume de matriz de 6,3ml) para um íman, e equilibrar a coluna com meio de parasita, certificando-se de que todas as bolhas de ar são removidas. </li><li> Adicionar o P. ressuspensas cultura falciparum para a coluna, e ajustar a taxa de fluxo de uma gota por segundo. </li><li> Uma vez que a cultura foi passado através da coluna, lava-se a coluna com meio parasita até que o fluxo de passagem corre claro. </li><li> Eluir parasitas a partir da coluna em 30 ml de 37 ° C meio parasita. </li><li> Preparar um esfregaço fino de parasitas, fixar em 100% de metanol por 10 segundos, e manchar com solução Giemsa por 3 min. Examine a lâmina sob o microscópio, e garantir que os parasitas quase encher o glóbulo vermelho, e parece estar em estágios iniciais esquizontes. Se os parasitas não tenham atingido a fase de maturação apropriado, retornar parasitas purificados para uma incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 1% de O2, 4% de CO2 e 95% de N2 até desenvolvido adequadamente. NOTA: pureza superior a 90% de células vermelhas do sangue infectados é necessária para assegurar a RBCs não contaminam preparações merozoite. </li><li> Tratar esquizontes isolado com 10 uM E64 (epoxisuccinil-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) para 6-10 h NOTA:. Tempos de incubação mais longos com E64 é possível, no entanto, os merozoítos produzidos deixará de ser invasivo. </li></ol> 5. Isolamento de P. falciparum Merozoítos <ol><li> Após a incubação com E64, esfregaço parasitas, fixar as células em 100% de metanol, e a mancha com solução Giemsa para avaliar a formação de merozoítos fechado por uma membrana. NOTA: Um bom rendimento de merozoites será obtida se for maior que 50% dos parasitas formaram membrana merozoites fechados. </li><li> Pellet E64 tratados esquizontes a 1.900 xg por 8 min. Lava-se com 50 ml de RT meio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado com 25 mg / ml de HEPES, 50 ng / ml de hipoxantina, 2 mg / ml de bicarbonato de sódio, e 20 ug / ml de gentamicina (meio de lavagem) para remover o restante do soro humano . </li><li> Ressuspender o sedimento em 2 ml de meio de lavagem. NOTA: Usando FCS contendo meio THP-1 vai produzir espuma durante a filtração. </li><li> Filtrar os 2 ml de ressuspensos E64-esquizontes através de um filtro de seringa de 1,2 mm μm/32. Recolhe-se o filtrado em um tubo de 10 ml. NOTA: O filtrado contém merozoites e cristais hemozoína, com esquizontes rompeu-un e detritos coletados no filtro. </li><li> Coloque uma pequena coluna magnético de um ímã, e equilibrar com 500 mL THP-1 médio. </li><li> Passa-se o filtrado sobre a coluna magnética. Recolhe-se o fluxo de passagem. NOTA: hemozoin ligarão à coluna, enquanto merozoítos vai passar. </li><li> Passar o fluxo de passagem através da coluna mais duas vezes para remover hemozoína, recolhendo o fluxo através de cada vez. </li><li> Lavar a coluna com 2 ml de RT THP-1 médio de recolher quaisquer merozoites restantes. </li><li> Adicionar EtBr em 10 ug / ml (concentração final) e mancha durante 30 min à temperatura ambiente. Proteger da luz para evitar a fotodegradação. Nota: Certifique-se que todo o líquido e p EtBr contaminadoresíduos lastic é descartado de forma adequada para produtos químicos citotóxicos. Merozoítos já não são invasivos seguir a esta incubação. </li><li> Girar merozoites a 4.000 g durante 10 min. </li><li> Elimine o sobrenadante para um recipiente adequado de lixo. </li><li> Ressuspender merozoite sedimento em 4 ml de THP-1 médio, e girar para baixo a 4.000 g durante 10 min. </li><li> Adicionar THP-1 médio até um volume de 15 ml, e proteger da luz. </li></ol> 6. Quantificação Merozoito Concentração por Citometria de Fluxo <ol><li> Traga contando grânulos para a TA. </li><li> Prepare PBS com 0,5% de BSA para diluir merozoites. </li><li> Contagem merozóitos em 3 diluições; 1 em 100; 1 em 50 e 1 em 25. Preparar tubos de FACS com 3 940, 930 e 910 ul de PBS, 0,5% de BSA, respectivamente. Adiciona-se 10, 20 e 40 ul de merozoítos purificados por tubo, respectivamente. </li><li> Pérolas de contagem Vortex durante 30 segundos, e adicionar 50 ul de esferas por tubo de FACS contendo merozoítos diluído. </li><li> Execute o três dilamostras merozoite buído num citómetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm. Definir um portão rigorosas para merozoítos baseados em EtBr e a fluorescência de GFP dupla fluorescência, e os grânulos de contagem de porta por meio de fluorescência de um canal separado. Adquirir eventos até 2.000 contas são coletados. Nota: Estas instruções referem-se a contagem de GFP + merozoites que foram contra-corados com EtBr. Se não utilizando GFP expressando parasitas então fixados portões merozoite com base em dispersão lateral e EtBr fluorescência. </li><li> Determinar a proporção de merozoítos: grânulos, dividindo o número de eventos de merozoítos por contagem dos 2.000 eventos talão, calcular uma proporção para cada diluição. Utilize as especificações de lote contagem de contas para determinar o número de contas na década de 50 mL de contas adicionadas por tubo. </li><li> Multiplique o número de contas em 50 ul pelo fator de diluição e pelo merozoite: relação talão para que o fator de diluição. Este número é igual à concentração de merozoítos por ml. Realize ªese de passos para cada diluição. </li><li> Calcular a média dos concentrações merozoite medidos nas três diluições. NOTA: Os desvios padrão acima de 10% para as concentrações determinadas para 1 em 100, 1 em 50 e 1 em 25 diluições indicam imprecisões técnicas na preparação de amostras de contagem. </li><li> Ressuspender merozóitos em 8 x 10 6 / ml em merozóitos de THP-1, meio para assegurar uma razão final de quatro merozoítos por THP-1 celular. Nota: Outras merozoite para THP-1 índices podem ser usados, e as concentrações devem ser alterados em conformidade. </li></ol> 7. Fagocitose Ensaio <ol><li> Adicionar 200 mL de calor FCS inativos por poço de placas de 96 poços de fundo em U, e deixar à temperatura ambiente O / N para bloquear placas. Após a incubação, remove FCS e lavar os poços duas vezes com 200 ul de PBS estéril. Remover PBS e armazenar as placas a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Calcular o número de células THP-1 necessários para a análise de amostras de plasma e controlos, permitindo poços em triplicado por amostra a 1 x 10 <sup&gt; 5 células THP-1 por poço. </li><li> Determinar a concentração de THP-1 de cultura através do carregamento de 10 uL de cultura em que um slide de hemocitómetro. Contar o número de células presente em 4 conjuntos de 16 esquinas do hemocitómetro sob um microscópio, em seguida, calcular a média das contagens. Multiplicar a contagem média de 10.000 para calcular o número de células por ml. </li><li> Girar o número necessário de células THP-1 a 500 xg durante 5 min, e ressuspender em 6,7 x 10 5 células / ml em meio de THP-1. </li><li> Adicionar 150 ul de células THP-1 em células THP-1 por meio de um poço de FCS-bloqueado placa de 96 poços de fundo em U, o que resulta em 10 5 células / poço. Preparar 3 poços por exemplo que irá ser testada. Retornar placa para incubadora até que esteja pronto para adicionar merozoites. </li><li> Adicionar 150 ul de preparação de merozoíto de 8 x 10 6 / ml por poço para uma FCS-bloqueado placa de 96 poços de fundo em U separados. Prepare um bem por amostra testada </li><li> Adicionar 10 pi de amostras de plasma diluídas preparadas por poço, para tele placa que contém os merozoítos, e misture bem para garantir a solução homogénea. </li><li> Remova a placa de células THP-1 a partir do incubador, e adicionar 50 ul da solução de merozoítos / plasma por poço contendo células THP-1, com cavidades triplicadas por amostra de plasma. </li><li> Misturar bem e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2, incubadora humidificada, durante 40 min. Cubra com papel alumínio para proteger da luz. </li><li> Após 40 min, as amostras de centrifugação por 5 minutos a 500 xg de um pré-arrefecido a 4 ° C centrífuga para prender a fagocitose. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes em PBS gelado 0,5% BSA EDTA 2 mM (tampão FACS). NOTA: EDTA vai facilitar a manutenção de uma suspensão de células individuais por citometria de fluxo. </li><li> Fix células em 90 ul de 2% de paraformaldeído (PFA) em PBS +0,5% de BSA EDTA 2 mM (FACS fixador). Deixar em gelo até à aquisição, protegido da luz. </li></ol> 8. Citometria de Fluxo <ol><li> Adquirir amostras usando um citômetro de fluxo wi equipadoth um laser de 488 nm e alta taxa de transferência de anexo leitor de placas. NOTA: Este vai permitir que até 400 amostras de plasma para ser testada de uma preparação de merozóito. As células também podem ser transferidas para os tubos de amostra manual de carregamento. </li><li> Portão viáveis ​​células THP-1 de frente e dispersão lateral. </li><li> Defina o portão positivo EtBr com base nos &#39;células THP-1 com merozoites e sem plasma&#39; controle. </li><li> Adquirir um mínimo de 10.000 eventos por amostra. </li></ol> 9. Data Analysis <ol><li> Analisar dados por citometria de fluxo de software de análise e defina portões rigorosos para eventos positivos EtBr. </li><li> Calcule a porcentagem de fagocitose para cada amostra: a% de células ETBR + para a amostra menos as células positivas% com plasma não imune. </li><li> Os resultados médios em todo triplicatas. NOTA: Os desvios padrão para a triplicado em excesso de 10% indicam imprecisões experimentais. Alguns fundo eventos EtBr positivos podem ser observados como resultado de merozoite a adesão à superfície de células THP-1, mas deve ser consistente entre todas as amostras contendo os merozoítos. Definir a porta com base nos &#39;células THP-1 com e sem plasma merozoites&#39; controle e, em seguida subtraindo qualquer fundo das &quot;células THP-1 com os não-imune plasma&quot; controle resultará em fagocitose% que reflete a fluorescência devido a internalizada / fagocitado apenas merozoites. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Para medir merozoite fagocitose, a proficiência em duas técnicas é necessária: Purificação de merozoítos e THP-1 ensaio fagocitose. Os passos mais críticos para combinar estas duas técnicas são: 1) parasitas altamente sincronizadas; 2) Adicionando E64 no tempo correto para produzir membranas merozoites fechados; 3) A remoção hemozoin para evitar agregados; 4) contagem merozoite precisa por citometria de fluxo; 5) a diluição de plasma utilizado; e 6) mantendo baixa densidade celular e o número de passagem das células THP-1. Uma análise cuidadosa desses aspectos-chave irá garantir respostas fagocitose robustos são observados. Embora, aqui descrita é a preparação de merozoítos para avaliar a fagocitose, a técnica pode ser utilizada para uma vasta gama de aplicações. Independentemente da metodologia de fluxo baixo, preparações merozoite ideais dependem de cronometrar corretamente E64 disso, a fim de gerar merozoites. O método descrito aqui E64 demonstrou yield merozoites invasivos para uso em microscopia de alta resolução de ocorrências de invasão e ensaios de sensibilidade a drogas 15-20. Enquanto viabilidade merozoíta não é essencial para a fagocitose, é necessária a integridade do revestimento de superfície do merozoito. Portanto, o método descrito aqui E64 permite merozoites alta qualidade a ser produzido para avaliar as respostas de anticorpos ao revestimento de superfície. Conforme descrito na Figura 1, se E64 é adicionado demasiado cedo ou membrana merozoítos fechados demasiado tarde não são formados. Por esta razão, as culturas de parasitas altamente síncronos são necessários. Aqui, a utilização de tratamentos de sorbitol e de heparina para sincronizar firmemente D10-GFP culturas de parasitas para uma janela de 2 horas é descrita. A heparina pode promover gametocytogenesis em outro laboratório isola, e, portanto, deve ser usado com cuidado. Também podem ser utilizados métodos alternativos de sincronização, tais como alanina, desde que os parasitas fortemente sincronizadas são produzidos 29. Se E64 é adicionado parasitas assíncronos, um suporte inferiorortion de merozoites fechado à membrana será produzido e restante parasita-infectados RBC será ou ruptura normalmente ou desenvolver morfologia anormal. A presença de parasitas que não foram desenvolvidos em membrana fechada merozoítos irá resultar em entupimento do filtro e reduzir significativamente o rendimento do merozoito obtido. Durante a filtração de merozoites fechado por uma membrana, hemozoin é liberada dos vacúolos digestivos e está presente como cristais livres em solução. Hemozoína é altamente pró-inflamatória e tem sido relatado para modular monócitos e macrófagos fagocitose respostas 30, 31. Além disso a modulação da fagocitose, como mostrado na Figura 2, hemozoína pode formar agregados com merozóitos em solução. Como células THP-1 pode fagocitar estes agregados, este pode ser um importante confundindo a resolução de fagocitose mediada por anticorpo. Portanto, a remoção de hemozoína é necessário neste ensaio para avcomplexidade adicional oid de hemozoin sobre a biologia dos fagócitos. Além disso, a incapacidade de remover hemozoína também pode ser prejudicial ao utilizar esta técnica para gerar merozoitos livres para outras aplicações, especialmente, onde é necessária uma quantificação merozóito. Conforme descrito na Figura 4, o número de merozoítos adicionado ao ensaio pode influenciar o grau de fagocitose por células THP-1. Apesar de citometria de fluxo permite a enumeração de concentração merozoite, pipetagem cuidadosa e replicar acusações de merozoítos são necessárias para melhorar a precisão. Isto é especialmente crítico se várias linhas de parasitas devem ser testados side-by-side. Foi previamente demonstrado que o plasma de crianças semi-imunes de PNG pode ser diluída antes de respostas significativamente diminuir 23. Aqui descrita é a diluição óptima de plasma (1/120, 000 da diluição final do plasma) para um grupo de 5 - 12 anos de idade crianças PNG que produziu a grande gama de phagocyt. respostas Osis descritos na Figura 5 Este intervalo permitido para a estratificação de respostas em quatro grupos (0 - 19%, 20-39%, 40-59% e 60-79% de fagocitose) e modelagem de regressão revelou que as respostas foram associadas com opsonizantes protecção contra a doença clínica e a parasitemia de alta densidade 10 Para coorte diferentes estudos pode ser necessário ajustar a diluição de plasma para garantir que a fagocitose por células THP-1 não está saturado ou abaixo do nível de detecção. A citometria de fluxo permite a fagocitose rápido e quantificável com maior precisão sobre microscopia. Este protocolo é uma alta taxa de transferência, placa de base e aquisição de placas de 96 poços para estudar a imunidade humoral adquirida naturalmente automatizado. O método requer a coloração de merozoítos com brometo de etídio, corantes de ADN entretanto alternativos tais como SYBRgreen, DAPI e propídio iodo, manchas ou nódoas de proteínas de membrana pode ser utilizado. Este ensaio seria passível de primarmonócitos ou neutrófilos y, e poderia ser adaptada se fagócitos ou biologia FcR era de interesse. As células primárias ou células THP-1 diferenciadas com PMA in vitro podem ser usadas para estudar a fagocitose em malária e outros agentes patogénicos 12, 32-34. No entanto, utilizando células primárias pode ser um desafio uma vez que estas células são aderentes e também exibir não mediada por anticorpos fagocitose 35. Além disso, a variabilidade em pureza, viabilidade e a funcionalidade de algumas limitações importantes para a utilização de células fagocíticas primárias. Os receptores Fc envolvidos na fagocitose merozoite permanecer descaracterizados e, portanto, usando anticorpos bloqueadores de receptores Fc específicos poderiam elucidar a contribuição de cada Fc Receptor para merozoite fagocitose. Como THP-1 fagocitose é FcR dependente, o que permite a interpretação direta da fagocitose observado. Este ensaio também se presta a abordar a especificidade do antígeno opsonizante anticorpos que podem ser atingidos por utilnalizar parasitas knock-out para antígenos de superfície merozoite, ou utilizando anticorpos humanos purificados de afinidade para merozoite proteínas de superfície. Além disso, em estudos aprofundados de respostas de citocinas seguintes merozoíta fagocitose está ausente, e pode ser alcançada com este ensaio. Estas duas técnicas constituem avanços consideráveis ​​para o estudo de anticorpos antimerozoite funcionais. A purificação dos merozoitos alta qualidade é vantajoso utilizar merozoítos criopreservado, ou microesferas fluorescentes revestidas com os antigénios merozoite. Embora este ensaio tem sido usado como uma ferramenta para avaliar a imunidade adquirida naturalmente, pode ser uma ferramenta importante para tratar a aquisição de imunidade em resposta à vacinação. Embora tenha sido recentemente demonstrado que a fagocitose ou merozoitos opsonizado está relacionado com a protecção contra a malária clínica, não é possível tirar conclusões a partir directas in vitro de THP-1 para a fagocitose in vivo phagocytosis de merozoítos como fagocitose no ensaio ocorre sob condições estáticas e na ausência de células vermelhas do sangue competem. Os possíveis adaptações deste ensaio podem, assim, proporcionar uma ferramenta versátil para uma maior compreensão da malária e merozoite fagocitose.

A importância de anticorpos para a imunidade ao Plasmodium falciparum da malária foi mostrado há 40 anos, quando imunoglobulina dos adultos hiperimunes foi passivamente transferidos para crianças que sofrem de malária grave, resultando em doença aliviada 1. Consequentemente, um esforço considerável tem procurado identificar alvos de imunidade protetora da malária, principalmente por meio de realização da sorologia para peptídeos ou proteínas expressas por bactérias ELISA. Sorologia ELISA baseado também provou altamente variável entre os estudos, e não trata a funcionalidade do anticorpo 2. Muitos antigénios de malária induzir uma IgG1 e IgG3 citofílico perfil de anticorpos, particularmente antigénios de superfície merozoite 3. Esse viés subclasse sugere que-Fc-receptor de anticorpos (CA) interações com os fagócitos são importantes para as funções efetoras da opsonizante anticorpos antimerozoite 4. Várias vacinas antígeno merozoite em desenvolvimento são projetados paraprovocar funções efetoras fagócitos 5, 6 e embora exista evidência significativa para a importância das interações anticorpo-TFR em modelos de roedores malária 7-9, e alguns estudos recentes reforçam a importância de anticorpos funcionais e funções dos fagócitos efetoras de imunidade à malária em seres humanos 10, 11, esta área continua a ser pouco estudado. Estudo em anticorpos opsonizantes específicos merozoite tem sido limitada por dois factores; a dificuldade de isolar merozóitos de boa qualidade; e respostas fagocitose variáveis ​​de células primárias. Até recentemente, a centrifugação de alta velocidade ou de densidade de Percoll gradientes foram utilizados para isolar a partir de sobrenadantes de cultura de merozóitos de ruptura culturas esquizontes. Estes merozóitos eram raramente viável, e muitas vezes ainda manipulados por centrifugação de densidade e de lavagem múltiplos passos 12, 11 ou criopreservação antes da utilização em ensaios. Estes proccessos potencialmente separar muitas proteínas associadas perifericamente a partir da superfície do merozoíto, proteínas conhecidas para ser alvos antigénicos de imunidade malárico 13. Recentemente, o inibidor de protease de cisteína trans-epoxisuccinil-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) foi usado para gerar merozoítos viáveis. E64 impede ruptura esquizonte, os merozoítos gerando membrana fechada 14, que pode ser interrompido por meio de filtração para libertar merozoítos viáveis ​​15, 16. Esta técnica levou à resolução espacial de numerosas proteínas durante a invasão de eritrócitos 15, 17-19 e esclareceu o efeito específico palco de vários medicamentos antimaláricos 16, 20. No entanto, a geração de merozoítos viáveis ​​permanece um desafio técnico. Para ajudar na divulgação desta técnica e aplicação de testes funcionais da imunidade, um protocolo detalhado para a purificação merozoite viável e seu uso em umensaio funcional padronizado de anticorpo: cooperação celular em opsonização e fagocitose é descrito aqui. Esta técnica demonstra um avanço significativo sobre os ensaios anteriores in vitro de merozoíto opsonização, como a explosão respiratória dos neutrófilos, Antibody Dependent Cellular Inibição (ADCI), e ensaios de fagocitose de merozoítos alternativos. Estes ensaios são pouco reprodutível devido à variação dos insumos do parasita ea atividade das células fagocíticas primários 11, 21. Contaminando hemozoin também pode afetar profundamente a função fagocitária 22. Um ensaio de merozoítos fagocitose robusto e reprodutível recentemente relatado 23 utiliza a linha de células promonocíticas THP-1 24. Este é um tipo de célula ideais para ensaios de citometria de fluxo de alto rendimento, uma vez que é não-aderente e, especificamente, realiza Fc-Receptor fagocitose mediada por 25, 26. Uma complexidade adicional, enquanto investidorestigating fagocitose é que o grau de fagocitose está dependente do número de merozoítos relativos a células THP-1 e de concentração de plasma. Para garantir a reprodutibilidade entre experimentos, merozoites devem ser enumeradas e uma concentração definida usado. Devido ao seu pequeno tamanho, por citometria de fluxo de quantificação é necessária. O procedimento aqui descrito remove hemozoína e gera merozoítos viáveis, e descreve a aplicação desses merozoítos por citometria de fluxo de enumeração de merozoítos seguido por opsonização e fagocitose. Embora tecnicamente exigente, as técnicas descritas podem ser úteis para elucidar a contribuição de respostas de anticorpos específicos de superfície merozoite a adquirida naturalmente e vacina induziu imunidade.

<table><tbody><tr><td>THP-1 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapthoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>Use in Fume Hood</td></tr><tr><td>Pen/Strep Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SAFC</td><td>90909C</td><td>Cell culture grade</td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Calbiochem</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum&amp;nbsp;</td><td>Donation from Australian Red Cross</td><td></td><td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Pfizer</td><td>61022027</td><td>Injection Quality</td></tr><tr><td>Heparin Sodium BP (5000 IU/ml)</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Porcine origin</td></tr><tr><td>Blasticidin S-hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>E64 Protease Inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132-10MG</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98281-100G</td><td>Use for phosphate buffer</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4.&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck</td><td>10383.4G</td><td>Use for phosphate buffer</td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s azur eosin methylene blue solution</td><td>Merck</td><td>1.09204.0500</td><td>1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>Acrodisc Syringe Filters 1.2-&amp;mu;m/32-mm</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4656</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator (for small column)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-091-051</td><td>Interchangeable with MidiMACS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VarioMACS Separator (for large columns)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>LS Column (small magnetic column)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Large magnetic column</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Bio-Rad</td><td>1510433</td><td>Cytotoxic</td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Invitogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>FlowJo cytometry analysis software</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

Antígenos merozoite Plasmodium falciparum estão em desenvolvimento como potenciais vacinas contra a malária. Um aspecto da imunidade contra a malária é a remoção de merozoitos livres do sangue pelas células fagocíticas. No entanto a avaliação da eficácia funcional dos anticorpos opsonizantes específicos merozoite é difícil, devido à meia-vida curta de merozoítos e a variabilidade de células fagocíticas primárias. Aqui descrito em pormenor um método para a geração de merozoítos viáveis ​​utilizando o inibidor de protease E64, e um ensaio de fagocitose dos merozoítos opsonina-dependente utilizando a linha de células pró-monocítica THP-1. E64 impede ruptura esquizonte, permitindo o desenvolvimento de merozoítos que são liberados por filtração de esquizontes tratados. Merozoítos brometo de etídio marcadas são opsonizadas com amostras de plasma humano e adicionados a células THP-1. A fagocitose é avaliada por um protocolo de alto rendimento padronizado. Merozoites viáveis ​​são um recurso valioso para a avaliação numeraspectos ous de P. biologia falciparum, incluindo a avaliação da função imunológica. Os níveis de anticorpos medidos por este ensaio estão associados com a imunidade à malária clínica em indivíduos naturalmente expostos. O ensaio pode também ser usado para avaliar a vacina induziu anticorpos.

O estádio de maturação dos parasitas antes do tratamento E64 é fundamental para a geração de merozoítos fechado à membrana. 1ai Figura mostra o estágio de maturação adequado de esquizontes para adicionar E64. Os parasitas devem ser grandes e quase encher o glóbulo vermelho. Um aspecto manchado de Giemsa indica merogonia tenha iniciado, e E64 deve ser adicionada para se obter merozoítos fechado por uma membrana (Figura 1Aii). Se E64 é adicionado anteriormente para trofozoíto parasitas palco, membrana merozoites fechados não são gerados, mesmo depois de 12 horas de E64. Em vez parasitas assumir morfologia anormal, tal como o alargamento do vacúolo digestivo (Figura 1BI e 1Bii), e merozoitos não são formados. Se E64 é adicionado mais tarde para esquizontes, merozoites fechado à membrana não são gerados como ruptura esquizonte é desinibida (Figura 1CI e 1Cii). É necessário um alto nível de parasita sincronia, outrosábio uma gama de todos os três resultados descritos será visto após o tratamento E64. Remoção de hemozoin é mais um passo crítico para merozoites de purificação. Se não merozoítos são purificados a partir hemozoína seguida aglomerados merozoite-hemozoína formar o que não pode ser desalojado por pipetagem. Estes agregados executado no citômetro como eventos isolados, embora com características diferentes para a frente-de dispersão e de lado de dispersão do que merozoites individuais, resultando em contagem merozoite imprecisa por citometria de fluxo (Figura 2A). Como células THP-1, também podem fagocitar hemozoína, estes aglomerados de merozoítos-hemozoin também pode ser fagocitado (Figura 2B). Estes agregados são fluorescentes altamente EtBr, pois contêm vários merozoítos. A fagocitose dos agregados resulta em células THP-1 de perfil EtBr fluorescência equivalente à observada para a fagocitose de múltiplos merozoítos individuais. Assim, se hemozoína não for removido, a fluorescência do EtBr células THP-1 será um overestimate do potencial de opsonização do plasma testada. Hemozoína também é relatado para alterar significativamente a função dos fagócitos. GFP positivas merozoítos são contra-coradas com EtBr para aumentar a visualização dos merozoítos fagocitose por células THP-1. Usando as condições descritas no presente protocolo, todos os merozoítos GFP positivas são contrastadas com EtBr, que tem uma intensidade de fluorescência mais brilhante (Figura 3A). Avaliação de fagocitose por EtBr fluorescência permite uma resolução superior de merozoíto fagocitose de fluorescência da GFP (Figura 3B). O número de merozoítos adicionadas ao ensaio irá modular a quantidade de fagocitose observada. Por esta razão, uma contagem precisa por citometria de fluxo é crítica. Aumentando rácios de merozoítos: THP-1 vai resultar num aumento da adesão de merozoítos para células THP-1 na ausência de plasma (Figura 4A). Aumentar merozoite: THP-1 índices também resulta em aumento do pHrespostas agocytosis quando merozoítas opsonizado (Figura 4B). Um 04:01 merozoíta: THP-1 rácio é recomendado para respostas fagocíticas robustos. Usando esta relação, e a diluição de plasma indicado, este ensaio é capaz de resolver baixas, intermediárias e níveis elevados de anticorpos opsonizantes. Entre 0 e 78 por cento de fagocitose respostas foram observadas em amostras de plasma PNG e as outras condições descritas. Tais respostas foram recentemente mostrado a associar com imunidade clínica adquirida naturalmente à malária 10. Figura 5 mostra exemplos dos quatro quartis de respostas fagocitose de indivíduos PNG. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Sincronismo de E64 disso é crítico para a geração de merozoítos fechado por uma membrana. (A) maturatio Apropriada. fase de parasitas n i) antes do tratamento E64, e ii) merozoites fechado à membrana produzidos após 6 horas de tratamento E64 (B) membrana merozoites fechados não são gerados se E64 é adicionado parasitas imaturos; i) trofozoítos fase tardia, e ii) após 12 horas de E64 (C) esquizontes ruptura não é inibido se E64 é adicionado ao final segmentado esquizontes.; i) esquizontes fase tardia, e ii) após 6 horas de E64. A barra de escala representa 10 um. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Remoção hemozoin Figura 2. Crítico é para gerar uma suspensão de uma única célula de merozoíto. Agregados Merozoito-hemozoin formulário seguinte de filtração de membrana merozoítos fechados, a menos que hemozoína está magneticamente separada do merozoitos. (A) de avanço-dispersão e de lado de dispersão de parcelas com merozoítos hemozoin removidoe hemozoína retido. (B) agregados hemozoin-merozóito podem ser fagocitados pelas células THP-1. Coradas Diff-Quick lâminas cito-rotação de células THP-1 foram incubadas com plasma opsonizado PNG preparações merozoite com ou sem hemozoína. A barra de escala representa 10 um. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Coloração de brometo de etídio permite a resolução superior de merozoite fagocitose. D10-GFP merozoítos purificadas são contrastado com EtBr para melhorar a intensidade de fluorescência. (A) A citometria de fluxo histograma de merozoítos purificadas com gating em GFP merozoites positivos e um dot blot mostrando EtBr fluorescência dentro desta população positiva GFP fechado. (B) dispersão para a frente contra a GFP e dispersão para a frente contra EtBr de células THP-1 na sequência de fagocitose de GFP e EtBr merozoítos fluorescentes duplas. Portões foram d<html> rawn com base nas células THP-1 com merozoítos e sem controlo de plasma. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> A Figura 4 A merozoíta:. THP-1 rácio influencia o grau de fagocitose observada. (A) Cinco merozoite: THP-1 índices são retratados; 50:1, 20:1, 10:1, 04:01, 01:01. Células único controle indica fluorescência de fundo devido a células THP-1. THP-1 de fluorescência EtBr para cada relação é indicado para merozoítos opsonizadas com um pool de plasma PNG ou com plasma australiano não imune (B) Média da intensidade de fluorescência de células THP-1 para merozoíta diferente:. THP-1, as proporções, e opsonização com uma piscina de plasma PNG ou plasma australiano não imune (média + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Uma grande variedade de anticorpos opsonizantes pode ser medido. Merozoítos foram opsonizado com plasma de indivíduos PNG e incubadas com células THP-1. Quatro respostas fagocitose representativos são mostrados. Portões foram desenhadas com base nas células THP-1 com merozoites e sem controle de plasma, e os números indicam a fagocitose% após subtracção das células THP-1 com controle de plasma não imune. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo.

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

23.0K visualizações.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo. 

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A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrócitos&gt; infectados em uma configuração com poucos recursos

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Imunologia e Infecção

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Separação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fase Tardia eritrócitos infectados por meio magnético

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spectrometer in conjunction with Multivariate Data Analysis (MVDA). 3D7 P. falciparum were cultured to 10% parasitemia ring stage parasites and used to spike fresh donor isolated RBCs to create a dilution series between 0&#8211;1%. 10 &#181;L of each sample were placed onto the center of the ATR diamond window to acquire the spectrum. The sample data was treated to improve the signal to noise ratio and to remove the contribution of water, and then the second derivative was applied to resolve spectral features. The data were then analyzed using two types of MVDA: first Principal Component Analysis (PCA) to determine any outliers and then Partial Least Squares Regression (PLS-R) to build the quantification model.

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Here, we present a protocol for the detection and quantification of Plasmodium falciparum in infected aqueous red blood cells using an attenuated total reflection infrared spectrometer and multivariate data analysis.

Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

Química

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective immunity to malaria is still poorly understood, mainly due to methodological limitations of long-term Plasmodium culture, especially for Plasmodium vivax. Most studies have focused on adaptive immunity protection against malaria by antibodies, which play a key role in controlling malaria. However, the sterile protection induced by attenuated Plasmodium sporozoites vaccines is related to cellular response, mainly to cytotoxic T lymphocytes, such as CD8+ and gamma delta T cells (&#947;&#948; T). Hence, new methodologies must be developed to better comprehend the functions of the cellular immune response and thus support future therapy and vaccine development. To find a new strategy to analyze this cell-mediated immunity to Plasmodium blood-stage infection, our group established an in vitro assay that measures infected red blood cell (iRBC) killing by cytotoxic lymphocytes. This assay can be used to study cellular immune response mechanisms against different Plasmodium spp. in the blood stage. Innate and adaptative cytotoxic immune cells can directly eliminate iRBCs and the intracellular parasite in an effector:target mechanism. Target iRBCs are labeled to evaluate cell viability, and cocultured with effector cells (CD8+ T, &#947;&#948; T, NK cells, etc.). The lysis percentage is calculated based on tested conditions, compared to a spontaneous lysis control in a flow cytometry-based assay. Ultimately, this killing assay methodology is a major advance in understanding cell-mediated immunity to blood-stage malaria, helping uncover new potential therapeutic targets and accelerate the development of malaria vaccines.

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

Here we describe a new method to help elucidate the mechanisms of cellular immunity to Plasmodium during the blood stage of infection. This is an in vitro assay that measures infected red blood cell killing by cytotoxic lymphocytes.&#160;

In vitro Ensaio de Morte de Hemácias Infectadas por Plasmodium por Linfócitos Citotóxicos

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Biologia

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.

Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

<meta charset="utf8"></head><body>Identificando a religação de quinases no parasita da malária: uma abordagem de genética química

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more pronounced for target genes belonging to the multigene family. Plasmodium falciparum protein kinases belonging to the CDPK family are essential for blood stage development. As such, CDPKs are considered good targets for the development of anti-malarial compounds. The chemical genetics approach has been historically used to elucidate the function of protein kinases in higher eukaryotes. It requires the substitution of gatekeeper residue for another amino acid with a different side chain through genetic manipulation. Amino acid substitution at the gatekeeper position modulates the activity of a protein kinase and changes its susceptibility to a specific class of compounds known as bumped kinase inhibitors (BKIs) that help in the functional identification of the target gene. Here, we have exploited the chemical genetics approach to understand compensatory mechanisms evolved by a mutant parasite harboring a hypomorphic allele of cdpk1. Overall, our approach helps in identifying compensatory pathways that may be simultaneously targeted to prevent the development of drug resistance against individual kinases.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Identificando vias compensatórias em parasitas da malária contendo alelo hipomórfico de proteínas quinases essenciais

Chemical genetics involves the substitution of a gatekeeper residue with an amino acid containing a different side chain at the target locus. Here, we have generated a mutant parasite containing a hypomorphic allele of cdpk1 and identified compensatory pathways adopted by the parasite in the mutant background.

Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

High Yield purificação

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Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por

Separação de