Este protocolo fornece um método rápido e econômico para a passagem livre de enzimas de células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em células alimentadoras. A vantagem desse protocolo é que ele não requer meios de cultura e substratos de crescimento livres de alimentadores dispendiosos, evita o risco de dissociação completa por enzimas e diminui o risco de transição de células-tronco para um estado primed. Quem demonstrará o procedimento será Hege Brincker Fjerdingstad, gerente diário da instalação central norueguesa de células-tronco pluripotentes humanas.
Para iniciar a semente 0,5 por 10 elevou à potência 6 fibroblastos humanos, doravante denominados células alimentadoras, em um frasco de cultura T 75 com 20 mililitros de IMDM contendo 10% de SFB, doravante denominado meio de célula alimentadora. Quando as células alimentadoras atingirem 90% de confluência, remova o meio e lave as células três vezes com 10 mililitros de DPBS para evitar a inibição da tripsina por fatores no meio. Adicionar dois mililitros de EDTA de tripsina ao balão e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante cerca de cinco minutos, observando o descolamento das células alimentadoras a olho nu.
Uma vez que o desprendimento começa, continue a observar a dissociação das células sob um microscópio para garantir que todos os agregados sejam dissociados em células únicas. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de célula alimentador fresco e pré-aquecido ao balão para inativar o EDTA de tripsina e suspender suavemente as células alimentadoras por pipetagem. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros, depois tampe o tubo e centrifuja a 200 G por 5 minutos.
Remova cuidadosamente o estado sem perturbar o pellet e ressuspenda-o em quatro mililitros de meio de célula alimentador fresco. Depois de garantir que as células alimentadoras sejam completamente ressuspensas, conte-as usando uma câmara de contagem de células e calcule o número de células necessárias para cultivar as CTHs e PSCs HI em placas de cultura de tecidos de 35 milímetros. Em seguida, para realizar a parada mitótica por irradiação gama, transfira o número apropriado de células alimentadoras para um tubo centrífugo de 50 mililitros e adicione o meio celular alimentador a um volume total de cinco mililitros.
Transporte imediato à temperatura ambiente para uma máquina de irradiação gama e irradiar para deter as células mitoticamente. Uma vez que as células alimentadoras são mitoticamente presas sob uma capa de cultura de tecidos, ressuspenda as células no meio celular alimentador para obter uma concentração celular de 1,5 por 10 elevada à potência de 5 por mililitro. Adicione 2 mililitros da suspensão da célula de alimentação a um prato de 35 milímetros e transfira o prato para 37 graus Celsius e incubadora de dióxido de carbono a 5%.
Para uma distribuição uniforme das células, mova o prato lentamente, mas com firmeza, na prateleira da incubadora para frente e para trás. Em seguida, pause e execute a mesma ação da esquerda para a direita antes de fechar a porta da incubadora. Após 24 horas, substituir o meio alimentador por IMDM contendo 10% de reposição sérica.
A partir da placa de cultura contendo células alimentadoras mitoticamente presas, substituir o IMDM contendo 10% de meio de reposição sérica por 1,2 mililitros de meio HESC pré-aquecido contendo fator de crescimento básico de fibroblastos ou BFGF, 30 minutos antes da transferência das colônias. Em seguida, remova o meio de uma placa de cultura contendo HSCs ou HI PSCs e lave as colônias com um mililitro de DPBS, para remover células não anexadas e restos celulares. Adicione um mililitro de EDTA 0,5 milimolar e incube por um minuto a 37 graus Celsius.
Em seguida, usando uma pipeta de mililitros, substitua a solução de EDTA por um mililitro de meio HESC contendo BFGF. Triturar suavemente com a mesma pipeta para liberar as colônias da camada de células alimentadoras até que a camada se solte e se dobre sobre si mesma em um aglomerado separado. Empurre a camada de células alimentadoras para a borda do poço de cultura com uma ponta de pipeta.
Usando uma nova pipeta de um mililitro, transferir as colônias suspensas para uma nova placa de cultura com células alimentadoras e meio HESC contendo BFGF, dividindo-se na proporção de um para cinco. Transfira o prato para uma incubadora e mova-o suavemente de um lado para o outro para facilitar a distribuição uniforme das colônias. As colônias HESC colhidas com EDTA foram mais homogêneas em tamanho e forma do que aquelas colhidas mecanicamente.
A densidade celular nas colônias colhidas e replaqueadas foi semelhante para a colheita baseada em EDTA e colheita mecânica. As colônias colhidas mecanicamente tiveram maior tendência a desenvolver necrose em suas regiões centrais, enquanto as colônias colhidas com EDTA exibiram uma aparência translúcida com bordas distintas. A análise por QPCR mostrou uma expressão estável do marcador de caule no RNAm para as colônias obtidas após 20 passagens usando colheita mecânica ou baseada em EDTA.
Observações semelhantes foram feitas com a coloração imunoquímica em níveis de proteína para as colônias obtidas após 20 passagens usando colheita mecânica ou baseada em EDTA. Os corpos embrionários gerados a partir das CTHs obtidas após 20 passagens por ambos os métodos continham uma mistura de células expressando marcadores comumente avaliados para ectoderma, mesoderma e endoderma. Além disso, a análise genética baseada em QPCR de aberrações genômicas comuns exibiu um desvio modesto de um padrão cromossômico diploide de referência.
É importante limitar a exposição ao EDTA a um minuto. A exposição mais longa pode levar a muita dissociação. Também é importante puxar bem a camada de células alimentadoras para o lado para que não seja no caminho ao transferir as células-tronco embrionárias humanas ou células-tronco pluripotentes induzidas humanas para um novo prato de cultura.
A transição para a cultura e as condições livres de ração onde o EDTA é comumente usado para patógenos é simples e não mudamos a forma como as células são tratadas.
