Os autores gostariam de agradecer Elliot Bourgeois por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos subsídios R01HD059288 e R01NS069629.

1. Lesão de percussão lateral Fluido <ol><li> Anestesiar o rato, utilizando uma mistura de cetamina e xilazina administrado intraperitonealmente. Em seguida, preparar a cabeça do rato para incisão usando um matagal iodo. </li><li> Realizar uma craniotomia sobre a área parietal direita com 3 mm (diâmetro externo) trefina. </li><li> Hub agulha seguro Luer-loc (dentro mm de diâmetro 3) sobre a craniectomia usando o acrílico cyanoarylate e odontológica. </li><li> 24 horas depois, anestesiar o rato com isoflurano através de inalação. </li><li> Resumos de respiração normais uma vez, mas antes que o rato torna-se sensível ao estímulo, entregar 20 mseg pulso de solução salina no crânio através do dispositivo de percussão fluido lesão. </li><li> Imediatamente após a lesão remover o hub, reanaesthetize o mouse utilizando isoflurano, e sutura no couro cabeludo fechado. Sham operados controles receberá um procedimento idêntico ao passo 1,5 omitido. </li></ol> 2. Análise Comportamental - Resp medo condicionadoOnse <ol><li> Lidar com ratos em dois dias consecutivos anteriores à resposta de medo condicionado (CFR) de treinamento. </li><li> Coloque o rato na câmara de condicionamento por 3 min antes da administração de 1,5 choque chão mA por 2 seg. Deixar rato na câmara durante mais 30 seg. </li><li> Após o período de atraso (geralmente 24 horas), o retorno do mouse para câmara de ar por 5 min. Avaliar congelamento em intervalos de 5 seg. Análise consiste em comparar a quantidade relativa de congelamento do tempo em duas populações, no nosso caso com lesões cerebrais ratos e controle-operados controles. Menores taxas de congelamento (em comparação com o controlo) indicam a incapacidade de manter a associação entre o contexto e o choque chão, uma indicação da perda de memória e disfunções cognitivas. </li></ol> 3. Preparando agudas fatias do hipocampo * Nota: anestesiados utilizando uma redoma de vidro só pode ser implementado para os procedimentos de terminais (tais como o cérebro dissecção aqui descrito). <ol><li> 7 dias apósferimento, fazer 1 litro de fluido cerebral espinal artificial (aCSF) e 250 ml de solução de sacarose de corte. </li><li> Use gelo liberalmente para assegurar que todos os instrumentos e as soluções utilizadas durante a preparação da fatia do cérebro são gelado. </li><li> Anestesiar mouse usando isoflurano. Rapidamente e retire cuidadosamente cérebro de rato e coloque em sacarose. </li><li> Cérebro guarnição e no lugar da superfície de corte sobre uma gota de supercola na frente de um bloco de agar. </li><li> Corte 350 mm de espessura cortes coronais, você deve ser capaz de conseguir 4 ou 5 fatias com o circuito intacto hipocampo. </li><li> Incubar fatias para, pelo menos, 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 4. Gravação de potencial extracelular Campo <ol><li> Puxar eléctrodos de vidro de borossilicato para 2-5 usando MΩs puxador vertical. </li><li> Fatia lugar na câmara e eletrodo de inserção para suporte do eletrodo. </li><li> Abaixe eletrodo estimulante em fatia em um trato axonal como o caminho perfurante ou colaterais Schaffer. Eletrodo de gravação inferiorpara a posição de saída, enquanto os traços de monitorização para assegurar que os eléctrodos estão no mesmo nível de z (profundidade). Quando uma resposta máxima é alcançada, mantendo o nível de estimulação de corrente constante, os eléctrodos estão no mesmo nível de z. </li><li> O traço resultante é constituída por três componentes: o voleibol fibra pré-sináptica, o campo potencial pós-sináptico extracelular (fEPSP), e o pico de população pós-sináptica. Os componentes podem sobrepor temporalmente em algumas preparações, tornando a análise mais difícil. Se há uma ambiguidade entre se as respostas são pré-sináptica ou pós-sináptica, APV e CNQX podem ser adicionados ao banho para bloquear a transmissão de excitação, e todos os sinais remanescentes serão de origem pré-sináptica. </li><li> Protocolos de estimulação variar para produzir três tipos de experiência distintos: entrada / saída de curvas, gravações de pulsos pareados, e experimentos de longo prazo da plasticidade. Análise tipicamente consiste de medições comparando a inclinação da fEPSP transversalmente em ambos os ratinhos com lesões cerebrais e sham-Operado controles, controlando-se a força de entrada através da medição da rajada de fibra. </li></ol> 5. Gravação de patch-clamp visualizados <ol><li> Prepare fatias, eletrodos e sonda para gravar como já descrito acima até o passo 4.2. </li><li> Considerar apenas as células mais profundo do que 80 um no tecido como células mais próximas da superfície serão mortos e / ou de ter reduzido a conectividade. Aproximar de uma célula com uma pressão positiva sobre o eléctrodo para garantir que ele não fique entupido, uma vez que se move para baixo através do tecido. Quando o eléctrodo de toque suavemente a célula aplica pressão negativa com o fim de criar um &quot;gigaseal &#39;entre o eléctrodo e a membrana plasmática. </li><li> Aplicar rajadas curtas de pressão negativa com o fim de romper a membrana plama sob o eléctrodo e alcançar configuração de célula inteira. </li><li> Eliminar transientes de capacitância usando amplificador e compensar a resistência série. Compensar a resistência em série das células é essencial para assegurar umaccurate medições. </li><li> Dois modos de gravações de células individuais podem ser realizadas: grampo de corrente (voltagem da membrana de medição) e fixador de tensão (medição corrente que passa através de canais iónicos na membrana). Tipos possíveis de análise são numerosas, mas no nosso caso consistem principalmente de análise biofísica quantificar a taxa e tamanho das correntes sinápticas espontâneas em ambos os ratos com lesões cerebrais e controle-operados controles. </li></ol> 6. Tensão sensível Dye Imaging (VSD) <ol><li> Prepare fatias e equipamento para gravar como já descrito acima até o passo 4.2. </li><li> Preparar estoque corante misturando 1 mg de di-3-ANEPPDHQ em 50 ul de etanol; dispensar alíquotas de 2 ul em tubos de folha embrulhado, armazenam-se a -20 ° C. Tornar a solução de trabalho de corante diariamente, por diluição de 1:200 em aCSF. </li><li> Incubar a fatia em aCSF papel de filtro umedecido e manchar com 90 ul de corante por 16 min; enxaguar com ACSF e lugar na câmara de gravação interface. </li><li> Ajuste da luz stimulation intensidade até que a resposta está centrado no meio do alcance da câmera. As imagens são normalmente adquiridas a uma taxa de 500-1000 quadros por segundo. </li><li> Obturador disparador para a luz estimulação de 200 milissegundos antes de estimulação elétrica para permitir fotodegradação inicial rápida para se estabilizar. Ensaios de aquisição alternados entre electricamente estimulado e não-estimuladas electricamente, para permitir mais tarde a subtracção do fundo não estimulada. Registro intensidade de luz de repouso (leitura de fluorescência com o obturador fechado) antes da abertura do obturador. Cada ensaio será um VSD pixels x por Y pixels por &quot;filme&quot; tempo de leituras de fluorescência. Gravar 10-12 VSD ensaios em cada condição de teste. </li><li> Todas as medições são executadas no intra-pixel alteração pré-estímulo eléctrico normalizado de fluorescência, dF / F, que é calculada como se segue: Subtrair a intensidade de descanso luz do julgamento prima VSD adquirido. Para cada pixel em cada ensaio, de acordo com a normalizar o valor médio pré-estímulo eléctrico para quejulgamento, e subtraindo unidade. Faça isso para ambos os ensaios eletricamente estimuladas e não estimuladas eletricamente. Criar uma média &quot;fundo de fluorescência&quot; julgamento dos ensaios não-estimulado eletricamente, e subtrair este julgamento fundo dos ensaios eletricamente estimuladas. Uma análise adicional é tipicamente realizada na média de 10-12 tais ensaios, os quais são também normalmente filtrada no espaço e no tempo para melhorar a relação sinal-ruído. </li></ol> 7. Dissecções regionais para análises bioquímicas <ol><li> Remover o cérebro do rato, como descrito anteriormente. </li><li> Preparar fatias utilizando cortador de tecidos. </li><li> Lay parte plana, microdissect área CA1 e DG. </li><li> Imediatamente mergulhe em lise tampão contendo inibidor de protease. Congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 8. Resultados representativos As nossas experiências começam tipicamente com os dados de comportamento para confirmar a esperardéficits cognitivos ed que existem no cérebro lesado camundongos. Nós empregamos o teste de resposta contextual condicionado medo, pois é um comportamento dependente do hipocampo que é confiável e requer apenas uma sessão de treinamento e uma sessão de testes. Os dados representados na Figura 2 representa o teste comportamental para medir memória anterógrada, no entanto, o ensaio pode também ser usado para medir a memória retrógrada se a sessão de treino é executada antes da lesão. Campo potenciais pós-sinápticos excitatórios (fEPSPs) são medidos para determinar a eficácia sináptica líquida de uma grande população de células (Figura 3A). Nós geralmente empregam três tipos diferentes de padrões de estimulação, cada um dando seus próprios resultados e conclusões. Em primeiro lugar, através do aumento da intensidade de estimulação através de uma série de passos, criar uma curva de entrada / saída (Figura 3B / C). Em seguida, através da apresentação de dois estímulos de mesma intensidade separadod por um breve período de tempo (geralmente 50 ms) investigamos as possíveis alterações na probabilidade da vesícula sináptica libertação;. Além disso, muitas vezes executar potenciação de longa duração (LTP) experimentos. Depois de estabelecer uma resposta de linha de base, a estimulação de frequência breve elevada (normalmente de 100 Hz) com a mesma intensidade é entregue, causando uma cascata intracelular que leva a uma resposta potenciada quando a estimulação sináptica normal é retomada. Atividade elétrica da célula inteira patch-preso células podem ser gravados em dois modos. No modo de fixação da tensão, o experimentador controla a tensão da membrana da célula de patch-fixada em referência ao banho, por meio de software de computador associado ao amplificador. Neste caso, as correntes que medeiam eventos pós-sinápticos são gravadas, fornecendo informação sobre a frequência de libertação pré-sináptica, o número de receptores pós-sinápticos activados e da concentração do neurotransmissor vesicular (Figura 4A). No modo de grampo de corrente do experimentadormanipula injetado atual e mede a resposta de tensão. Isto pode ser útil para determinar as características do potencial de acção, tais como limiar do potencial de acção e de meia largura. Estas características permitem a categorização funcional dos neurónios como excitatório ou inibitório com base nos seus padrões de disparo de acção potenciais (Figura 4B). A fim de verificar a identidade celular recomendamos enchimento células com Lucifer Yellow depois da gravação e da identidade visualmente a confirmação da presença ou ausência de espinhas dendríticas. (Figura 4C, D). Um exemplo dos resultados de uma experiência utilizando corante sensível tensão para medir as variações de tensão de membrana está descrito na Figura 5. Neste caso, um eléctrodo de estimulação foi colocado na via colateral de Schaffer e a actividade neuronal, resultando na área CA1 é analisada. Corante sensível tensão não informa valores absolutos de tensão de membrana, mas sim tele mudar de tensão de um estado inicial, sem estimulação. No entanto, análises comparando duas condições (por exemplo, cérebro-ferido vs sham-operated) pode ser usado para determinar os parâmetros espaço-temporais de alterações fisiológicas que não podem ser medidos utilizando fEPSPs ou de células inteiras de gravação de patch-clamp. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de Circuito do hipocampo. Uma seção horizontal através do hipocampo. As principais vias através do hipocampo são mostrados a amarelo. Os axônios dos neurônios no córtex entorrinal projeto pela via perfurante no giro denteado formando sinapses com os dendritos de células granulares do giro denteado. De células granulares do projecto axónios através da via de fibras musgosas para CA3 onde formam sinapses com os dendritos de neurônios CA3. Os axônios dos neurônios CA3 projeto através da via colateral de Schaffer para o Dendrites de CA1 células piramidais. Os axônios de células piramidais CA1 projetar para fora do hipocampo através da subículo. Nota: Também são descritos CA3 colaterais celulares piramidais axônios projetam para o hipocampo contralateral através da fímbria. (CA1: Cornu Ammonis 1, CA2: Cornu Ammonis 2, CA3: Cornu Ammonis 3, DG: giro denteado, linha pontilhada indica camada de corpo celular, linha sólida indica limites estruturais.) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig2.jpg" /> Figura 2. Representante dados comportamentais A:. Dados comportamentais que descrevem a diferença nas taxas de congelamento entre cérebro lesado ratos (FPI) e controle-operados controles (sham) no paradigma condicionado medo resposta. Formação ocorreu no ferimento 6 º dia seguinte, com o período de teste de 24 horas que ocorre mais tarde. (** Denota p &lt;0,01.) <img alt="Figura 3" fo:content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4411/4411fig3highres.jpg&quot; src = &quot;files/ftp_upload/4411/4411fig3.jpg /&quot; /&gt; Figura 3. Dados representativos de gravação Extracelular A:. Um exemplo de um campo de potencial pós-sináptico excitatório (fEPSP) gravação na área CA1. A primeira deflexão descendente é o artefacto de estímulo, seguida pela rajada de fibras pré-sináptica e, finalmente, o fEPSP. B: entrada / saída das curvas representando uma diminuição da eficácia sináptica líquido em CA1 após lesão fluido percussão (FPI). C: entrada / saída das curvas representando um aumento de eficácia sináptica líquido no giro denteado (DG), após FPI. (* Indica p &lt;0,05). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4411/4411fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig4.jpg" /> Figura 4. Representante Whole-cell patch-clamp Dados A: Um exemplo espontânea.excitatório pós-sináptico corrente (sEPSC) a partir de uma célula de CA1 piramidal. B: Exemplos de trens de acção potenciais a partir de uma célula piramidal CA1 (traço superior) e uma rápida spiking CA1 interneurônio (traço inferior). C: Exemplo de uma Amarelo Lúcifer cheio CA1 interneurônio inibitória. Note a ausência de espinhas dendríticas (painel superior). D: Exemplo de Lucifer Yellow cheio CA1 neurônio piramidal. Observe a presença de espinhas dendríticas (painel superior). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4411/4411fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig5.jpg" /> Figura 5. Representante voltagem sensível dados de imagem Dye A:. Fatia Rato coronal hipocampo exibido para mostrar anatomia. (DG: giro denteado, CA1: Cornu Ammonis 1) B: Amarelo para pixels vermelhos representando atividade excitatória na área CA1 14 ms após a estimulação aferente garantia Schaffer. Vermelho emvão indica mais despolarização, enquanto o amarelo indica uma despolarização menor, mas ainda significativo. C: pixels azuis representam sítios de atividade inibitória na área CA1 56 ms após a estimulação aferente garantia Schaffer mesmo mostrado na B. azul mais escuro indica mais hiperpolarização.

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	<li>Faul, M., Xu, L., Wald, M. M., Coronado, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury+in+the+United+States:+Emergency+Department+Visits+Hospitalizations+and+Deaths+2002-2006.">Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits Hospitalizations and Deaths 2002-2006.</a> Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , (2010).</li><li>McAllister, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropsychiatric+sequelae+of+head+injuries.">Neuropsychiatric sequelae of head injuries.</a> Psychiatr. Clin. North Am. 15, 395-413 (1992).</li><li>Pierce, J. E., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enduring+cognitive,+neurobehavioral+and+histopathological+changes+persist+for+up+to+one+year+following+severe+experimental+brain+injury+in+rats.">Enduring cognitive, neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats.</a> NSC. 87, 359-369 (1998).</li><li>Dixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+percussion+model+of+experimental+brain+injury+in+the+rat.">A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat.</a> J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).</li><li>McIntosh, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+in+the+rat:+characterization+of+a+lateral+fluid-percussion+model.">Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model.</a> Neuroscience. 28, 233-244 (1989).</li><li>Carbonell, W. S., Grady, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+temporal+characterization+of+neuronal,+glial,+and+axonal+response+after+traumatic+brain+injury+in+the+mouse.">Regional and temporal characterization of neuronal, glial, and axonal response after traumatic brain injury in the mouse.</a> Acta Neuropathol. 98, 396-406 (1999).</li><li>Toth, Z., Hollrigel, G. S., Gorcs, T., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instantaneous+perturbation+of+dentate+interneuronal+networks+by+a+pressure+wave-transient+delivered+to+the+neocortex.">Instantaneous perturbation of dentate interneuronal networks by a pressure wave-transient delivered to the neocortex.</a> J. Neurosci. 17, 8106-8117 (1997).</li><li>D'Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R., Janigro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+hippocampal+long-term+potentiation,+but+not+depression,+following+fluid+percussion+injury.">Selective loss of hippocampal long-term potentiation, but not depression, following fluid percussion injury.</a> Brain Res. 786, 64-79 (1998).</li><li>Witgen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+hippocampal+alteration+associated+with+cognitive+deficit+following+experimental+brain+injury:+A+systems,+network+and+cellular+evaluation.">Regional hippocampal alteration associated with cognitive deficit following experimental brain injury: A systems, network and cellular evaluation.</a> Neuroscience. 133, 1-15 (2005).</li><li>Schwarzbach, E., Bonislawski, D. P., Xiong, G., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+the+inability+to+induce+area+CA1+LTP+in+the+mouse+after+traumatic+brain+injury.">Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury.</a> Hippocampus. 16, 541-550 (2006).</li><li>Cole, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+branched+chain+amino+acids+ameliorate+injury-induced+cognitive+impairment.">Dietary branched chain amino acids ameliorate injury-induced cognitive impairment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 366-371 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Cada técnica descrito acima contribui para a melhor compreensão do mecanismo subjacente causando o défice comportamental observada. Ao combinar a informação original obtida a partir de cada um dos métodos que são capazes de analisar os mecanismos biológicos com mais precisão. FEPSPs medição é útil para quantificar a eficácia sináptica líquida de grandes regiões espacialmente definidos de neurônios. Ele também pode fornecer informação sobre o potencial de um grupo de cél...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Axopatch 200B amplificador </td><td> Molecular Devices </td><td> AXOPATCH 200B </td><td> Patch-clamp plataforma </td></tr><tr><td> Digidata 1322A digitador </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Patch-clamp plataforma </td></tr><tr><td> MP-225 micromanipulador </td><td> Sutter </td><td> MP-225 </td><td> Patch-clamp plataforma </td></tr><tr><td> Microscópio DMLFSA </td><td> Leica </td><td></td><td> Patch-clamp plataforma </td></tr><tr><td> Multiclamp amplificador 700B </td><td> Molecular Devices </td><td> MULTICLAMP 700B </td><td> Multiuso (campo)equipamento </td></tr><tr><td> Digidata 1440 digitador </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Multipurpos (campo) rig </td></tr><tr><td> MPC-200 micromanipulador </td><td> Sutter </td><td> MPC-200 </td><td> Multiuso (campo) rig </td></tr><tr><td> Microscópio BX51WI </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td> Multiuso (campo) rig </td></tr><tr><td> Axoclamp amplificador 900A </td><td> Molecular Devices </td><td> AXOCLAMP 900A </td><td> VSD plataforma </td></tr><tr><td> Digidata 1322 digitador </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> VSD plataforma </td></tr><tr><td> Redshirt câmera CCD-SMQ </td><td> Redshirt </td><td> NCS01 </td><td> VSD plataforma </td></tr><tr><td> VT 1200S Vibratome </td><td> Leica </td> &lt;td&gt; 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> P-30 extrator Eletrodo </td><td> Sutter </td><td> P-30 / P </td><td></td></tr><tr><td> inibidor de protease completo </td><td> Roche </td><td> 11697498001 </td><td></td></tr></tbody></table>

investigations on alterations of hippocampal circuit function following mild traumatic brain injury

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) atinge mais de 1,7 milhões de pessoas nos Estados Unidos a cada ano e até TCE leve pode levar a prejuízos neurológicos persistentes 1. Dois sintomas difusos e incapacitante vividas por sobreviventes de TCE, déficits de memória e uma redução no limiar de convulsão, são pensados ​​para ser mediado pelo TCE induzida por disfunção do hipocampo 2,3. A fim de demonstrar como as alterações da função do hipocampo circuito afeta negativamente o comportamento após o TCE em camundongos, que empregam lesão percussão lateral do fluido, um modelo animal comumente usado do TCE que recria vários recursos do TCE humana, incluindo a perda de células neuronais, gliose e perturbação iônica 4 - 6. Aqui demonstramos um método combinatorial para investigar TBI induzida disfunção do hipocampo. A nossa abordagem incorpora técnicas ex vivo fisiológicos múltiplos em conjunto com o comportamento dos animais e a análise bioquímica, a fim de analisarpós-TCE alterações no hipocampo. Começamos com o paradigma experimental de lesão juntamente com a análise comportamental para avaliar a deficiência cognitiva após TCE. Em seguida, apresentam três diferentes técnicas ex vivo de gravação: gravação campo extracelular potencial, visualizado de células inteiras patch-fixação e gravação de corante tensão sensível. Finalmente, demonstramos um método para dissecar regionalmente sub-regiões do hipocampo que pode ser útil para uma análise detalhada de alterações neuroquímicas e metabólicos pós-TCE. Estes métodos têm sido usados ​​para avaliar as alterações no sistema de circuitos do hipocampo após TBI e para sondar as alterações opostas em função do circuito de rede que ocorrem no giro dentado e CA1 sub-regiões do hipocampo (ver Figura 1). A capacidade de analisar as mudanças pós-TCE, em cada sub-região é essencial para a compreensão dos mecanismos subjacentes que contribuem para o TCE induzida comportamental e cognitiva deficits. O sistema multi-facetado descrito aqui permite aos investigadores para empurrar passado caracterização da fenomenologia induzida por um estado de doença (neste caso TBI) e determinar os mecanismos responsáveis ​​pela patologia observada associada com TCE.

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Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Uma abordagem multi-facetada para investigar alterações funcionais para circuitos do hipocampo é explicado. Técnicas electrofisiológicas são descritos em conjunto com o protocolo de lesão, testes comportamentais e método de dissecação regional. A combinação destas técnicas pode ser aplicada de forma semelhante para outras regiões do cérebro e perguntas científicas.

Investigações sobre alterações da função Circuito Hippocampal Após lesão cerebral traumática leve

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

investigations-on-alterations-hippocampal-circuit-function-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K visualizações.  Children's Hospital of Philadelphia. Uma abordagem multi-facetada para investigar alterações funcionais para circuitos do hipocampo é explicado. Técnicas electrofisiológicas são descritos em conjunto com o protocolo de lesão, testes comportamentais e método de dissecação regional. A combinação destas técnicas pode ser aplicada de forma semelhante para outras regiões do cérebro e perguntas científicas.

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Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Neurociência

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also demonstrate that traumatic brain injuries cause changes to the gut microbiota. However, mechanisms underlying the bidirectional regulation of the brain-gut axis remain unknown. Currently, few models exist for studying the changes in gut microbiota after traumatic brain injury. Therefore, the presented study combines protocols for inducing traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device and analysis of caecum samples following injury for investigating alterations in the gut microbiome. Alterations of the gut microbiota composition after traumatic brain injury are determined using 16S-rDNA sequencing. This protocol provides an effective method for studying the relationships between enteric microorganisms and traumatic brain injury.

Presented here is a protocol to induce diffuse traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device followed by the collection of the caecum content for gut microbiome analysis.

Investigando alterações na microbiota de caecum após traumatismo cranioencefálico em camundongos

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.

Imagem latente avançada da difusão no Hippocampus dos ratos com ferimento de cérebro traumático suave

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of medical visits in the United States. There are currently no FDA-approved treatments available for TBI. The increased incidence of military-related, blast-induced TBI further accentuates the urgent need for effective TBI treatments. Therefore, new preclinical TBI animal models that recapitulate aspects of human blast-related TBI will greatly advance the research efforts into the neurobiological and pathophysiological processes underlying mild to moderate TBI as well as the development of novel therapeutic strategies for TBI.
Here we present a reliable, reproducible model for the investigation of the molecular, cellular, and behavioral effects of mild to moderate blast-induced TBI. We describe a step-by-step protocol for closed-head, blast-induced mild TBI in rodents using a bench-top setup consisting of a gas-driven shock tube equipped with piezoelectric pressure sensors to ensure consistent test conditions. The benefits of the setup that we have established are its relative low-cost, ease of installation, ease of use and high-throughput capacity. Further advantages of this non-invasive TBI model include the scalability of the blast peak overpressure and the generation of controlled reproducible outcomes. The reproducibility and relevance of this TBI model has been evaluated in a number of downstream applications, including neurobiological, neuropathological, neurophysiological and behavioral analyses, supporting the use of this model for the characterization of processes underlying the etiology of mild to moderate TBI.

We present here a protocol of a blast wave model for rodents to investigate neurobiological and pathophysiological effects of mild to moderate traumatic brain injury. We established a gas-driven, bench-top setup equipped with pressure sensors allowing for reliable and reproducible generation of blast-induced mild to moderate traumatic brain injury.

Modelo de onda de explosão de baixa intensidade para avaliação pré-clínica de lesão cerebral traumática leve de cabeça fechada em roedores

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

A Metric Test for Assessing Spatial Working Memory in Adult Rats Following Traumatic Brain Injury

Impairments to sensory, short-term, and long-term memory are common side effects after traumatic brain injury (TBI). Due to the ethical limitations of human studies, animal models provide suitable alternatives to test treatment methods, and to study the mechanisms and related complications of the condition. Experimental rodent models have historically been the most widely used due to their accessibility, low cost, reproducibility, and validated approaches. A metric test, which tests the ability to recall the placement of two objects at various distances and angles from one another, is a technique to study impairment in spatial working memory (SWM) after TBI. The significant advantages of metric tasks include the possibility of dynamic observation, low cost, reproducibility, relative ease of implementation, and low stress environment. Here, we present a metric test protocol to measure impairment of SWM in adult rats after TBI. This test provides a feasible way to evaluate physiology and pathophysiology of brain function more effectively.

Traumatic brain injury (TBI) is commonly associated with memory impairment. Here, we present a protocol to assess spatial working memory after TBI via a metric task. A metric test is a useful tool to study spatial working memory impairment after TBI.

Um teste métrico para avaliar a memória espacial de trabalho em ratos adultos após lesão cerebral traumática

Impairments to sensory, short-term, and long-term memory are common side effects after traumatic brain injury (TBI). Due to the ethical limitations of ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Modelo de Lesão Cerebral Traumática Leve em Camundongos com Controle Eletromagnético

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

Avaliação das Alterações na Plasticidade Sináptica Utilizando um Modelo de Traumatismo Cranioencefálico Leve

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Validando a resposta a lesões e avaliações comportamentais em um modelo de rato mTBI

Rat Model of Closed-Head Mild Traumatic Injury and its Validation

Animal models are crucial for advancing our understanding of mild traumatic brain injury (mTBI) and guiding clinical research. To achieve meaningful insights, developing a stable and reproducible animal model is essential. In this study, we report a detailed description of a closed-head mTBI model and a representative validation method using Sprague-Dawley rats to verify the modeling effect. The model involves dropping a 550 g mass weight from a height of 100 cm directly onto the head of a rat on a destructible surface, followed by a 180-degree turn. To assess the injury, rats underwent a series of neurobehavioral assessments 10 min post-injury, including time of loss of consciousness, first seeking-behavior time, escape ability, and beam balance ability test. During the acute and subacute stages following the injury, behavioral tests were conducted to assess motor coordination ability (Beam task), anxiety (Open Field test), and learning and memory abilities (Morris Water Maze test). The closed-head mTBI model produced a consistent injury response with minimal mortality and replicated real-life situations. The validation method effectively verified the model development and ensured the stability and consistency of the model.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de lesões cerebrais traumáticas - um modelo de cabeça fechada para replicação precisa e avaliação rápida 

Here, we present a closed-head mild traumatic brain injury (mTBI) rat model and its validation exhibiting remarkable similarity to human mTBI concerning behavioral manifestations during the acute and subacute stages.

Modelo de Lesão Traumática Leve de Cabeça Fechada em Rato e sua Validação

Animal models are crucial for advancing our understanding of mild traumatic brain injury (mTBI) and guiding clinical research. To achieve meaningful ...