O trabalho foi financiado pelo R01 DC 011.582 (AK) e RO1 DC011555 (DJT).

<ol><li> Puxe eletrodos de vidro Puxe eletrodos de vidro <ol><li> Puxar eléctrodo único barril. Use vidro único barril capilar com filamento e puxar a ponta para um diâmetro de cerca de 1-2 micrómetros, comprimento do eixo de 10-12 mm, e resistência do eléctrodo correspondente de cerca de 12 MOhm (variação 5-20 MOhms) conforme medido em 0,9% de solução de NaCl. Resistências eletrodo inferior resultaria em atividade mais fundo e, portanto, mais dificuldade em isolar a atividade unitária de neurônios individuais. Para empurrar este eletrodo, usar um horizontal ou vertical com um puxador de filamentos de aquecimento ou serpentinas de aquecimento. </li><li> Puxar eléctrodo multibarrel. Devido ao diâmetro muito maior do vidro multibarrel e a necessidade de uma distribuição uniforme do calor em torno do multibarrel inteiro, um extractor poderoso com uma bobina maior diâmetro de aquecimento, não um filamento de aquecimento, se necessário. Uma pipeta multibarrel tem de ser introduzido no centro do filamento de aquecimento com no contacto com a serpentina de aquecimento. Note-se que, além das pipetas de 5 barril descrito aqui, pipetas 3 barril ou 7 barril são alternativas disponíveis comercialmente. Puxar de vidro até uma ponta de pipeta de cerca de 10 micrómetros de diâmetro total, ou menos. A ponta vai ser quebrado para o diâmetro correcto no passo seguinte, de modo que o tamanho exacto da ponta é menos crítico durante o processo de puxar do que a forma geral da ponta do eléctrodo, o qual deve ser longa e relativamente fino. Referem-se a imagem na Figura 1C para a forma desejada do eléctrodo ponta. Formas de eléctrodos curtos e grossos (Figura 1B) fará com que uma quantidade substancial de danos nos tecidos quando avança para dentro do cérebro, enquanto as formas de eléctrodo muito longos e finos (Figura 1A), irá dobrar e assim torná-la difícil de quebrar a extremidade do eléctrodo para a correcta diâmetro (ver passo 2). </li></ol></li><li> Modificar Dicas Eletrodo Modificar pontas dos eletrodos. Antes que os dois eléctrodos podem ser coladas umas às outras, Eles têm de ser modificados. O eixo do eléctrodo único necessita de ser dobrado antes de ser ligado ao multibarrel para garantir que o eixo do conjunto do eléctrodo piggy-back acabado é o mais fino possível. Além disso, a ponta do eléctrodo multibarrel tem de ser interrompida, a fim de assegurar a resistência baixa para iontoforese. <ol><li> Dobre eixo de um eletrodo único barril por cerca de 20 graus. Use a chama menor bico de Bunsen possível. Típicas &quot;pequenos&quot; bicos de Bunsen de empresas de fornecimento padrão de laboratório criar tamanhos de chama que são grandes demais para esta aplicação. Para contornar este problema utilizar o queimador de Bunsen menor comercial e fixar uma agulha de seringa (calibre 18 ~) para o topo do queimador, e selar a ligação com cimento dental. Quando em funcionamento, a chama deve ser difícil de ver, de cerca de 5 mm ou menos de diâmetro, e cerca de 8 mm de altura. Qualquer movimento do ar na sala se apaga a chama, por isso é uma boa idéia para operar o gravador em umsala fechada, ou para utilizar escudos de vento. Mova o eletrodo único barril através da chama para dobrá-lo por cerca de 20 graus. Ter em vista que a chama do queimador de fusão do vidro para a zona de transição a cerca de 10 milímetros de distância entre a ponta do eléctrodo. Para evitar a fusão da extremidade do eléctrodo que sugerem que o eléctrodo ser mantida a cerca de 45 graus, a ponta voltada para baixo, e mover-se do eléctrodo através da chama de forma relativamente rápida. </li><li> Quebre a ponta do eletrodo multibarrel. Para garantir o controle visual ao quebrar a ponta do eletrodo, use um microscópio com um objectivo mínimo de 10x e 10x oculares. A escala de medida inserida no ocular também serão necessários para medir tamanhos de ponta. Anexar um pedaço de plexiglass para o microscópio de modo que a extremidade do plexiglass pode ser visto em cerca de um terço a um meio do campo de visão do microscópio. No nosso caso, a peça de plexiglass é cerca de 25 x 70 mm e 5 mm de espessura e ligada por meio de um parafuso que pode ser fixada em um personalizadofeito fio em platina do microscópio. É importante ter um design que permite que o plexiglass mover independentemente da corrediça. Coloque o eletrodo multibarrel em uma cama de massa de modelar sobre uma lâmina de vidro, e inserir o slide contendo o eletrodo no suporte do microscópio do slide. Usando manipuladores do microscópio de xy, mova suavemente a ponta do eletrodo contra a peça de acrílico, e observar a quebra da ponta através das oculares do microscópio. Tentativa de limpa quebrar a ponta multibarrel para um diâmetro acumulado de cerca de 25-35 micrômetros. Descarte pipetas com diâmetros de ponta que se desprenderam muito grande, ou dicas com intervalos irregulares. Nós descartar aproximadamente 30% dos eléctrodos devido às nossas multibarrel pontas de formas indesejáveis. </li></ol></li><li> Montar Piggy back-eletrodo Montar piggy-back eletrodo. <ol><li> Eléctrodos de posição. Remover pedaço plexiglass usado no passo 2.2 a partir de platina do microscópio. Fixe concluídamultibarrel eletrodo em massa de modelar sobre uma lâmina de vidro, a ponta apontando ligeiramente para cima. Apontando para cima, será importante para o passo 3.2, a colagem dos dois eléctrodos. Dicas que apontam-se fazer com que a cola para fugir da ponta, evitando a colagem das pontas dos eletrodos. Insira dobrado eléctrodo único barril em suporte de eléctrodo do micromanipulador feitos (Figura 2). Usando orientação visual em primeiro lugar e então a orientação de microscópica, abaixe o eletrodo único barril para o eletrodo multibarrel. O único eléctrodo deve ser reduzido directamente para dentro da ranhura que é formada pela disposição das 5 barris, com a sua ponta a ponta saliente da ponta multibarrel por cerca de 5-10 micrómetros. Ao abaixar o tambor único, observar de perto o ângulo que é formado entre os dois eléctrodos. Para obter o melhor resultado evitar quaisquer ângulos em que as pontas apontam afastados uns dos outros, mas sim tentar diminuir o único eléctrodo para o multi perfeitamente paralelos, ou mesmo com a sua pontatocando o multibarrel primeira, formando um arranjo muito ligeiro &quot;cunha&quot;. Uma vez que a ponta do tambor só é muito flexível, que se curva quando o único eléctrodo é abaixado um pouco mais após a ponta ter atingido a superfície de topo do eléctrodo de barril múltiplas, formando uma ponta limpa composto que tem uma quantidade pequena de acção de mola embutido que ajuda a manter as pontas juntas. No entanto, se o ângulo entre o tambor e único eléctrodo multibarrel é demasiado íngreme (muito de uma cunha), a acção de mola vai ser muito alta e dobrar para baixo o arranjo de eléctrodo. </li><li> Eixos cola eletrodos juntos. Cole as hastes dos dois eletrodos em conjunto usando cianoacrilato (super cola). Coloque uma pequena gota de cola para o lado pequeno de um palito plano e conjunto de eléctrodos de contato com a gota de cola. Comece na posição mais distal das dicas e mova lentamente palito com queda de cola ao longo eixos de eletrodos para as pontas dos eletrodos. Usando cola demais, ou a aplicação de cola too perto das pontas de eléctrodos irá resultar na colagem das aberturas dos eléctrodos, tornando o eléctrodo pelo menos parcialmente funcional. </li><li> Estabilizar conjunto com cimento dental. Misture uma pequena quantidade de cimento dentário e acrílico dental em um prato de plástico descartável pequeno barco ou pesar, utilizando um palito plana. Espere até que o cimento se torna moldável e se aplica uma pequena quantidade para a junção entre os dois eléctrodos para estabilizar a articulação (material-de-rosa na Figura 3). Permitir que cerca de 15 minutos para secar. </li><li> Retire e guarde eletrodo. Retire cuidadosamente o eletrodo concluída piggy-back a partir do primeiro titular micromanipulador, e depois separar da lâmina de vidro, e guarde em um recipiente à prova de poeira. </li></ol></li><li> Preparar soluções Eletrodo de preenchimento Preparar soluções eléctrodo de enchimento. Uma vez que a iontoforese requer moléculas carregadas, a maioria dos agentes têm de ser dissolvidos ou em um meio ácido ou alcalino (tipicamente umta pH de cerca de 3-4, ou um pH de cerca de 8-10, respectivamente). Um certo número de produtos químicos que são usados ​​frequentemente em iontoforese são listados na Tabela 1. No caso dos agentes que não estão listados na tabela, determinar a partir do valor de pKa, se seria mais fácil de utilizar a molécula de ácido ou em um ambiente alcalino para manter a molécula carregada, e dissolvem-se em conformidade. Para melhores resultados, misture todas as soluções diariamente. </li><li> Preencha e Preparar Eletrodos Preencher e preparar eletrodos. Pouco antes, usando o eletrodo, de volta a encher cada barril com seu respectivo medicamento, usando fibra de carbono 28-34 agulhas de calibre ligados a seringas com filtros de seringa. Encha as quatro barris exteriores da configuração 5-barril com os fármacos de eleição, e o centro do tambor com NaCl 3M como um tambor de equilíbrio. Preencha o eletrodo de registro único barril com NaCl 3M também. Adicionando um corante para a solução de NaCl, tal como o vermelho ou verde fenol rápido irá tornar mais fácil visualizar a ponta do eléctrododurante a colocação do eléctrodo sobre a superfície do cérebro. Insira o eletrodo no porta-eletrodo da configuração de gravação e inserir todos os fios para os barris de vidro apropriados. Use fio isolado de prata a partir da qual cerca de 1 cm de isolamento foi removida na ponta. Não deve ser de 5 fios para o eléctrodo multibarrel (4 barris de drogas e um tambor de equilíbrio), mais o fio amplificador que necessita de ser inserido no eléctrodo barril de gravação única. </li><li> Ligue módulos de bomba Iontoforese Ligue módulos de bomba de iontoforese e testar todos os barris. A função de teste de eletrodo de cada módulo da bomba irá ajudar a determinar se o barril do eletrodo é funcional. Para prevenir fugas da droga a partir dos tambores quando não está em uso, uma tensão de retenção na polaridade oposta à carga molécula tem de ser aplicada. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos uma técnica que permite a manipulação de um único neurônio microcircuito do in vivo, enquanto que, ao mesmo tempo que permite a gravação de respostas do neurônio durante a manipulação experimental. Circuitos neurais são manipulados através da aplicação iontophoretical sinápticos dos agonistas e antagonistas. A principal vantagem da iontoforese sobre pressão de ejecção é a de que a iontoforese não exige o movimento físico do fluido a partir do eléctrodo no tecido neural, e assim não há nenhuma preocupação de provocar danos nos tecidos por meio da pressão aplicada ou o volume de líquido. A principal limitação desta técnica é a falta de informação sobre a concentração de droga absoluta no tecido, e o volume de tecido afectado. No entanto, uma vez que as quantidades de agentes farmacológicos ejectadas com iontoforese são muito menores e muito mais controlável do que com precisão a pressão de ejecção, a recuperação a partir da aplicação da droga é tipicamente muito mais rapidamente umd muito mais completo. Microiontophoresis tem sido usado com sucesso em vários sistemas neuronais sensoriais, e outros, e é aplicada com êxito em mais áreas do cérebro, com pouco ou nenhum processamento intrínseca. A razão é que uma parte do agente farmacológico ejectado pode difundir a partir do local de aplicação para um neurónio vizinho e também manipular as propriedades de resposta dos neurónios vizinhos. O fabrico separado de eléctrodos de tambor simples ou múltipla permite a combinação de eléctrodos com propriedades arbitrárias e não relacionados. Puxando barris de eléctrodos em conjunto e utilizando alguns para gravação e alguns para fins de iontoforese deve produzir pontas de eléctrodos com propriedades muito semelhantes, de tal modo que as pontas de eléctrodos ou seria demasiado grande para gravação única célula, ou demasiado pequena para a aplicação do fármaco. Além disso, ter a ponta único barril estender para além das pontas de eletrodos multibarrel por cerca de 20 micrômetros reduz o ruído nas gravações, umd elimina possíveis efeitos de confusão atual das correntes de retenção ou ejeção de disparo do neurônio 3. Piggy-back multibarrel eléctrodos tenham sido previamente descrito com mais de 30 anos atrás, 4-6 e têm sido utilizados com muito sucesso para dissecar circuitos neurais 7-18 19-29. Assim, o método por si só não é nova ou original. No entanto, os detalhes particulares da preparação e utilização do eléctrodo ter sido modificado ao longo dos anos, e o conjunto de instruções descritas aqui tem provado ser especialmente fácil e bem sucedida, e não foi publicado em detalhe noutro local na literatura. Particularmente, a flexão da ponta do tambor único eléctrodo permite que a ponta final do eléctrodo piggy-back a ser relativamente fino (Figura 3) e, portanto, permite a gravação de núcleos profundos com danos mínimos para o cérebro, o saliente do tambor único eletrodos sobre o eletrodo multi-barril remove praticamente todas as moedast efeitos, que eram muitas vezes citada como uma desvantagem da técnica 3. Novos detalhes aqui apresentados como tendo a extremidade do eléctrodo que aponta para cima durante o processo de colagem e de repouso do cilindro único na ranhura do eléctrodo multibarrel irá garantir uma elevada taxa de sucesso na produção de eléctrodos piggy-back. A técnica é relativamente fácil e geralmente pode ser dominado por um novato dentro de alguns dias.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do item </td><td> Fabricante </td><td> Comentário </td><td> Gato. # </td></tr><tr><td> Bico de Bunsen </td><td></td><td> Disponível em: VWR </td><td> 17928-027 </td></tr><tr><td> Dois componentes do cimento dental: &quot;Cold cura&quot; material odontológico </td><td> Co-oral-ite Dental Mfg Co </td><td> Disponível em: AM Systems, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> Dois componentes do cimento dental: Prótese de material composto líquido de reticulação </td><td> Co-oral-ite Dental Mfg Co </td><td> Disponível em: AM Systems, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> Cola líquida </td><td> Henkel </td><td> Disponível em: Loctite Super Cola </td><td> 01-06849 </td></tr><tr><td> Micro iontoforese-Unele: Neurophore BH-2 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Disponível a partir de: Harvard Apparatus </td><td> 65-0200 e 65-0203 </td></tr><tr><td> Fio de prata isolados </td><td> AM-Systems </td><td> Disponível em: AM-Systems </td><td> 785500 </td></tr><tr><td> Extrator Horizontal </td><td> Zeitz DMZ-Universal Extrator </td><td> Disponível em: AutoMate Científico </td><td> NA </td></tr><tr><td> Micro-Manipulador peças: suporte do eletrodo </td><td> WPI </td><td> Disponível em: WPI </td><td> M3301EH </td></tr><tr><td> Micro-Manipulador peças: estágio linear </td><td> Série 423 Newport </td><td> Disponível em: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micro-Manipulador peças: fase de rotação </td><td> Newport RSP-2 </td><td> Disponível em:Newport </td><td> RSP-2 </td></tr><tr><td> Micro-Manipulador peças: tradução z </td><td> Série 433 Newport </td><td> Disponível em: Newport </td><td> 433 </td></tr><tr><td> Micro-Manipulador peças: suporte de ângulo de 90 ° para montar e z xy eixo </td><td> Newport 360-90 </td><td> Disponível em: Newport </td><td> 360-90 </td></tr><tr><td> Micro-Manipulador peças: x tradução / linear fase </td><td> Série 423 Newport </td><td> Disponível em: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micro-Manipulador peças: y tradução / linear fase </td><td> Newport 423 </td><td> Disponível em: Série Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Leitz Laborlux 11 </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> Microscópio: objetivo </td><td> Leitz Wetzlar 10x, NA 0,25 </td><td></td><td> 519760 </td></tr><tr><td> Microscópio: eypieces </td><td> Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 </td><td></td><td> 519748 </td></tr><tr><td> Microscópio: estágio </td><td> Leitz Wetzlar </td><td></td><td> 513544 </td></tr><tr><td> Multibarrel capilar </td><td> N / A </td><td> Disponível em: AM Systems, Inc </td><td> 612000 </td></tr><tr><td> Sinlge barril capilar (GC 150F-10) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Disponível a partir de: Harvard Apparatus </td><td> 30-0057 </td></tr><tr><td> Puxador vertical </td><td> Narishige modelo PE-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Personalizados elementos feitos do manipulador Micro-(marcado luz blue na Figura 1) </td><td></td></tr><tr><td> chapa de aço </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> base de inclinação </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> acessório para suporte do eletrodo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Tabela 2. Fabricantes e números de itens de todos os equipamentos e materiais utilizados no procedimento. </td><td></td></tr></tbody></table>

manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses

Em gravações in vivo de neurónios individuais permitem que um investigador para examinar as propriedades de queima de neurônios, por exemplo, em resposta a estímulos sensoriais. Neurônios normalmente recebem várias excitatórios e inibitórios entradas aferentes e / ou eferentes que se integram com o outro, e as finais propriedades de resposta medidos do neurônio são conduzidos pelas integrações neurais desses insumos. Para estudar o processamento da informação nos sistemas neural, é necessário compreender as várias entradas de um neurónio ou sistema neural, e as propriedades específicas destas entradas. Um método poderoso e tecnicamente relativamente simples para avaliar o papel funcional de determinados insumos que um neurônio dado está recebendo é dinâmica e reversível suprimir ou eliminar estas entradas, e medir as mudanças na saída do neurônio causados ​​por essa manipulação. Isto pode ser conseguido por alteração farmacologicamente ambiente imediato do neurônio com piggy-back multibarrel electrodes. Estes eletrodos consistem de um eletrodo único barril de gravação e um eletrodo de drogas multibarrel que pode transportar até quatro diferentes agonistas ou antagonistas sinápticas. Os agentes farmacológicos pode ser aplicada por iontoforese, por vezes, desejados durante a experiência, permitindo tempo de entrega controlada e reconfiguração reversível das entradas sinápticas. Como manipulação, como farmacológica do microambiente representa um método poderoso e incomparável para testar hipóteses específicas sobre a função do circuito neural. Aqui nós descrevemos como piggy-back eletrodos são fabricados, e como eles são utilizados durante experimentos in vivo. O sistema piggy-back permite que um investigador para combinar um eletrodo de registro único barril de qualquer propriedade arbitrária (resistência, tamanho da ponta etc, forma) com um eletrodo de drogas multibarrel. Esta é uma vantagem importante sobre os padrões de multi-eléctrodos, onde todos os barris têm mais ou menos as formas e propriedades semelhantes. Multibarrel electrodes foram introduzidos mais de 40 anos 1-3, e foram submetidos a uma série de melhorias no projeto 2,3 até o tipo piggy-back foi introduzido na década de 1980 4,5. Apresentamos aqui um conjunto de melhorias importantes na produção laboratorial de piggy-back eléctrodos que permitem a penetração profunda do cérebro intacto em preparações em animais in vivo, devido a um eixo de eléctrodo relativamente finas que causa o mínimo de danos. Além disso, estes eléctrodos são caracterizadas por as gravações de baixo ruído, e têm de barris de baixa resistência com drogas para iontoforese muito eficaz dos agentes farmacológicos desejados.

Neste experimento, o receptor de glicina hidrocloreto de estricnina antagonista foi iontoforeticamente aplicado. Bloqueio de inibição glicinérgica normalmente aumenta atirando nos neurônios. Figura 4 mostra dados de exemplo de um neurônio auditivo cujas respostas a estímulos sonoros sinusoidais de intensidade crescente entregue aos ouvidos do animal foram registrados. Este tipo de um experimento é referido como o neurónio de descarga função intensidade taxa vs. Sons mais altos resultaram em maiores taxas de Spike (curva preta). O atual iontoforese inicial utilizado durante este experimento foi de 15 nA. Depois que o atual foi ligado e as mudanças na função de intensidade taxa se estabilizou em seu nível novo (curva azul escuro), a corrente de ejeção foi progressivamente aumentada para 30, 45 e 60 nA (laranja, verde e luz curvas azuis, respectivamente). Em cada caso, as respostas do neurónio sobre a mesma gama de intensidades sonoras foram registados após as mudanças na discharge taxa intensidade funções em resposta à corrente de ejecção novo tinha estabilizado. A ejeção mais apropriado atual para usar neste exemplo foi de 45 a 60 nd nd porque esses níveis de corrente já não alterar de forma diferente as respostas do neurônio. Este resultado sugere que a 45 nA de corrente, todos os receptores de glicina de que neurónio já havia sido bloqueada por cloridrato de estricnina. Qualquer aumento adicional da ejeção estricnina atual e liberando ainda mais não resultou em uma mudança mais do neurônio descarga função taxa nível. Após a conclusão do protocolo, a corrente de ejeção foi desligado. A recuperação das respostas neurais de volta à linha de base foi obtida após cerca de 25 minutos (linha vermelha). Isso pode levar, dependendo do tipo e da quantidade de fármaco ejectado, entre alguns segundos e várias dezenas de minutos. <table border="1"><tbody><tr><td> Droga </td><td> Concentração </td><td> pH de uma solução </td><td> Solvente </td><td> Companhia </td><td> Gato. # </td><td> Retenção típico atual </td><td> Correntes típicas de ejeção </td></tr><tr><td> GABA </td><td> 500 mM </td><td> 3,5-4,0 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> A-2129 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a 100 nA </td></tr><tr><td> Glicina </td><td> 100 mM </td><td> 3,5-4,0 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> G-7126 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a 100 nA </td></tr><tr><td> Metiliodeto bicuculina </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M de NaCl em dH2O </td><td> Sigma </td><td> B-6889 </td><td> -15 NA </td><td> NA 5 a 60 nA </td></tr><tr><td> Cloridrato de estricnina </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M de NaCl em dH2O </td><td> Sigma </td><td> S-8753 </td><td> -15 NA </td><td> NA 5 a 80 nA </td></tr><tr><td> Ácido L-glutâmico </td><td> 500 mM </td><td> 8 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> G-1251 </td><td> 30 nA </td><td> -10 A -150 nA nA </td></tr><tr><td> Ácido L-aspártico </td><td> 500 mM </td><td> 8 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> A-8949 </td><td> 30 nA </td><td> -10 A -150 nA nA </td></tr><tr><td> Ácido caínico </td><td> 1 mM </td><td> 9 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> K-0250 </td><td> 30 nA </td><td> -10nA a -100 nA </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Medicamentos comumente usados, com pH de dissolução e concentração. A tabela lista os agonistas mais utilizados sinápticas e antagonistas utilizados com iontoforese. O ambiente de pH listados contas para a necessidade de polarizar t<html> agentes stas, e as contas de concentração sugeridas para a variabilidade na eficácia entre diferentes medicamentos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" /> Figura 1. Três multibarrel pipetas com comprimentos diferentes de ponta A: A ponta. Deste eletrodo 5 barril foi puxado muito longo e fino. Note-se que a ponta é dobrada e muito macio. Este tipo de ponta é muito difícil de quebrar para o diâmetro desejado. B: A ponta do eletrodo é muito curto e atarracado. Quando avançou para zonas mais profundas do cérebro, este eléctrodo irá causar danos cerebrais desnecessário devido ao fato de que o eléctrodo se torna relativamente espessa apenas alguns milímetros depois da ponta. C: Um exemplo de um eléctrodo com uma ponta correctamente puxado. Apesar de ser longo e fino, a dica é ainda firme e pode ser facilmente quebrado com o diâmetro da ponta desejado. gura 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Desenho de montagem manipulador eletrodo. Manipulador O conjunto é utilizado em conjunto com um microscópio para montar os eletrodos piggy-back. Os itens marcados a cinzento são produtos comercialmente disponíveis e estão listados na Tabela 2. Itens marcados em azul foram personalizados usinado na loja da nossa instituição máquina. Elas são: 1) 1/4 de polegada em aço da placa de tamanho 43x26 centímetros com furos para a etapa 423 Newport perfurado em la de acordo com o padrão de furos proporcionado por Newport, 2) uma fase de inclinação que permite uma inclinação do conjunto em ângulos arbitrários, 3) um conector que monta o suporte do eletrodo para o estágio superior de translação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" /> Figura 3. Foto de uma amostra de eletrodo piggy-back. Um eletrodo de 5 barril acabado reunidos com um único barril de gravação electrode. Observe eixo longo de cerca de 7 mm para permitir que uma gravação profundas do cérebro. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" /> Figura 4. Titulação de correntes de ejeção. O gráfico mostra taxa de intensidade registrados funções de um neurônio auditivo único, orelhas do animal foram estimuladas com tons de várias intensidades. Sons mais altos tendem a provocar maiores taxas de queima. Antes da aplicação da droga, a função do neurônio taxa de intensidade apresentou as menores taxas de Spike (curva preta). Correntes de ejeção progressivamente maiores receptores bloqueado progressivamente mais glicina no neurônio, resultando em taxas de queima progressivamente maiores. A ejeção ideal atual neste neurônio era 45-60 nA. Com estas correntes de ejecção, o bloqueio completo de todos os receptores do neurônio glicina foi obtida. Após a conclusão do protocolo experimental, a iontoforese foi terminada e o neurónio foi permitidorecuperar. A recuperação completa foi alcançada quando a recuperação função taxa de intensidade correspondente a função inicial de recuperação pré-droga. Reproduzido com permissão da American Physiological Society, de Klug et al, 1995.

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Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

A iontoforese de agonistas e antagonistas neurais durante extracelular<em&gt; In vivo</em&gt; Gravações é uma maneira poderosa de manipular microambiente de um neurônio. Essas manipulações podem facilmente ser feito através de piggy-back multibarrel eletrodos. Aqui descrevemos como fabricá-los e usá-los durante as gravações auditivas.

Fabricação e utilização Piggy-back Multibarrel Eletrodos para<em&gt; Em vivo</em&gt; As manipulações farmacológicas de respostas neurais

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

manufacturing-using-piggy-back-multibarrel-electrodes-for-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

10.4K visualizações.  University of Colorado Medical Campus. A iontoforese de agonistas e antagonistas neurais durante extracelular In vivo Gravações é uma maneira poderosa de manipular microambiente de um neurônio. Essas manipulações podem facilmente ser feito através de piggy-back multibarrel eletrodos. Aqui descrevemos como fabricá-los e usá-los durante as gravações auditivas.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Neurociência

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Combinando Behavioral Endocrinologia e Economia Experimental: Decisão da testosterona e Social Fazendo

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Implante cirúrgico de crônicas Eletrodos Neurais para registrar a atividade única Unidade e Sinais eletrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparação de um mouse Awake para gravar as respostas neurais e injetando Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

Um Método para Sistemática de Eletroquímica e eletrofisiológica Avaliação do Neurais gravação Eletrodos

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Fabricação e utilização Piggy-back Multibarrel Eletrodos para

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