This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Preparação de culturas de células de parasitas, Coleção de Parasite Pellets <ol><li> Prepare meio RPMI-1640-HEPES por adição de 10 g de pó de meio RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sódio, tampão HEPES 5,9 g, 50 mg de hipoxantina e 3,8 g de dextrose em 1 L estéril dH 2 O. Misture usando a tabela agitador magnético até que todos o pó se dissolva em 1 L de água destilada. Execute micro filtração de mídia usando 0,22 nm. Armazene a mídia em frascos esterilizados. </li><li> Lavar não infectados (fresco) do tipo A + eritrócitos utilizando RPMI. Prepare a 5% de hematócrito dos eritrócitos (0,5 ml de eritrócitos frescos lavados em 9,5 ml de 10% RPMI + soro humano). </li><li> Adicione 15% de soro humano + RPMI (15 ml de soro humano e 85 ml de RPMI) para iniciar a cultura de parasitas. Adicione 10% de soro humano e meio RPMI (10 ml de soro humano e 90 ml de RPMI) para continuar a cultura de parasitas nas células vermelhas do sangue. </li><li> Cultura P. falciparum (3D7 e FCR-3 estirpes) em TipoA + humanos eritrócitos a 5% de hematócrito e de 20% de parasitemia em placa de petri ou num frasco de cultura de 75 centímetros 3. Manter a cultura in vitro de acordo com o método de Trager e Jensen vela frasco 26. Alternativamente, manter culturas são em incubadora a 37 ° C mantendo 9,5% de CO 2 e 3,4% de N 2 gasoso. Cultura P. falciparum em meio RPMI 1640 suplementado com HEPES meios 10% de soro humano. </li><li> Sincronize P. falciparum cultura pela adição de 65% de Percoll (65 ml de Percoll + 35 mL de meio RPMI-1640 sem soro humano) para concentrar a cultura 27. </li><li> Centrifuga-se o concentrado de cultura com Percoll a 2500 xg durante 5 minutos o que resulta em 3 camadas. Cuidadosamente, com uma pipeta de transferência isolar esquizontes da transferência camada intermediária em um tubo separado sob condições assépticas 27. </li><li> Lavam-se as culturas de isolado com 10% de soro humano + RPMI-1640 por duas vezes para remover o excesso de Percoll por centrifugação a 7500 xg durante 5 min. DiScard o sobrenadante de cada vez, sob condições assépticas 27. </li><li> Continuar a cultura de P. sincronizado esquizontes falciparum em 10% de soro humano + 27 meio RPMI-1640. </li><li> Recolhe esquizontes por tratamento de Plasmodium eritrócitos infectados com 10 mM de Tris pH 8,8 e centrifugação a 15000 xg durante 15 min 23. Pelotas do parasita da loja, a -70 ° C após a adição de 5 ul de inibidor de protease (aprotinina) para as peletes. Use pastilhas de parasitas para extração de proteínas, o isolamento de ADN genómico e RNA isolamento. </li></ol> 2. Preparar plasmídeo Vector <ol><li> Isolar o ADN genómico a partir de P. pelotas esquizontes falciparum preparados a partir de culturas de cerca de 20% de parasitemia. </li><li> Adicionar 600 ul de 10 mM Tris-HCl de pH 7,6, 50 mM de EDTA pH 8,0, 0,1% de SDS e 1 mg / ml de proteinase K, para os microgrânulos num tubo de microcentrífuga, homogeneizar sedimento utilizando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 26. Alternativa encher a seringacom a mistura de sedimento e de esvaziamento para um tubo de microcentrífuga de 20 vezes. Incubar tubo contendo homogeneizado de O / N em um banho de água a 50 ° C. </li><li> Realizar fenol - clorofórmio (P + C) Extracção por adição de 600 ul de P + C (300 ul de fenol e 300 ul de clorofórmio) para sedimento homogeneizado. Tubo de tampa bem apertada e agite a mistura vigorosamente invertendo final end-to-tubo. Tubo de centrifugação a 14000 xg durante 2 min e recolher solução aquosa superior utilizando uma micropipeta para um novo tubo de microcentrifugação. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Adicionar 600 ul de clorofórmio à camada aquosa no tubo novo a partir do passo 2.1.2. Vortex o tubo durante 10 segundos e centrifugar a 14000 xg durante 2 min. Medir a camada aquosa superior com uma micropipeta e transferi-lo para um novo tubo de microcentrifugação. </li><li> Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 5 M pH 5,5 e um volume de isopropanol (se camada aquosa é adicionar 300 ul 30 ul de acetato de sódio 5 M pH 5,5 + 330 mL de isopropanol) para a postura aquosoer a partir do passo 2.1.3. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 14.000 xg durante 10 min para precipitar sedimento de DNA. Descartar o sobrenadante e lave o peletizado com 100 ul de etanol a 70% (70 ul de etanol e 30 uL de dH2O) para remover o excesso de sal a partir do ADN. DNA da loja em 50 ul de dH2O a -20 ° C. </li><li> Conceber iniciadores directos e inversos usando software ou manualmente para a amplificação de P. genes falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 e PF3D7_0114100 previamente identificados em estudos 16,18 proteoma com locais de restrição apropriados para permitir a clonagem das sequências de genes para os múltiplos locais de clonagem do plasmídeo de expressão pT7CFE1-CHIS, como mostrado na Tabela 2. </li><li> Fazer uma mistura reaccional de 50 ul por adição; 5 ul de P. isolado ADN genómico de P. falciparum, 5 ul de tampão 10x, 5 jil de MgCl2, 1,5 ul de iniciador directo, 1,5 ul deiniciador de sentido reverso, 0,5 jil de polimerase de ADN de T7 e 31,5 uL de dH2O e realizar a reacção em cadeia da polimerase (PCR) a 94 ° C durante 8 min para desnaturação, 50 ° C durante 1 min 30 s para a extensão e 72 ° C durante 9 min para o recozimento e renaturação para amplificar os genes mostrados na Tabela 1. </li><li> Os produtos de PCR separados sobre gel de agarose a 1% (1 g de agarose e 100 ml de acetato de Tris EDTA (TAE) tampão) 32. </li><li> Corte as bandas de DNA amplificados por PCR a partir do gel de agarose, colocar as fatias de gel que contêm o ADN numa coluna de extracção de ADN de gel de rotação e congelar a -20 ° C durante 5 min. Adicionar 100 uL de isopropanol para as fatias de gel congelado e centrifugar a 14000 xg durante 5 min. </li><li> Medir o escoamento aquosa filtrada no tubo de recolha a partir do passo 2.5, utilizando uma micropipeta e transferir para um tubo novo. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 5 M e centrifugar a 14000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e adicionar 10 uL de dH2O para the sedimento de DNA. </li><li> Digerir o vector de expressão pT7CFE1-Chis e os fragmentos de ADN purificado a partir de (2.6) em dois tubos separados pela adição de 3 ul de plasmídeo e 5 ul de produtos de PCR do gene para cada tubo. Adicionar a cada tubo, 1 ul de enzimas de restrição específicas, 2 ul de tampão de reacção e 14 ul de dH2O </li><li> Adicionar 3 ul de plasmídeo digerido, 5 ul de fragmentos de ADN digeridos, 2 ul de tampão ligase 10X, 1 ul de ligase e 9 jil de dH2O num tubo de microcentrífuga. Incubar a 12 ° CO / N. </li><li> Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 3M a pH 5,5 e 2 volumes de etanol (se o volume de tubos de ligação é de 20 ul adicionar 2 mL de 3 M de acetato de sódio + 44 mL de etanol) para o tubo a partir do passo 2.14. Misturar bem e incubar à temperatura de -20 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 14.000 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma pipeta micro sem perturbar o sedimento. </li><li> Adicionar 100 ul de etanol a 70% tO sedimento do passo de 2,10. Centrifuga-se o tubo a 14000 xg durante 5 min. Remova e descarte o sobrenadante. Adicionar 10 ul de água isenta de nuclease para o sedimento de DNA. </li></ol> 3. Usando Protein Expression in Vitro Célula humana Livre Expressão Sistema <ol><li> Preparar 20 ul de mistura de transcrição medindo 2 ul do recombinante pT7CFE1-Chis plasmídeo de DNA, 4 ul de tampão de transcrição 5x, 4 ul de mistura de NTP, 2 ul de ARN-polimerase de T7 e 8 mL de água isenta de nuclease para 2 passos humanas in vitro Protein Expression usando moldes de ADN. Misturar os componentes num tubo de microcentrífuga e incubar durante 75 min a 30 ° C num banho de água. </li><li> Tome 2 ul da mistura de transcrição e adicioná-lo para 23 ul de mistura de tradução contendo 12,5 ul de lisado de células HeLa, 2,5 ul de proteínas acessórias, 1 ul de solução de sal de A, 0,5 ul de aminoácidos Met, 0,5 ul de aminoácidos Leu, 181; l de inibidor de RNAse, 1,25 mL de cabaz energético e 3,75 mL de água livre de nuclease. </li><li> Incubar a mistura de tradução a partir do passo 3.2 a 30 ° C durante 90 min. Loja produtos traduzidos a -20 ° C. </li><li> Preparar 25 ul de mistura de transcrição e de tradução através da adição de 3 ul de o recombinante pT7CFE1-Chis plasmídeo de ADN, 2 ul de água isenta de nuclease, 5 ul de mistura de reacção, 12,5 ul de lisado de células HeLa e 2,5 ul de proteínas acessórias para um passo- Juntamente Humano Expressão IVT proteína para moldes de ADN. </li><li> Incubar a mistura de reacção a partir do passo 3.4, durante 90 min a 6 h a 30 ° C. Guarde os produtos de tradução -20 ° C. </li></ol> 4. Purificação de proteínas recombinantes expressas <ol><li> Adicionar 75 ul de tampão de purificação 1x a 25 ul de produto de tradução para perfazer 100 uL de mistura de purificação. </li><li> Adiciona-se 100 ul de resina quelante de níquel de 100 ul de mixt purificaçãoure. Lavar Ni-resina duas vezes por adição de 300 uL de dH2O e 300 ul de tampão de ligação. Re-suspender resina e centrifugar a 14000 xg durante 1 min para remover o excesso de etanol. </li><li> Adiciona-se 100 ul de mistura a partir do passo de purificação de 4,2-100 ul de resina quelante de níquel e incubar a mistura durante 60 min à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a mistura a 14000 x g durante 1 min e recolher o sobrenadante para um novo tubo marcado como &quot;flow through&quot;. </li><li> Lavar a resina com 100 ul de 1x tampão de lavagem (imidazol 20 mM, 250 mM de NaH 2 PO 4 a pH 8, 2,5 M de NaCl e dH 2 O). Centrifugar a 14.000 xg por 1 min e recolher o sobrenadante no novo tubo rotulado de &quot;lavagem&quot;. Repita o passo 4.5 duas vezes. </li><li> Adicionar 100 ul de 1x tampão de eluição (imidazole 100 mM, 250 mM de Na 2 PO 4 a pH 8,0, 2,5 M NaCl e dH2O) à resina e incubar durante 15 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. Faça o passo de eluição duas vezes. Cadatempo recolher o sobrenadante para tubos de microcentrífuga fresco e rótulo como &quot;fluido&quot;. </li><li> Após eluição, lavar a resina duas vezes tal como descrito no passo 4.5. Fluir através da loja, lavagens e amostras de eluição à temperatura de -20 ° C ou inferior. A resina deve ser armazenada a 4 ° C. Utilizar 30 ul de cada amostra para SDS-PAGE e análise de imunotransferência. </li></ol> 5. Coomassie (Bradford) Ensaio de Proteína 34 <ol><li> Preparar padrão de albumina de soro bovino (BSA) as soluções com a concentração de 20 ug / ml (mistura de 10 ul de BSA (2 mg / mL) e 90 uL de dH2O), 40 ug / ml (mistura de 20 ul de BSA (2 mg / mL) e 80 uL de dH2O), 60 ug / ml (mistura de 30 ul de BSA (2 mg / mL) e 70 uL de dH2O), 80 ug / ml (mistura de 40 ul de BSA (2 mg / mL) e 60 uL de dH2O), 100 ug / ml (mistura de 50 ul de BSA (2 mg / mL) e 50 uL de dH2O), 160 ug / ml (mistura de 80 ul de BSA (2 mg / mL) e 20 uL de dH2 O) e 200 ug / ml (100 l de BSA (2 mg / ml). </li><li> Medida 5 ul de fluxo através de lavagens e amostras de eluato do passo 4.7. Adicionar 95 uL de dH2O </li><li> Adicionam-se 5 ml de reagente azul de Coomassie para as misturas dos passos 5.1 e 5.2. Cubra os tubos com parafilme e de vórtice durante 10 seg depois incubar durante 20 min à TA. </li><li> Usando um espectrofotómetro, medir a densidade óptica (DO) ao comprimento de onda de 650 nm para os tubos de proteína a partir do passo 5.3. Lote concentração vs. leitura OD para determinar as concentrações de proteínas 34. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> Adicionam-se 5 ul de extractos de P. esquizontes falciparum, 2 ul de Escherichia coli recombinante expressa rhOP-3 proteínas 31, 5 ul de proteínas recombinantes expressas utilizando 2-passo e um passo em sistemas de expressão in vitro humano e 10 ul de produtos de proteína purificada utilizando o método de afinidade para separar os tubos. </li&gt; <li> Adicionar tampão de amostra de electroforese contendo mercaptoetanol a cada tubo para um volume final de 20 ul de fazer amostras de proteínas solubilizadas. Ferver tubos durante 2 minutos. </li><li> Carregue amostras de proteínas solubilizadas sobre 10% de gel SDS-PAGE para separar as proteínas. </li><li> Transferir proteínas separadas a partir de géis de SDS-PAGE para papel de nitrocelulose (PCN) por electroforese a 35 mA por gel em uma câmara de western blotting semi-seco durante 2 h. </li><li> Bloco PCN após a transferência com 2% de leite desnatado. </li><li> Incubar bloqueados PCN com os seguintes anticorpos policlonais diluídos 1: 100 em 2% de leite para efectuar transferência de Western; anticorpo de coelho # 676 21 específico para P. roptrias merozóito falciparum, 20 anticorpos de ratinho específicos para P. yoelii e P. roptrias merozoite berghei, anti-soros # 685 específicos para a P. falciparum proteína vacúolo parasitóforo, SERA (serina rico antígeno) 22 e anticorpos específicos para o Maurer217; s proteína fenda CGFP-2TM 28. </li><li> Incubar PCNs também em 1: 100 controles do mouse e soro de coelho e cultura gasto sobrenadante (SCS) a partir de células de mieloma SP2 normais diluído como negativos. </li><li> Incubar PCNs com anticorpos e os controlos nas 4 ºC O / N. </li><li> Lavar PCN 4x com tampão Blot e incubar PCN com espécies anticorpos secundários específicos conjugados com peroxidase de rábano (HRP), diluído 1: 1000 em 2% de leite. </li><li> Lavar PCN 4x com tampão de transferência. Incubar PCN lavada com a solução de desenvolvimento de cor A + B (Solução A: adicionar 50 ml de tampão 1x Blot e 30 ul de H 2 O 2; Solução B: adicionam-se 10 ml de metanol e 30 mg de 3-cloro-naftol) para 30 min no escuro. Analisar os resultados western blot colorimetria. </li></ol>

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Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

Os passos importantes para a expressão bem sucedida das proteínas em dois passos, utilizando em sistema de expressão de células humanas in vitro livre e purificação são: 1) a amplificação bem sucedida e clonagem de genes em pT7CFE-Chis plasmídeo vector; 2) a transcrição do RNA a 30 ° C; 3) a tradução de proteína a 30 ° C na presença de inibidor de ARNase; 4) desenvolver o protocolo de purificação de afinidade com base usando esferas de resina revestidos com Ni e 5) análise de resultados e...

Na pesquisa da malária, a expressão de proteínas imunogénicas utilizando sistemas baseados em células procarióticas ou eucarióticas continua a ser um desafio. A riqueza AT do genoma de Plasmodium e desconhecidos os mecanismos pós translacionais 14,7, contribuir para as dificuldades associadas com a obtenção de proteínas correctamente dobradas e imunogénicos para produção de anticorpos e estudos de vacinas. Sistemas procariotas tais como Escherichia coli, têm sido utilizados para a expressão da proteína recombinante. Sistemas procariotas são de baixo custo, eficaz, produzir altos rendimentos de proteína recombinante e ter vários vectores de clonagem. Anfitrião E. coli são fáceis de transformar e células crescem rapidamente. No entanto, os sistemas procarióticos têm limitações, tais como a falta de substituição de aminoácidos, modificação pós-translacional, risco de contaminação, produtos heterogéneos e acumulação de proteínas recombinantes dentro de corpos de inclusão 24. Em umestudo realizado por Mehlin et al. (2006), 1000 grelhas de leitura aberta (ORF) foram expressos. Aproximadamente 7% das proteínas expressas foram solúvel 14. A insolubilidade observado é devido à natureza tendenciosa dos genes e da alta freqüência de códons que são usados ​​idealmente pelo Plasmodium AT genoma rico 14. Uma estratégia alternativa para ultrapassar este problema foi desenvolvido usando plasmídeos ou células hospedeiras contendo ARNt que reconhece codões raros ou codões que correspondem aos três frequências. Mesmo depois de executar essas otimizações, muito pequenas porções de proteínas são expressas como solúvel, ativa e imunogênica 14. Os sistemas de expressão isentos de células contêm todos os componentes necessários para a transcrição e tradução, tais como os ribossomos, fatores de iniciação, factores de alongamento (traduções fatores), tRNA e aminoacil-tRNA. Ambas as reacções de transcrição e de tradução são acopladas no procedimento de um só passo 11,29. O transcriPÇÃO reacção é realizada num tubo antes quantidade adequada de mRNA é incubada com uma maquinaria de tradução em 11,29 tubo diferente. Embora estes métodos são bem sucedidos em Plasmodium sp. A expressão da proteína, uma grande desvantagem é o período de tempo para a expressão da proteína, que é de aproximadamente 22 h 29. Além disso, o alto custo dos materiais para inclusão nos protocolos 29, os preparativos de trabalho intensivo do ligado celular e inconsistências nos preparativos de componentes, tornar esses sistemas inatingível. O principal foco dos pesquisadores para o desenvolvimento de um sistema de expressão livre de células depende de fatores como a rápida modificação genética, os rendimentos rápidos com altas concentrações e preparações lisado para a frente em linha reta 1. Os sistemas eucarióticos, tais como leveduras, linhas celulares de mamíferos, baculovírus sistema de expressão mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum e sistemas de expressão parasitárias such como Leishmania foram utilizados para a expressão da proteína recombinante 7. Os sistemas eucarióticos partes relação filogenética e, por conseguinte, também partilham características, tais como glicosilação, acilação, formação de ligação dissulfureto, interacção chaperona, proteólise e compartimentalização sub-celular. Eventos secreção de proteínas em eucariotas evitar a acumulação e toxicidade diminui para sistemas de expressão 13. A utilização de sistemas de leveduras é preferível que elas sejam adequadas para a expressão de proteínas em grande escala e para a obtenção de rendimentos elevados 4. Dois P. proteínas falciparum PfCP-29 e Pvs25 foram produzidas utilizando o sistema de levedura 4. No entanto, uma grande desvantagem na síntese da maioria das proteínas foi padrões irregulares de N e O-glicosilação, truncagem e dobragem incorrecta de proteínas a partir da sua forma nativa 4. A utilização de células de mamíferos para a síntese de proteínas recombinantes é trabalho intensivo e é expensive para manter linhas de células recombinantes estáveis ​​4. Portanto, as células de mamíferos têm-se limitado para a análise de sinalização de proteína, as interacções proteína e interacções hospedeiro-parasita e também para testar as vacinas de ADN 4. O ADN humano e de ARNm no sistema in vitro isento de células de expressão da proteína aqui descrito é um sistema de mamífero baseados em derivados de células HeLa que expressam as proteínas em 3 h. As proteínas expressas utilizando pT7CFE1-chis vetor de expressão têm uma tag C-terminal facilitando a identificação e purificação. O sistema de base de HeLa é suplementado com factores de iniciação da tradução e um regulador de tradução, aumentando assim a eficiência do sistema de tradução. As proteínas podem ser rapidamente traduzidos, peneirados, verificado e processado para uso em várias aplicações imunológicas e estruturais 15. Os sistemas de expressão isentos de células eucarióticas, tais como germe de trigo e de reticulócitos de coelho são actualmente utilizados para a expressão de varproteínas eucarióticas ious incluindo proteínas de Plasmodium 11,29. Além disso, a E. sistemas livres de células com base coli também são empregues para a expressão da proteína eucariótica 11. A Tabela 1 resume os diferentes sistemas de expressão de células livres, comparando as características dos sistemas, bem como a facilidade da utilização dos sistemas para a expressão da proteína. O sistema isento de células humano em comparação com os outros tem a capacidade de executar pós e co-translacional modificações e é menos dispendiosa. Codon optimization é possível e todas as reacções podem ser realizadas em 3 h. O sistema de HeLa é um sistema de tradução ideal para a síntese de proteína no ambiente de laboratório. Uma grande vantagem dos sistemas de expressão de células humanas livre em relação a outros sistemas livres de células, é a disponibilidade de várias linhas celulares diferentes derivadas de diferentes órgãos e tecidos. Existem diversas variedades de sistemas isentos de células pode ser desenhado dependendo da linha celular. O extractos derivados a partir de células de mamífero têm uma maior eficiência de sintetizar proteínas grandes do que quaisquer outros sistemas de expressão de célula livre. Estes sistemas de células sem expressão podem também ser utilizados em aplicações de diagnóstico e caracterização de proteínas, tais como micro matrizes 30. As linhas de células HeLa populares são mais amplamente utilizados para realizar a expressão de proteínas 33. O retículo endoplasmático nas linhas de células HeLa é subdesenvolvidos, levando à ausência de glicosilação pós-tradução actividade modificação 33. No entanto, este sistema é que se acredita ser vantajoso para a síntese de proteínas Plasmodium Plasmodium como também não possui modificação pós tradução 29 glicosilação. O protocolo de transcrição-tradução livre de células HeLa é de fácil execução, barata e as proteínas podem ser expressas em 90 min, pronta para a purificação e aplicações a jusante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

A malária causa de morbidade e mortalidade mundial significativa. Nenhuma vacina de rotina está disponível no momento. Uma das principais razões para a falta de uma vacina é o desafio de identificar candidatos a vacinas adequadas. Proteínas malária expresso utilizando sistemas procariotas e eucariotas de expressão baseados em células são mal glicosilada, geralmente insolúveis e passam por dobragem inadequada levando a imunogenicidade reduzida. Os sistemas de expressão livres de gérmen de trigo, lisado de reticulócitos de coelho e lisado de células de Escherichia coli são actualmente utilizados para a expressão de proteínas da malária. No entanto, o período de tempo e a expressão inadequada de glicosilação de proteínas continua a ser um desafio. Nós demonstramos a expressão de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando células HeLa sistemas baseados livre expressão, denominados &quot;in vitro de células livre sistemas de expressão humanos&quot;. Os sistemas de expressão isentos de células HeLa baseado 2 transcrever o ARNm em 75 min e 3 ul de transcribed ARNm é suficiente para traduzir proteínas em 90 min. O sistema de expressão de um-passo é uma transcrição e tradução acoplado sistema de expressão; a transcrição e tradução de co-ocorre em 3 h. O processo também pode ser estendido durante 6 horas, fornecendo energia adicional. No sistema de expressão de 2 passos, o ARNm é transcrita em primeiro lugar e, em seguida, adicionados à mistura de tradução para a expressão da proteína. Nós descrevemos como expressar proteínas de malária; um hidrofóbico Cleft de PF3D7_0114100 Maurer - 2 proteína transmembranar (CGFP-2TM), uma proteína PF3D7_0925900 hidrófilo e um tatu repetições contendo proteína PF3D7_1361800, utilizando o sistema de livre expressão de células HeLa base. As proteínas são expressas em micro volumes empregando 2-passo e um passo-estratégias de expressão. Um método de purificação por afinidade para purificar a 25 ul de proteínas expressas utilizando o sistema isento de células humanas de expressão in vitro é também descrito. Rendimento de proteína é determinada pelo ensaio de Bradford e a expressoe proteínas purificadas pode ser confirmada por análise de transferência de western. Proteínas recombinantes expressas podem ser utilizados para a vacinação, imunoensaios e sequenciação de proteínas.

Validação das proteínas recombinantes expressas através de reactividade com anticorpos específicos é um primeiro passo importante para confirmar a dobragem correcta das proteínas expressas. Proteínas da malária recombinantes foram expressos utilizando o passo e de dois passos em sistemas de expressão isentos de células humanas in vitro. As proteínas recombinantes são o método de afinidade de Ni-quelante purificada. Em seguida, usamos anti-soros contra roptrias inteiras merozoite em transferência Western d...

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HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expressão de proteínas da malária em sistemas baseados em células permanece um desafio. Nós demonstramos dois sistemas de célula livre expressão de passo e um passo IVT (em tradução vitro) para expressar proteínas recombinantes rhoptry malária a partir de células HeLa. Nós usamos um sistema de purificação baseado afinidade Ni-resina para purificar as proteínas rhoptry.

Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K visualizações.  Cleveland State University.  Expressão de proteínas da malária em sistemas baseados em células permanece um desafio. Nós demonstramos dois sistemas de célula livre expressão de passo e um passo IVT (em tradução vitro) para expressar proteínas recombinantes rhoptry malária a partir de células HeLa. Nós usamos um sistema de purificação baseado afinidade Ni-resina para purificar as proteínas rhoptry. 

Vídeo: HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolos para implementação de uma<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...