Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Médica e da Marie-Curie Internacional Reintegração esquema Grant (para JKV).

1. Escolhendo clones de expressão de cDNA <ol><li> A biblioteca de ADNc é proporcionado como único clones bacterianos em estoques de glicerol num formato de 96 poços. Usando o comando rearray no menu do seletor do CP7200 Norgen, escolher clones de bactérias da placa de fonte e inocular em 1,5 ml LB / amp em um 96-deepwell (1 ml bem) prato. </li><li> Selar as placas Deepwell com uma vedação estanque ao gás-permeáveis ​​e incubar durante a noite a 37 ° C num agitador. </li></ol> 2. Preparação de biblioteca de expressão de cDNA <ol><li> Rodar as placas Deepwell contendo as bactérias a 2.000 rpm durante 20 minutos utilizando adaptadores de placa, numa centrífuga de topo de mesa. </li><li> Aspirar media dos poços, deixando intacto o sedimento bacteriano. </li><li> Configurar o pavimento da estação de trabalho de automatização do laboratório, como mostrado na Figura 2. As soluções para a preparação de plasmídeo são distribuídos em calhas 1-5 e a placa deepwell é colocado no convés. A calha de múltiplas cavidades com uma solução de eluiçãoé colocado adjacente à placa deepwell. Dicas são carregados para as prateleiras da ponta. </li><li> Montar o distribuidor de vácuo. A placa de ligação do plasmídeo é colocado dentro do tubo de distribuição e a placa de filtro de plasmídeo é colocado no topo do colector. </li><li> Ressuspender pelotas com 250 ul Solução 1 (tampão de ressuspensão) pipetando para cima e para baixo. </li><li> Lisar as bactérias, por adição de 250 ul de solução de 2 (tampão de lise). A placa é selada e invertido para permitir a mistura completa. </li><li> Iniciar temporizador 2 min. </li><li> Adicionar 350 ul de solução de 3 (tampão de neutralização). Selar a placa e inverta 3 vezes. </li><li> Transfira os lisados ​​bacterianos para as placas de filtro de plasmídeos. </li><li> Aplicar vácuo durante 5 minutos. </li><li> Remova a placa do filtro e colocar a placa de ligação na parte superior do colector. Aplicar vácuo durante 1 min. </li><li> Adicionar 500 ul de lavagem adicional (AW) buffer. </li><li> Aplicar vácuo durante 2 min. </li><li> Adicionar 900 uL de solução tampão de lavagem 4. Aplicar vácuo durante 2 min. </li><li> Repita step 2,14. Aplicar vácuo durante mais 15 min. </li><li> Coloque placa ADN coleção dentro do coletor. Adicionar 100 ul de tampão de eluição para a placa de ligação e incubados durante 2 min. </li><li> Vácuo durante 10 min. </li><li> Retire a placa de recolha e concentração de DNA medida usando o 8000 Nanodrop. Tipicamente um rendimento de ~ 100 ng / uL pode ser esperado com este método. </li></ol> 3. Sementeira celular <ol><li> As células HEK293 foram tratadas com tripsina e contadas. </li><li> 2 x 10 4 células são distribuídas em cada poço de uma Viewplate PerkinElmer usando o ThermoFisher 96 poços multidrop. </li><li> As células são incubadas durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 4. Transfecção <ol><li> Prepara-se uma mistura de 100 ng de DNA plasmídico GFP-Grb2 com 100 ng de cDNA em 25 meio sem soro ul por poço de fundo redondo de uma placa de 96 poços. </li><li> Adicionar 25 ul de meio isento de soro contendo 0,5 Transfectin uL por poço. </li><li> Misture e iniciar o temporizador for 30 min. </li><li> Transferir 50 uL de ADNc / Transfectin mistura para as células usando um método de distribuição suave. Alternativamente, a mistura de transfecção pode ser dispensada primeiro em placas e, em seguida, as células adicionadas no topo (transfecção reversa). </li><li> Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 5. Aquisição de Imagem <ol><li> Inicie o software Opera. Um instantâneo da tela da configuração da experiência é mostrado na Figura 3. Selecione a opção &quot;Configuração&quot; e selecione 20x objetivo eo tipo de placa correta. Garantir a &quot;colar&quot; está definido para o valor correto no objetivo de permitir a focagem com tipos de chapas diferentes. </li><li> Selecione a opção &quot;Microscópio&quot; guia. Definir uma exposição como FITC (488 laser) e exposição de 2 como de UV (365 laser). Ativar o filtro UV em ambas as exposições e atribuir a exposição de 1 a 1 câmera e exposição de 2 a câmera de 2. Definir os tempos de exposição a 800 mseg de exposição 1 e 40 ms para exposição 2. </li><li> Selecione a opção &quot;Microscópio&quot; guia. Definir eXposure 1 como FITC (488 laser) e exposição de 2 como de UV (365 laser). Ativar o filtro UV em ambas as exposições e atribuir a exposição de 1 a 1 câmera e exposição de 2 a câmera de 2. Definir os tempos de exposição a 800 mseg de exposição 1 e 40 ms para exposição 2. </li><li> Selecione uma exposição. Definir o foco altura para 0 ^ m. Selecione &quot;Focus&quot;. Uma vez focado, expor câmera 1. Ajuste a altura de foco para otimizar o plano de exposição e clique em &quot;altura Take&quot;. Alterar os tempos de exposição e potência do laser para dar uma intensidade máxima de pixels de ~ 3.000. Salve parâmetros de exposição. Repita o procedimento para a exposição 2. </li><li> Selecione &quot;Experimento Definição&quot; guia. Criar layout e sublayout. Arraste e solte o relevante layout, exposição, referência de imagem de arquivo skewcrop, e sublayout. Salve experimento. </li><li> Selecione &quot;Automatic Experiment&quot; guia e adquirir imagens. </li></ol> 6. Análise de Imagem (Baseado em ImageJ versão 1.46h.) <ol><li> Converter a PerkinElmer proprietário. Arquivos flex para formato TIF. Tif usando oFlex2Volocity roteiro Acapella. </li><li><ol><li> Importar imagens em ImageJ como uma sequência de imagens, o que resulta em uma pilha. </li><li> Converter a pilha em um canal de 2 hyperstack selecionando a imagem / Hyperstack / Pilha para Hyperstack item de menu. O número de fatias deve ser definido como a metade da pilha importado. </li><li> Duplicar o canal GFP usando a imagem / comando Duplicar: assinalar a opção Duplicate hyperstack e especificar Canais: 1-1. A partir de agora usar a pilha duplicado. </li></ol></li><li> Selecione Processo / melhorar o contraste com 0,01% de pixels saturados, usando histograma pilha e converter para 8 bits com Image/Type/8-bit. </li><li> Definir um raio de 15 pixels segmentação locais adaptativo usando o algoritmo Bernsen com limiar de contraste (parâmetro 1) q = 30. Marque os objetos brancos na caixa fundo preto no menu Limiar da Imagem / Ajuste Auto / Local. </li><li> Controle de qualidade de Segmentação: gerar sobreposição de contorno segmentado objeto nas imagens originais. </li><li> Feature extração por meio da análise de partículas: área de medição, a média ea intensidade total de cada organela. Salve arquivos de resultado. </li><li> Abra o arquivo de recursos resultam em R e gerar um histograma. </li></ol> 7. Resultados representativos Sob condições normais de Grb2 está localizada ao longo da célula inteira. Após a estimulação de um receptor do factor de crescimento, transloca-se para a membrana de plasma e é subsequentemente internalizados em endossomas, como mostrado na Figura 4. A expressão de um receptor na superfície da célula capazes de Grb2 de ligação é suficiente para induzir este translocação. Em uma experiência típica de triagem, nenhuma mudança na GFP-Grb2 localização é observado. No entanto, quando a proteína é expressa, que recruta Grb2 para um local sub-celular, existe uma mudança de localização, que podem ser facilmente visualizadas por microscopia de fluorescência. Para a expressão exemplo, os resultados de EGFR em relocalização da GFP-Grb2 para endossoma estruturas semelhantes (Figura4). Assim, quando a aplicação de uma biblioteca do genoma, pode-se esperar que as novas proteínas de ligação Grb2 de superfície celular podem ser identificadas. Este método não é limitado à detecção de proteínas da superfície celular. Por exemplo, Dynamin2 induz uma mudança na localização sub-celular de GFP-Grb2 exibindo endossoma-como o recrutamento (Figura 5). Dynamin2 se liga ao domínio SH3 C-terminal de Grb2 e está envolvida na endocitose de 9,10 neste complexo. Assim, esta abordagem permite a identificação de complexos de proteína de ligação geral e não se limita à identificação de parceiros de interacção para o domínio SH2. Vários tipos diferentes de translocação pode ser esperado como localização para a membrana plasmática, a endossomas, outras estruturas vesiculares citoplasmáticos ou para o núcleo. Portanto, recomenda-se que todas as imagens são também inspeccionados visualmente. No entanto, quando o rastreio de grandes conjuntos de cDNAs automatizadoalgoritmo de análise de imagem é mais prático. Neste caso, uma combinação de algoritmos é desejável, tais como detecção de ponto para identificar endossomas citoplasma / núcleo de detecção para identificar nucleares de vaivém e os algoritmos morfológicos geral para identificar alterações de forma celular. A utilização destes métodos de detecção diferentes fenotípicas tem sido discutida em mais pormenor noutro local 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema geral da experiência. O experimento detalhes de um fluxo de trabalho de triagem completa de alto teor de partida com a amplificação e preparação da biblioteca de cDNA, a transfecção dos vectores de ADNc de mais construções repórter, aquisição de imagem e análise de imagem utilizando o software ImageJ livre aberto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Figura 2 Configuração. Tecan do Baralho. (1) No lado da mão esquerda, de cinco calhas de 100 ml de ser cheio com um tampão (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) e A4 (100 ml). A4 calha terá de ser re-enchido uma vez durante o processo. (2) O tubo de vácuo está localizado na posição 14, neste exemplo. (3) A placa deepwell com peletes bacterianas está localizado na posição 30, ao lado da calha de tampão de eluição com 25 ml de tampão de eluição. (4) dicas descartável para a cabeça de 8 canais precisam ser carregados nos suportes de ponta no lado esquerdo e dicas para a cabeça multicanal precisam ser preenchidos na posição 40. A Tecan manipulador líquido FreedomEvo que é usado neste experimento é equipado com 500 seringas uL. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> Figura3. Automação de aquisição de imagem na LX Opera. A) Selecione a guia Configuração (1). Activar as linhas de laser necessários para a experiência (2). Selecione as câmeras para aquisição de imagem (3). Seleccione o tipo de placa e a lente objectiva para a experiência (4). B) Selecione a guia microscópio (1). Definir a fonte de luz e do tempo de exposição para a exposição de 1 (2,3). Concentre-se em um bem e ter altura (4). C) Selecione a guia Definição Experiment (1). Arraste e solte exposição, skewcrop, layout de referência, e os arquivos sublayout (2). Arraste e solte o arquivo de experiência (3). D) Selecione Experimento automática (1). Arraste e solte arquivos experimento (2). Alocar código de barras apropriado (3). Comece a aquisição da imagem, clicando no botão Iniciar (4). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; Figura 4. translocação GFP-Grb2 por expressão de cDNA. GFP-Grb2 desloca a partir de uma localização predominante citoplasmática para endossoma estruturas semelhantes sobre a superexpressão de um receptor do factor de crescimento e subsequentemente transmembranar internaliza de endossomas. À esquerda, imagens de microscopia de COS M6 células são mostrados que foram transitoriamente transfectadas com GFP-Grb2 (em cima) ou GFP-Grb2 mais EGFR (em baixo). A co-expressão do EGFR, os resultados de transferência de GFP-Grb2 para endossoma estruturas semelhantes. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplo de cDNA induzido por translocação de GFP-Grb2. O Dynamin2 GTPase, que está envolvida na endocitose mediada Grb2, recoloca-GFP para Grb2 endossoma estruturas semelhantes (círculo). Neste experimento, o GFP-Grb2 foi co-transfectado com DNM2 em células HEK293T. As células foram coradas com Hoechst 33342 após 24 horas e as imagens foram obtidas no Opera LX. Um campo de visão do canal verde (GFP) e a UV (azul; Hoechst 33342) é apresentada.

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	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A clonagem de expressão é uma ferramenta poderosa, que tem sido utilizado no passado para identificar novos componentes celulares tais como receptores de vírus e os antigénios de células do sangue 12. Aqui, nós descrevemos um método para facilitar a identificação de novos receptores de transdução de sinal putativo que se ligam a Grb2. Existem alguns passos críticos no protocolo. <ol><li> Para a preparação do plasmídeo automatizado é absolutamente essencial ter completa ressuspensão do sedimento bacteriano. Às vezes, é necessário incluir um passo rigorosa agitação ou mistura adicional com pipetas. </li><li> Após a adição da solução de 2 e 3, a mistura completa é essencial, e temos verificado que manualmente invertendo a placa selada é mais eficiente do que a utilização de um agitador automático. A pipetagem deve ser evitada a esta etapa, uma vez que iria levar a ruptura do ADN. </li><li> Em todas as etapas de vácuo, tem de se assegurar que o líquido é completamente drenadoa partir da placa. Caso contrário os rendimentos baixos devem ser esperados. </li><li> Após a eluição, é bastante comum que cai eluato forma na parte inferior da placa de ligação do plasmídeo. Essas gotas devem ser recolhidas na placa de eluição, de modo que é recomendado que a placa de ligação do plasmídeo é levantada com cuidado e as gotas residuais no fundo são cuidadosamente transferido para a placa de eluato. </li><li> Durante a transf ecção, o tempo de formação do complexo é crítica. Nós geralmente aderem a 20-30 min. Vezes maiores, de até 1 h são bem sem redução no rendimento, enquanto os tempos mais curtos não são recomendados. </li><li> Para a microscopia, a escolha de ampliação é importante. No sistema LX Opera usada aqui, a resolução a 20x é suficiente para obter imagens de alta qualidade. Se as imagens de alta resolução são necessários, o objetivo pode ser alterado, mas a fim de obter números estatisticamente significativas de células, um maior número de campos e tempos de aquisição mais elevados são necessários. Em geral, procuramosobter pelo menos 100 células fotografada por poço. </li></ol> O ensaio de translocação Grb2 tem sido utilizado por outros grupos para identificar pequenas moléculas inibidoras de EGFR activação da cinase 6. Nesse caso, o EGFR é especificamente activada com ligante causando recrutamento de Grb2 à membrana plasmática. Perturbação desta interacção pode então ser investigado utilizando compostos de moléculas pequenas. Do mesmo modo, pode ser previsto que as telas de siRNA podem ser utilizados para identificar genes endógenos envolvidos na sinalização de EGFR-Grb2 ou outros Grb2 de ligação de receptores de factores de crescimento, tais como c-KIT ou o receptor da eritropoietina. Assim, existem várias aplicações potenciais para esta técnica. Uma abordagem semelhante pode ser aplicada a sistemas de GFP-tagged repórter para moléculas adaptadoras, tais como Shc, ou Gab IRS. Uma das principais vantagens da utilização deste ensaio de células baseado em células de mamífero é que ele permite a identificação de fisiologicamente relinterações vantes. O ensaio é uma leitura para a formação do complexo de proteína, mas mais importante, as interacções relevantes são monitorizados no local sub-celular correcta. A este respeito, esta técnica supera artefactos de outros métodos de interacção proteína-proteína, tais como levedura de dois híbridos ou em ensaios in vitro. Deve notar-se, porém, que as interacções indirectas podem também resultar em recrutamento Grb2. Da mesma forma, a sobre-regulação transcricional dos parceiros de ligação pode ser induzida por expressão de cDNA. Para distinguir entre estas possibilidades, é necessário efectuar os ensaios apropriados secundárias para distinguir entre os efeitos directos e indirectos de ligação. Em conclusão, o GFP adaptador ensaio translocação molécula promete alto potencial de genoma de triagem e aplicações de descoberta de drogas.

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> biblioteca de cDNA </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB ampères + </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gás-permeáveis ​​selos </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin Kit 96 Plasmid </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.625,4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Liberdade Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Com distribuidor de vácuo </td></tr><tr><td> 384 Multidrop </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opera LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

Transdução de sinal por receptores de factores de crescimento para as células é essencial para manter a proliferação e diferenciação e requer um controlo apertado. Transdução de sinal é iniciada pela ligação de um ligando a um receptor externo de transmembrana e activação de cascatas de sinalização a jusante. Um regulador-chave da sinalização mitogénica é Grb2, uma proteína modular composto por um interior de domínio SH2 (homologia src 2) ladeado por dois domínios SH3, que não tem actividade enzimática. Grb2 é constitutivamente associada com a GTPase filho da Sevenless (SOS), através do seu N-terminal SH3 domínio. O domínio SH2 de Grb2 liga-se a receptores de factor de crescimento em resíduos de tirosina fosforilados, assim, a activação do receptor de acoplamento a SOS-Ras-MAP cascata de sinalização da cinase. Além disso, outras funções para Grb2 como um regulador positivo ou negativo de sinalização e de endocitose do receptor têm sido descritas. A composição modular de Grb2 sugere que ela pode encaixar a uma variedade de receptores e transdutorese sinaliza ao longo de uma multiplicidade de diferentes vias 1-3. Descrita aqui é um ensaio de microscopia simples que monitora o recrutamento de Grb2 à membrana plasmática. É adaptado a partir de um ensaio que mede alterações na localização sub-celular da proteína verde fluorescente (GFP) com tag Grb2 em resposta a um estímulo 4-6. Os receptores da membrana plasmática que se ligam tais como Grb2 activado Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGFR) recruta GFP-Grb2 para a membrana do plasma sobre a expressão de ADNc e, subsequentemente, deslocar-se para os compartimentos endossomais na célula. A fim de identificar em complexos de proteínas in vivo de Grb2, esta técnica pode ser usada para executar uma genome-wide screen de alto conteúdo com base em mudanças na Grb2 localização sub-celular. A preparação de clones de expressão de cDNA, de transfecção e de aquisição de imagem são descritos em detalhe abaixo. Em comparação com outros métodos genómicas utilizadas para identificar parceiros de interacção de proteínas, tais como levedura e dois hybrid, esta técnica permite a visualização dos complexos de proteínas em células de mamífero no local sub-celular de interacção através de um ensaio com base em microscopia simples. Por isso as duas características qualitativas, como padrões de localização pode ser avaliada, bem como a resistência quantitativa da interacção.

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Um método de rastreio de alto conteúdo para a identificação de novos receptores de sinalização transmembrana competentes é descrito. Este método é passível de automatização em larga escala e permite previsões sobre<em&gt; In vivo</em&gt; Proteína de ligação e a localização sub-celular de complexos de proteínas em células de mamíferos.

Um fluxo de trabalho de imagem de alta de conteúdo para estudar Grb2 Complexos de Sinalização por clonagem de expressão

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

a-high-content-imaging-workflow-to-study-grb2-signaling-complexes

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10.5K visualizações.  University College London. Um método de rastreio de alto conteúdo para a identificação de novos receptores de sinalização transmembrana competentes é descrito. Este método é passível de automatização em larga escala e permite previsões sobre In vivo Proteína de ligação e a localização sub-celular de complexos de proteínas em células de mamíferos.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologia

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...