Nosso protocolo demonstra um fluxo de trabalho pré-clínico abrangente para testar a eficácia terapêutica de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem após lesão cerebral. Este modelo de lesão cerebral traumática fornece um alto grau de versatilidade e reprodutibilidade, controlando firmemente os parâmetros da força mecânica e, portanto, proporcionando uma lesão bem definida. Esses procedimentos podem ser usados para estudar processos de lesão e recuperação em outras regiões cerebrais e o método de transplante é capaz de usar com muitos tipos de células.
A perfuração craniana é desafiadora, pois a técnica requer destreza manual para dominar a pressão, velocidade, profundidade e movimentos suaves apropriados. Documente todos os eventos e pratique extensivamente. Para realizar uma craniectomia unilateral, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo no mouse anestesiado e fixe o mouse em um quadro estereotaxic.
Aplique pomada oftalmica antibiótico aos olhos com um cotonete estéril e solução à base de iodo na área do couro cabeludo raspado. Retire o iodo com 70% de etanol e cubra o animal com uma cortina cirúrgica fenestrada. Faça uma incisão média de 1,5 a 2 centímetros no couro cabeludo e use cotonetes estéreis para limpar a ferida e limpar a fáscia deixada da linha média em bregma.
Use uma sonda impactante para identificar o local da craniectomia e definir o x é igual a zero, y é igual a ponto de referência estereotaxic zero a bregma. Ajuste a sonda lateralmente para dois milímetros à esquerda da linha média. Use um marcador cirurgicamente seguro de ponta fina para marcar um círculo de cinco milímetros de diâmetro ao redor da área de impacto presunçoso.
Levante e gire o impactor fora de posição e complete o círculo de cinco milímetros. Retorne brevemente o impactor em posição para verificar a precisão do círculo de cinco milímetros. Em seguida, levante e gire o impactador fora de posição e use uma ferramenta manual de micro motor rotativo de alta velocidade equipada com uma broca de rebarba redonda de 0,6 ou 0,8 milímetros para fazer um orifício aberto no crânio a uma velocidade máxima de 70 a 80%.
Aplique pressão leve no crânio enquanto perfura ao longo do contorno circunferencial de cinco milímetros dentro desta borda e use fórceps para levantar a aba óssea resultante. Perfurar através de linhas de sutura pode apresentar dificuldade adicional, pois o osso é interrompido e requer pressão adicional. Os vasos sanguíneos podem estar em estreita associação e, portanto, eventos de sangramento são prováveis.
Para induzir uma leve lesão de impacto cortical controlada, limpe a sonda impactante com uma almofada de preparação de álcool estéril e mova a sonda impactor de volta à posição sobre o córtex exposto. Abaixe a sonda até que toque a superfície dura mater e marque esta posição como z é igual a zero. Retire o pistão e mova-se para z é igual a menos um milímetro e descarreça o pistão para impactar o córtex.
Levante imediatamente o pistão e mova o braço para fora da posição e irrigar o córtex com um volume generoso de soro fisiológico e use simples pontos interrompidos e sutura de seda 5-0 para fechar a incisão do couro cabeludo. Em seguida, entregue 10 miligramas por quilograma de Ciclosporina A por injeção subcutânea no escroto e coloque o mouse em uma gaiola pós-operatória limpa pré-aquecida com monitoramento até a recuperação completa. Cerca de 24 horas após a craniectomia, coloque o mouse de volta no quadro estereotaxico.
Cubra o mouse com a cortina cirúrgica fenestrada. Lavar o local de incisão com soro fisiológico estéril para limpar o local e soltar as suturas. Use um cotonete de algodão 70% encharcado de etanol para esterilizar suavemente o local da incisão e use pinças finas e tesouras oftálmicas para remover as suturas.
Em seguida, irrigar o local da cirurgia e craniectomia com soro fisiológico abundante estéril. Em uma cultura celular, a biossegurança, gire suavemente ou toque no tubo das células para garantir uma suspensão celular homogênea. Use uma micropipette para carregar aproximadamente 7,5 microliters de células em uma seringa Hamilton através da extremidade do êmbolo.
Segurando a seringa em um ângulo de 120 graus com a extremidade do êmbolo voltada para baixo, insira o êmbolo tomando cuidado para não introduzir uma bolha de ar entre a suspensão e a ponta do êmbolo. Coloque o conjunto da junta na agulha da pipeta e coloque a agulha na seringa. Empurre o êmbolo para mover a suspensão da célula para a agulha pipeta e conecte a seringa à bomba de seringa estereotíxica.
Avance o êmbolo para ter certeza de que o conjunto da bomba de seringa está funcionando corretamente e mova a agulha para as coordenadas para injeção. Alinhe a ponta da agulha para bregma e coloque as coordenadas x e y a zero. Mova a ponta da agulha sobre a craniectomia para dois milímetros laterais e menos um milímetro posterior para bregma e toque a ponta da agulha para a superfície dura mater.
Levante a agulha ligeiramente e faça uma pequena incisão na dura-se mater no local onde a agulha fez contato. Defina a coordenada estereotaxic para z é igual a zero e empurre o êmbolo para confirmar que a suspensão celular está fluindo adequadamente antes de introduzir a agulha no cérebro. Introduzir a agulha no cérebro a uma profundidade de z é igual a menos 1,4 milímetros para colocar o enxerto na borda de matéria cinzenta/matéria branca do córtex profundo.
Inicie a bomba de seringa para infundir a suspensão da célula durante um período de 15 minutos. Use um microscópio de longa distância de trabalho para monitorar o fluxo de suspensão celular irrigando o local da cirurgia com soro fisiológico estéril durante a injeção para manter a hidratação tecidual. Quando todas as células tiverem sido entregues, retire lentamente a agulha de transplante e irrigar o local da cirurgia com soro fisiológico adicional antes de fechar a incisão com novas suturas.
Em seguida, prestar cuidados pós-operatórios como demonstrado. Para um teste de remoção de fita adesiva, primeiro use uma pequena faca de barbear para cortar pedaços amarelos e vermelhos de fita elétrica em tiras de três por cinco milímetros em uma superfície de vidro lisa. Leve os ratos para a sala de testes de comportamento por pelo menos 30 minutos antes do teste e use um pano de manuseio para conter o rato pelo pescoço e costas para que o mouse mantenha as previs longe de seu corpo e cabeça.
Use pinças para colocar uma tira adesiva na superfície plantar de cada prentosse e use uma pressão delicada e consistente dos dedos para fixar as tiras nas patas. Coloque rapidamente o mouse em um cilindro de plástico e inicie dois cronômetros quando o mouse tiver todas as quatro patas na caixa de teste de plástico. Em seguida, use os dois cronômetros para registrar as latências para aviso da pata esquerda, remoção da pata esquerda, aviso da pata direita e remoção da pata direita.
Neste experimento piloto, a função forelimb foi comparada apenas na craniectomia, lesão de impacto cortical controlada e camundongos ingênuos. Camundongos submetidos à cirurgia apresentaram latências transitórias aumentadas para notar estímulos adesivos por um a três dias imediatamente após a cirurgia e déficits pós-operatórios transitórios na remoção adesiva da previsão ipsilateral. Camundongos que sofreram impacto cortical controlado, no entanto, apresentaram déficits significativos no desempenho motor no contralateral previsto para a lesão em comparação com ratos ingênuos fora do dia 28 pós-operatório.
A imunossuagem de seções cerebrais de camundongos para antígenos nucleares humanos revela que enxertos de células humanas podem ser claramente distinguidos dos tecidos hospedeiros na lesão sham e cérebros de impacto cortical controlados. Você deve observar procedimentos padrão de segurança laboratorial ao manusear células humanas cultivadas e ao manusear agulhas de seringa que entram em contato com roedores ou drogas imunossupressores. As seções de tecido cerebral podem ser analisadas para a expressão de marcadores neuroinflamatórios, pois é valioso saber como o enxerto afeta a resposta da lesão tecidual hospedeira e vice-versa.
Ficamos surpresos ao encontrar diferenças sexuais sutis nos resultados do comportamento pós-lesão. Estamos investigando se o sexo desempenha um papel na resposta neuroimune à lesão cerebral. Mãos firmes, paciência e prática são cruciais para desenvolver uma boa técnica de craniectomia.
Danos colaterais de uma craniectomia imprópria podem comprometer a área que você quer atingir para transplante celular.
