Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são suportados por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos a membros do Centro de Medicina Regenerativa Broad e Investigação em Células Estaminais na Universidade da Califórnia, especialmente Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, e membros do Instituto Broad Stem UCLA Facility núcleo celular para o seu apoio de nossos estudos.

HESCs divisão de Matrigel para Matrigel Normalmente, uma placa de 6 bem-confluentes de hESCs em Matrigel pode ser dividida 01:03 - 01:05 para outra placa Matrigel, com os poços se tornar confluentes novamente 4-5 dias após a divisão. <ol><li> CM e placas Matrigel estão preparados como descrito acima antes de se separarem. </li><li> No dia da separação, lavar cada cavidade para dividir com 1 × PBS, pH7.4, adicionar 1 ml de 1mg/ml Dispase (solução diluída de ações 5mg/ml com DMEM/F12 media) a cada poço e incube a 37 ° C por 3 min. </li><li> Lavar cada cavidade três vezes com 1 × PBS, pH7.4, adicionar 1 ml de ES mídia sem bFGF, use um raspador de células para raspar as colônias fora do fundo do poço, recolher o hESCs suspensas em um tubo falcon 50ml, e pellet por centrifugação a 200g por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Para re-placa do hESCs em placas Matrigel, primeiro lavar as placas com Matrigel DMEM/F12 e adicionar 2,5 ml de CM suplementado com 10ng/ml bFGF por poço. Ressuspender o sedimento em CTEh um volume adequado de CM suplementado com 10ng/ml bFGF, pipetar a suspensão célula para cima e para baixo três vezes. (NOTA: Quando hESCs para dividir vêm de placas Matrigel, as touceiras são muito fáceis de quebrar, por isso três rodadas de pipetagem é suficiente e mais de pipetagem pode perturbar o over-colônias e fazer uma única célula.) Alíquota 0,5 ml de suspensão CTEh aglomerados por poço da placa Matrigel 6-bem para conseguir 3ml por poço como um volume final. Coloque a placa em um 37 ° C incubadora. </li></ol> Detecção de marcadores pluripotência por microscopia de imunofluorescência Microscopia de imunofluorescência é usado para examinar a expressão de marcadores de pluripotência CTEh Oct-4 e SSEA-4 durante o cultivo. <ol><li> Aspirar media de um bem e lave com 1 × PBS, pH 7.4. Adicionar 2 ml de formaldeído 3,7% para o bem de correção para 10 min. </li><li> Enxágüe com 1xPBS, pH 7,4, adicionar 2 ml de metanol para o bem e coloque a -20 ° C por 2 min. </li><li> Enxágüe com 1xPBS, pH 7,4, e bloquear com 1ml de 0,2% serume albumina bovina (BSA) por 5 min. </li><li> Adicionar 1 ml de Oct-4 ou anti-h/mSSEA-4 anticorpos (diluição de 1:200 em 0,2% BSA), e incubar em temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite. (NOTA: para SSEA-4 coloração, vá diretamente para a etapa 6) </li><li> Enxaguar três vezes com 1xPBS, pH 7,4, acrescentar FITC-conjugado IgG de coelho (1:500 diluição em 0,2% BSA), e incubar em temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Lave 3 vezes com 1xPBS, pH 7,4, e colocar uma gota de solução de montagem (pode conter DAPI se visualização nuclear é desejado) no centro do poço. Coloque lamela em cima das células, selo com unha polonês, e avaliar por microscopia de imunofluorescência. </li></ol> Humana recibos células-tronco embrionárias ES mídia (media células-tronco embrionárias): DMEM/F12 - 400ml Knockout Serum Replacer - 100ml Não-essenciais Aminoácidos - 5ml 200mM Solução Glutamax / BME - 5ml Penicilina / estreptomicina - 5ml Misture bem e guarde Meios de Cultura finais CTEh em garrafas de 500ml a 4 ° C. Bom para um máximo de duas semanas. Cultura MEF Media: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Não-essenciais Aminoácidos - 10ml Glutamina - 10ml Penicllin Estreptomicina / - 10ml Misture bem e guarde Meios de Cultura finais MEF a 4 ° C. Solução Glutamax / BME 200mM: Glutamax - 100ml β-mercaptoetanol (solução stock de 14,3) - 140 μ1 Misture duas soluções bem e, em seguida, porções de 10ml alíquota. Manter alíquotas a -20 ° C. bFGF Solution (concentração final de estoque: 10 microgramas / ml): bFGF (FGF2) - 50 mg BSA 0,1% em 1xPBS, pH 7,4 - 5ml Dissolver 50 microgramas bFGF em BSA 0,1% 5ml para fazer um estoque mcg / ml 10. Alíquota em porções de 500 mL. Armazenar a -80 ° C. Colagenase IV Solução (1mg/ml): Colagenase IV - 50mg DMEM/F12 Media - 50ml Adicione o colagenase IV pó para um tubo falcon 50ml. Na capa, mix em 50ml de estéril DMEM/F12 mídia. Solução para o Vortex &lt;1 min. para se certificar de que o pó esteja dissolvido. No capô, passam por um filtro de 0,22 mM em um novo tubo estéril falcon 50ml. Esta solução é boa para um máximo de duas semanas armazenadas a 4 ° C. Dispase Solution (1mg/ml): Dispase 5mg/ml - 2ml Mídia DMEM/F12 - 8ml Alíquota de solução de 5mg/ml Dispase comerciais e armazenar a -20 ° C. Diluir dispase a 1mg/ml usando DMEM/F12. Esta solução pode ser mantida por uma semana a 4 ° C.

<ol>
	<li>Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19."> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li></ol>

Esta série de três vídeos demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em fibroblastos de rato células embrionárias (MEF) alimentador (vídeo 1), como passagem para os Matrigel livre de células alimentador de placas (vídeo 2), e como manter a hESCs por passaging em Matrigel alimentação livre de células condições (vídeo 3). Numerosos estudos anteriores mostraram que a manutenção de viabilidade, hESCs indiferenciado requer a cultura em células alimentadoras inativado MEF. No entanto, para muitas exp...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> Non-essential Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMax </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11995-065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Clontech</td>
<td>631107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BME</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP176-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>17104-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>17105-041</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Chemicon</td>
<td>ES-006-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrigel</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354277</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct-4 antibody</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>SC-9081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>FAB1435P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITCI-conjugated antirabbit IgG</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.</td>
<td>715-095-152</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

from mefs to matrigel 3: passaging hescs from matrigel onto matrigel

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada.

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From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 3 de 3.

De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

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Biology

13.7K visualizações.  University of California, Los Angeles. Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 3 de 3.